A melanin koncentráló hormon morfológiai meghatározása humán, rágcsáló és

madár agyban

Bencze János1, Murnyák Balázs1, Deák-Pocsai Krisztina1, Nagy Katalin1, Nagy Vanda1, Németh József2,

Czeglédi Levente3, Juhász Béla2, Szilvássy Zoltán2, Hortobágyi Tibor1

1 Debreceni Egyetem, Pathologiai Intézet, Neuropathologiai Tanszék, Debrecen

2 Debreceni Egyetem, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet, Debrecen

3 Debreceni Egyetem, Állattudományi, Biotechnológiai és Természetvédelmi Intézet, Debrecen

Absztrakt

A táplálékfelvétel központi idegrendszeri szabályozása humorális faktorok és idegi impulzusok által

történik. A humorális rendszer meghatározó eleme a melanin koncentráló hormon (MCH). A MCH

receptorok (MCHR) két típusa ismert, az MCHR1 nagyfokú homológiát mutat gerincesekben, míg az

MCHR2 funkcionális formáját számos emlősállat nem expresszálja. Az MCH rendszert befolyásolni

képes molekulák a humán gyógyászat és az agrárágazat számára egyaránt előnyös lehet. A gyógyszerek

szervezetre kifejtett hatásának, megbízhatóságának teszteléséhez, elengedhetetlen az MCH és MCHR1

morfológiai meghatározása különböző fajokban. Az általunk standardizált immunhisztokémiai,

immunfluoreszcens és autoradigráfiás módszerek jól használhatók a hormon és receptorának

lokalizálására, szemi-kvantitatív azonosítására. A morfológiai tesztek segíthetik új és biztonságos

hatóanyagok kifejlesztését az elhízás, illetve a depresszió kezelésében.

Bevezetés

A táplálékfelvétel és energiaháztartás szabályozása komplex folyamat, amelyben a perifériáról (pl.

emésztőrendszer, zsírszövet felől) érkező humorális (testfolyadékok elsősorban a vér által közvetített)

faktorok, valamint autonóm idegrendszeri impulzusok az agy meghatározott területein integrálódnak.

Ezen információkat a hypothalamus és agytörzsi központok feldolgozzák és döntenek fokozni vagy

éppen csökkenteni kell a táplálékbevitel mértékét. Ugyanakkor a rendszer komplexitását jellemzi, hogy

„magasabb rendű” neocorticális, subcorticális és limbikus szabályozás is megvalósul (1. ábra), ezzel

magyarázható, hogy hangulatunk képes befolyásolni éhségérzetünket 1.

1. ábra: A táplálékfelvétel központi idegrendszeri szabályozásában résztvevő területek (Humán

agyfélteke középvonali nézet; A jelöletlen sematikus ábra forrása: commons.wikimedia.org)

Melanin koncentráló hormon (MCH) és receptorai

Az MCH egy 19 aminosavból álló fehérje, amit Kawauchi és mtsai. izoláltak és karakterizáltak elsőként

lazac agyalapi mirigyből, ahol a melanocyták melanin aggregációjának fokozásával szabályozza a halak

bőrszínét 2. Később számos emlősállat agyában kimutatták jelenlétét, itt azonban a bőr

pigmentációjának meghatározásában nincs bizonyított szerepe. Számos, elsősorban rágcsálókon

végzett, tanulmány igazolta az MCH szerepét a táplálékelvétel és energia homeosztázis, emócionális

állapot, stressz-válasz és alvás-ébrenlét ciklus szabályozásában 3. Patkányok agyában a hormont

kifejező idegsejtek, legnagyobb mennyiségben a lateralis hypothalamus és a zona incerta területén

találhatóak4. A hypothalamus lateralis magcsoportja az elsődleges orexigén (táplálék felvételt

indukáló) központ, ami széleskörű projekciót az ad idegrendszer számos területére. Az agytörzsi

afferentáció útján, a X. agyideg közvetítésével befolyásolja az emésztőrendszer működését5, továbbá

kis mennyiségben a gyomor-bélrendszeren belül is detektálható MCH, ami alátámasztja az

emésztésben betöltött szerepét, ugyanakkor kimutatható jelenléte a hereszövetben is, feltételezve

hogy a reproduktív folyamatok szabályozásában is részt vesz6.

Ahhoz, hogy az hormon funkcióját el tudja látni szükség van olyan speciális a sejtmembránban

elhelyezkedő struktúrákra úgynevezett receptorokra, amik a ligand megkötése esetén intracelluláris

változások láncolatát indítják be. Az MCH első receptorát (MCHR1) 1999-ben azonosították 7 2001-ben

karakterizálták a második receptort (MCHR2), ami meglepő módon csupán 38%-os azonosságot

mutatot a MCHR1-el 8. A fajok közötti megoszlásban is jelentős eltérések tapasztalhatók, míg MCHR1

az emlősök nagy részében kifejeződik, addig az MCHR2 funkcionális formája számos élőlényből

hiányzik (pl. egér patkány) 9.

Kísérletes adatok bizonyítják az MCH és receptorának esszenciális szerepét a táplálékfelvétel

szabályozásában. Éhezés hatására az MCH mRNS szintje emelkedik rágcsálókban, ezzel összhangban

az oldalkamrába közvetlenül adott hormon infúzió evést indukál 10. Transzgenikus egerekben lehetőség

van egyes géneket „kiütni,” annak érdekében ,hogy vizsgálni tudjuk milyen funkcionális

következményekkel jár ez a módosítás, ami felhasználható egyes öröklődő betegségek

tanulmányozására. Az MCH túlzott mértékű kifejeződése elhízást eredményez 11 Azok a transzgenikus

úgynevezett „knoc-out (KO)” egerek, amelyekben MCH hiányzott hipofágiásak (csökkent

táplálékfelvétel) és soványak voltak 12 Az MCHR1-KO egerek testtömege a normál tartományon belül

mozgott, ugyanakkor soványnak imponáltak és a teljes testzsír mennyiségé csökkent., habár a receptor

hiányában hiperfágia (fokozott táplálékfelvétel) alakult ki, a társuló hiperaktivitás és fokozott

metabolizmus következtében ez nem járt elhízással13.

Neuropatológia vizsgálatok

Az MCH nemcsak a táplálékfelvétel szabályozásában, hanem a limbikus rendszerbe adott projekciói

révén a különböző hangulati zavarok (pl. szorongás, depresszió) befolyásolásában is esszenciális

szerepet tölt be. Az MCHR1 receptort gátolni képes (antagonista) molekulák fejlesztése ígéretes

terápiás módszerek lehetnek a világszerte hatalmas problémát jelentő elhízás és depresszió

kezelésében5, ugyanakkor, az agrárágazatban a rendszer aktivitásának fokozása, ezzel együtt a

gazdasági állatok testtömegének növelése a kívánatos cél. Ha sikerül olyan alapanyagokat

azonosítanunk amiket a táphoz keverve az állatok saját (endogén) MCH hormon szintjét képesek

megemelni, az teoretikusan magasabb hozamot eredményezhet és kiválthatja a jelenleg alkalmazott

gazdaságilag és/vagy etikailag megkérdőjelezhető módszereket.

Annak érdekében, hogy a különböző hatóanyagok MCH rendszerre kifejtette hatását tanulmányozni

tudjuk és meggyőződjünk annak biztonságosságáról, elengedhetetlenek a morfológia vizsgálatok,

amivel azonosítjuk a hormon és receptorának lokalizációját, szemi-kvantitatív képet kaphatunk az

expresszió mértékéről és nyomon követhetjük a változásokat az adott táppal nem etetett, kontrol

állatokhoz képest. Tudományos szempontból egyetlen vizsgálati eljárás nem elegendő, azt meg kell

erősíteni több különböző patológiai technikán alapuló módszerrel

Kutatócsoportunk a projekt keretén belül a korábbi tapasztalatok alapján 14–16 három módszert (1.

Kromogénes immunhisztokémia (IHC); 2. Receptor autoradiográfia; 3. Immunfluoreszcens

immunhisztokémia (IF)) standardizált az MCH és MCHR1 morfológiai azonosítására, amely

felhasználható humán, patkány és baromfi minták vizsgálatára.

A minták előkészítése során formalinos fixálást és parafinba ágyazást, valamint folyékony nitrogénben

(-195 °C) fagyasztást egyaránt alkalmaztunk. Előző esetben 7 µm-es még utóbbi esetben 20 µm-es

metszetek készültek.

1. Immunhisztokémia

A módszer alapja a mintában keresett

antigén elleni immunreakcióval. Az

elsődleges antitest megjelöli az antigént,

majd egy erre az antitestre spiecifikus

biotinált másodlagos antitestet

alkalmazunk. A biotint megköti az avidint és

a reakciónak megfelelő enzimet tartalmazó

polimer. A színtelen szubsztrátot az enzim

hasítja, ami színes csapadékot ad – a

többlépéses reakció lényege a jelerősítés (2.

ábra).

A kereskedelemben kapható antitestek közül kiválasztottuk az általunk vizsgált fajokra

legspecifikusabbat. Bioinformatikai analízis során az NCBI (National Center for Biotechnology

Information) adatbázisból letöltött hat élőlény (ember, nyúl, patkány egér, kacsa, liba) szekvenciáinak

összehasonlítása megerősítette, hogy a az MCH jelölésére alkalmazott immunhisztokémiai antitest

által felismert fehérjeszekvencia nagymértékben konzervatív a vizsgált élőlényekben17 (3. ábra). Ezen

eredmények alapján az emlős mintákon kívül az antitest jól használható a vizsgálni kívánt szárnyas

állatokban is. A szekvencia illesztések mellett az MCH fehérje alapján elkészítettük az előlények

törzsfáját is (4. ábra). A várakozásoknak megfelelően, az emlősök MCH aminosavsorrendje nagyobb

mértékű eltérést mutat a madarakban expresszálódó fehérjéhez képest.

Másodlagos antitest

Szubsztrát (kromogén)

Színes csapadék

Enzim

Polimer

Avidin

Biotin

Elsődleges antitest

Antigén

Minta

2. ábra: Az immunhisztokémiai reakció felépítése

3. ábra: A melanin koncentráló hormon (MCH) fehérje aminosav-szekvenciájának fajok közötti

összehasonlítása. Sárgával emeltük ki az MCH fehérje azon szakaszát, melyet a kiválasztott antitest

felismer. Az ábrán csak azoknak az aminosavaknak a kódját tüntettük fel, amelyek eltérést mutattak

a vizsgált élőlényekben. A ponttal jelölt aminosavak identikusak mind a hat fajban.

4. ábra: Az MCH fehérje aminosavsorrendje által meghatározott filogenetikai fa

A mintákon való tájékozódás érdekében a patkány hypothalamust Paxinos-féle 18 anatómiai atlasz

segítségével hematoxylin festett metszeteken lokalizáltuk (5. ábra).

5. ábra. Patkány lateralis hypothalamus (LH) elhelyezkedése, coronális síkú metszeten. Festés

hematoxylin

A kiválasztott MCH és MCHR1 antitestekkel külön végeztük egyszeres jelölést, valamint a kolokalizáció

meghatározása érdekében kettős jelölést is. Utóbbi esetben a két antigén vizualizálásra eltérő színű

szubsztrátot használtunk. Az általunk kidolgozott protokoll megbízhatóságát igazolja hogy MCH (6.

ábra) és MCHR1 (7. ábra) antitest tekintetében erős immunpozitivitás tapasztalható patkány

hypothalamusban. A kettős jelölés, más kutatócsoportok adatait alátámasztva, a hormon és

receptorának nagy fokú megoszlásbeli átfedését mutatta 19 (7.D.ábra). Hasonló eredményeket adott a

libából származó minták vizsgálata. A szakirodalommal összhangban humán mintákon erős pozitivitás

tapasztalható hypothalamus, a híd és a nyúltvelő régióiban 20.

6. ábra: Formalin fixált paraffinba ágyazott patkány agyból származó minták anti-MCH antitesttel

jelölve barna csapadékot adó 3,3'-diaminobenzidine (DAB) reakcióval vizualizálva; kék hematoxylin

magfestés. Kis nagyítással (A panel - 40x) erőteljes immunpozitivitás jelenik meg a hypothalamus

területén. Nagyobb nagyítással (B panel - 100x és C panel – 400x) megfigyelhető, hogy a reakció a

citoplazmára lokalizálódik.

7. ábra: Formalin fixált paraffinba ágyazott patkány agyból származó minták anti-MCHR1 antitesttel

jelölve barna csapadékot adó 3,3'-diaminobenzidine (DAB) reakcióval vizualizálva; kék hematoxylin

magfestés. Kis (A panel - 40x) és közepes (B panel - 100x) nagyítással erős immunopozitivitás jelenik

meg a hypothalamus területén. Nagyobb nagyítással és (C panel – 400x) megfigyelhető, hogy a

reakció a sejtmembránra lokalizálódik. Anti-MCH (barna színreakció - DAB) és anti-MCHR (piros

színreakció - VIP®) kettős jelölés; metilzöld magfestés (D panel). A két immunpozitivitás igen

nagymértékben átfed egymással.

2. Receptor autoradiográfia

Az autoradiográfiás képalkotás alapja a radioaktív izotópokkal jelölt, a vizsgálni kívánt receptorhoz

specifikusan kötődő ligandok alkalmazása. A patkány agyból készített metszeteken végzett

autoradiográfiás ligand-receptor vizsgálatok lehetővé teszik a receptorok eloszlásának és relatív

koncentrációjának meghatározását fiziológiás és patológiás állapotokban 21. A technika segítségével a

receptorrendszerek elemezhetők egészséges és kórós körülmények között, illetve a radioligand

viselkedése is tanulmányozható. Az autoradiográfiát más módszerekkel kombinálva (pl

immunhisztokémia) összetett vizsgálatok is végezhetők. A MCHR specifikus ligandot a humán

orvoslásban is használt rövid felezési idejű 68Gallium18Fluor β-sugárzó izotópokkal jelöltük. A mintához

kötődött radioligand lokalizálása sugár érzékeny fotoemulziós réteg (film) segítségével történik. A

rendszer érzékenységét jelzi, hogy az immunhisztokémiai módszerre nehezen vizualizálható zona

incerta területe is egyértelmű pozitivitást mutat (8 ábra).

8. ábra: Patkány agyból készült coronális síkú metszeteken, 68Ga radioizotóppal jelölt Melanin

koncentráló hormon receptor (MCHR) specifikus liganddal végzett autoradiográfia, a sötétebb

területek jelzik a pozitív reakciót. A kék nyíl a plexus chorioideust, a narancssárga nyíl a zona

incerta területét, a zöld nyíl pedig a hypothalamus pozitivitását mutatja.

3. Immunfluoreszcencia (IF)

A kromogénes, illetve a fluoreszcens immunhisztokémia között alapvető különbség a reakció

vizualizálásában van. A másodlagos antitestek ebben az esetben speciális fény kibocsátására képes

molekulával úgynevezett fluorofórral van jelölve (9. ábra). A molekula fényérzékeny, így a

labormunka és a metszetek kiértékelése egyaránt sötétben történik. A reakciót fluoreszcens

mikroszkóppal tudjuk vizsgálni. Figyelembe véve, hogy a gerjesztéshez szükséges hullámhosszú fény

eltér az emittált fény hullámhosszától az eszköz olyan szűrőkkel van felszerelve, ami lehetővé teszi

a fény-spektrum különböző tartományainak átengedését, illetve blokkolás

Konklúzió

A MCH rendszer működés kiemelt jelentőségű a táplálékfelvétel szabályozása és a kedélyállapotunk

meghatározása szempontjából. Az MCHR-t szelektíven befolyásolni képes hatóanyagok

fejlesztésére irányuló gyógyszeripari kutatások megoldást jelenthetnek olyan népbetegségek, mint

az elhízás és depresszió kezelésébe, ugyanakkor az orexigén hatás előnyős lehet az agrárágazat

számára; az MCH hatását fokozó anyagok azonosítása és a haszonállatok ilyen módon történő

táplálása a jelenleginél gazdaságosabban érhetnénk el magasabb hozamot. A potenciális vegyületek

élő szervezetre kifejtett hatásának és biztonságosságának tesztelésére elengedhetetlenek az

általunk használt morfológia vizsgálatok elvégzése.

9. ábra: Az immunfluoreszcens immunhisztokémiai reakció felépítése

Másodlagos antitest

Fluorofór

Elsődleges antitest

Antigén

Minta

Köszönetnyilvánítás

A munka az AGR_PIAC_13-1-2013-0008 támogatásával valósult meg

Irodalomjegyzék

1. Blundell J, Halford J, King N, et al. The Regulation of Food Intake in Humans. Endotext.

2000;(1).

2. Kawauchi H, Kawazoe I, Tsubokawa M, et al. Characterization of melanin-concentrating

hormone in chum salmon pituitaries. Nature. 305(5932):321-323.

3. Verret L, Goutagny R, Fort P, et al. A role of melanin-concentrating hormone producing

neurons in the central regulation of paradoxical sleep. BMC Neurosci. 2003;4(1):19.

4. Bittencourt JC, Presse F, Arias C, et al. The melanin-concentrating hormone system of the rat

brain: An immuno- and hybridization histochemical characterization. J Comp Neurol.

1992;319(2):218-245.

5. Hervieu G. Melanin-concentrating hormone functions in the nervous system: food intake and

stress. Expert Opin Ther Targets. 2003;7(October):495-511.

6. Viale A, Zhixing Y, Breton C, et al. The melanin-concentrating hormone gene in human:

flanking region analysis, fine chromosome mapping, and tissue-specific expression. Mol Brain

Res. 1997;46(1-2):243-255.

7. Bächner D, Kreienkamp H, Weise C, et al. Identification of melanin concentrating hormone

(MCH) as the natural ligand for the orphan somatostatin-like receptor 1 (SLC-1). FEBS Lett.

1999;457(3):522-524.

8. Hill J, Duckworth M, Murdock P, et al. Molecular Cloning and Functional Characterization of

MCH 2 , a Novel Human MCH Receptor. J Biol Chem. 2001;276(23):20125-20129.

9. Tan CP, Sano H, Iwaasa H, et al. Melanin-concentrating hormone receptor subtypes 1 and 2:

species-specific gene expression. Genomics. 2002;79(6):785-792.

10. Qu D, Ludwig DS, Gammeltoft S, et al. A role for melanin-concentrating hormone in the

central regulation of feeding behaviour. Nature. 1996;380(6571):243-247.

11. Ludwig DS, Tritos NA, Mastaitis JW, et al. Melanin-concentrating hormone overexpression in

transgenic mice leads to obesity and insulin resistance. J Clin Invest. 2001;107(3):379-386.

12. Shimada M, Tritos NA, Lowell BB, et al. Mice lacking melanin-concentrating hormone are

hypophagic and lean. Nature. 1998;396(December):670-674.

13. Marsh DJ, Weingarth DT, Novi DE, et al. Melanin-concentrating hormone 1 receptor-deficient

mice are lean, hyperactive, and hyperphagic and have altered metabolism. Proc Natl Acad Sci

U S A. 2002;99(5):3240-3245.

14. Csonka T, Murnyák B, Hortobágyi T, et al. Assessment of candidate immunohistochemical

prognostic markers of meningioma recurrence. Folia Neuropathol. 2016;54(2):114-126.

15. Csonka T, Murnyák B, Hortobágyi T, et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1) and p53

labelling index correlates with tumour grade in meningiomas. Folia Neuropathol.

2014;52(2):111-120.

16. Szepesi R, Csokonay Ákos, Hortobágyi T, et al. Haemorrhagic transformation in ischaemic

stroke is more frequent than clinically suspected - A neuropathological study. J Neurol Sci.

2016;368:4-10.

17. Saito Y, Nagasaki H. The Melanin-Concentrating Hormone System and Its Physiological

Functions. In: Orphan G Protein-Coupled Receptors and Novel Neuropeptides. Vol 46. Berlin,

Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2008:159-179.

18. Paxinos G, Watson CR. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Elsevier; 2007.

19. Luthin DR. Anti-obesity effects of small molecule melanin-concentrating hormone receptor1

(MCHR1) antagonists. Life Sci. 2007;81(6):423-440.

20. Bittencourt JC. Anatomical organization of the melanin-concentrating hormone peptide family

in the mammalian brain. Gen Comp Endocrinol. 2011;172(2):185-197.

21. Philippe C, Haeusler D, Fuchshuber F, et al. Comparative autoradiographic in vitro

investigation of melanin concentrating hormone receptor 1 ligands in the central nervous

system. Eur J Pharmacol. 2014;735:177-183.