A expressão de Timp1 associada à desmetilação de seu...
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TATIANA IERVOLINO RICCA
A expresso de Timp1 associada desmetilao de seu
promotor confere resistncia ao anoikis durante a
transformao maligna de melancitos murinos
Tese apresentada Universidade
Federal de So Paulo para obteno
do ttulo de Doutor em Cincias.
So Paulo 2008
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Livros Grtis
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Milhares de livros grtis para download.
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TATIANA IERVOLINO RICCA
A expresso de Timp1 associada desmetilao de seu
promotor confere resistncia ao anoikis durante a
transformao maligna de melancitos murinos
Tese preparada durante o Programa de Ps-
Graduao em Microbiologia e Imunologia do
Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia (DMIP), na Disciplina de Imunologia e
apresentada Universidade Federal de So Paulo
Escola Paulista de Medicina, como requisito parcial
para obteno do ttulo de Doutor em Cincias.
Orientadora: Profa. Dra. Miriam Galvonas Jasiulionis
So Paulo 2008
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FICHA CATALOGRFICA
RICCA, Tatiana Iervolino
A expresso de Timp-1 associada desmetilao de seu promotor confere resistncia ao anoikis durante a transformao maligna de melancitos murinos. Tatiana Iervolino Ricca So Paulo, 2008.
xvii, 203f
Tese (Doutorado) Universidade Federal de So Paulo, Escola Paulista de Medicina. Programa de Ps-graduao em Microbiologia e Imunologia.
Ttulo em ingls. Timp-1 expression associated with promoter
demethylation confers anoikis resistance along murine melanocyte malignant transformation.
1. Inibidor de metaloprotease 1 (Timp1). 2. Resistncia ao anoikis. 3. Metilao de DNA. 4. Transformao maligna. 5. Melanoma
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA
Chefe de Departamento: Prof. Dr. Jos Daniel Lopes
Coordenador do Curso de Ps-Graduao: Prof. Dr. Renato Arruda Mortara
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Este trabalho foi desenvolvido na Disciplina de Imunologia do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina, com auxlios financeiros concedidos pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) e Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES).
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Aos meus pais, Artur e Valquria, pelo amor
e apoio incondicionais, e pelo exemplo de vida
que me guiou at aqui, obrigada. Amo vocs.
Ao meu irmo mais querido, Gustavo, pelo
apoio constante, dedicao, pacincia e amor,
obrigada.
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Profa. Dra. Miriam Galvonas Jasiulionis
pela orientao, apoio, pacincia e
perseverana, expresso minha profunda
gratido por sua inabalvel determinao e
pelos ensinamentos que enriqueceram minha
formao profissional, obrigada.
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Ao Prof. Dr. Jos Daniel Lopes pelos
valiosos ensinamentos, por sua
disponibilidade e auxlio indispensveis para
a realizao deste trabalho.
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AGRADECIMENTOS
So inmeras as pessoas a quem desejo agradecer pelo apoio e carinho que me
dedicaram durante a realizao deste trabalho. Agradeo:
Aos Professores Doutores da Disciplina de Imunologia, Mario Mariano, Joel
Machado Jnior, Ieda Maria Longo Maugri, Clia Regina Whitaker Carneiro e Zulma
Peixinho, pelo apoio cientfico, sugestes e crticas no decorrer do trabalho.
Dra. Maringela Corra pelo apoio, sensatez, crticas e sugestes valiosas que
foram muito importantes para a execuo deste trabalho.
amiga de todas as horas Fabiana Aliperti que sempre esteve ao meu lado,
trazendo equilbrio em horas difceis, alegria nos momentos de tristeza e muita
pacincia durante todo o meu trajeto. Obrigada pela amizade incondicional, pela
lealdade e por estar aqui sempre quando precisei.
amiga Amanda G. S. Silva pela maravilhosa convivncia, amizade e apoio
constante. Obrigada pelo auxlio tcnico e pelas ricas discusses cientficas que foram
essenciais em muitos momentos do meu trabalho.
queridona amiga Ana Paula Mitsue Suenaga pelo apoio, pacincia,
generosidade, ajuda, principalmente na hora de realizar os ensaios in vivo feitos neste
trabalho, e por sua amizade. A sua presena tornou esse caminho mais fcil.
grande amiga Dra Flvia Vigna pelo seu companheirismo infinito, amizade,
apoio e confiana. A minha gratido no cabe em palavras, mas posso dizer que a
diverso ao seu lado est sempre garantida.
s minhas queridas amigas Adriana Konno, Aline Morgado e Fabiana Toshie pela
presena constante, apoio, pacincia e amizade. Certamente sem vocs no teria sido
to divertido.
Ao meu namorado Aldo de Paula Jnior pelo carinho, sensatez, equilbrio, apoio e
amor dados no final deste importante caminho da minha vida. Obrigada por tudo.
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Ao Dr. Rubens Bollos pela amizade, carinho e ensinamentos da vida
Ao amigo Andr Bachi pela lealdade, ajuda nos experimentos, amizade e apoio
ao longo deste difcil caminho. Obrigada por fazer parte da turminha!!!
Ao amigo Leandro S. L. Nunes que trouxe um pouco de testosterona para o
laboratrio, mostrando como tudo mais fcil quando somos prticos. Obrigada
tambm pela amizade, apoio e momentos de alegria.
s meninas do laboratrio, Adriana Taveira da Cruz, Karina Santiago, Alice S.
Moraes, Mariana Toricelli, Camila Souza, Letcia Abigail, Viviane C. Cordaro, Paula
Sola, Fabiana Melo, pela agradvel convivncia, generosidade e incentivo constante.
Aos demais colegas ps-graduandos da Disciplina de Imunologia e da Disciplina
de Microbiologia pelo carinho, apoio e amizade.
Aos Professores e funcionrios do Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia pelo auxlio.
Aos funcionrios da Disciplina de Imunologia Aparecido Mendes, Geov dos
Santos, Zlia Pereira, Creusa Marina, Ivone Mozat Eraldina do Nascimento, Gislia
Lopes e Creuza Rosa pelo carinho e constante ajuda.
s instituies de fomento CAPES e FAPESP pelo auxilio financeiro.
todos aqueles que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste
trabalho.
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NDICE
INTRODUO......................................................................................................... 1
1. Melanoma............................................................................................................. 2. Resistncia ao anoikis e transformao maligna................................................. 3. Timp1....................................................................................................................
3.1 Timp e cncer.................................................................................................3.2 Aspectos gerais de Timp1.............................................................................. 3.3 Timp1 como molcula multifuncional.............................................................
3.3.1 Regulao da proliferao celular......................................................... 3.3.2 Regulao da angiognese...................................................................3.3.3 Regulao da apoptose........................................................................
3.4 Timp1 e eventos epigenticos........................................................................4. Metilao de DNA e cncer.................................................................................. 5. Modelo de transformao neoplsica...................................................................
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OBJETIVOS............................................................................................................. 31
1. Objetivo geral....................................................................................................... 2. Objetivos especficos............................................................................................
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MATERIAL............................................................................................................... 32
1. Comit de tica e Pesquisa................................................................................. 2. Animais................................................................................................................. 3. Anticorpos.............................................................................................................4. Drogas e reagentes.............................................................................................. 5. Enzimas................................................................................................................ 6. Linhagens Celulares............................................................................................. 7. Oligonucleotdeos................................................................................................. 8. Programas............................................................................................................
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MTODOS............................................................................................................... 37
1. Meios de Cultura.................................................................................................. 1.1 Preparao dos meios de cultura...................................................................1.2 Meios para cultivo de bactrias...................................................................... 1.3 Meios para cultivo e manuteno de clulas de mamferos..........................
2. Cultivo e manuteno dos estoques celulares de mamferos.............................. 2.1 Cultivo celular em suspenso........................................................................ 2.2 Cultivo celular em soft-agar............................................................................
3. Desenho dos oligonucleotdeos........................................................................... 4. Extrao de RNA total.......................................................................................... 5. Sntese da primeira fita de DNA complementar (cDNA) Transcrio reversa
e reao de polimerase em cadeia (RT-PCR)..................................................... 6. RT-PCR semiquantitativo..................................................................................... 7. Western Blot............................................................. ........................................... 8. Imunofluorescncia indireta..................................................................................9. Extrao de DNA genmico................................................................................. 10. Tratamento de tecido murino com Liberase....................................................... 11. Tratamento das clulas melan-a com agente desmetilante............................... 12. Tratamento do DNA genmico com bissulfito de sdio......................................13. Desulfonao do DNA tratado com bissulfito de sdio...................................... 14. Methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).. 15. Construo do plasmdeo de expresso............................................................ 16. Preparao de bactrias competentes............................................................... 17. Transformao de bactrias competentes por CaCl2.............................................................18. Mini-preparao para extrao de DNA plasmidial (MiniPrep)......................... 19. Seleo dos clones pcDNA3.1-T1S................................................................... 20. Confirmao da seqncia dos clones selecionados por seqenciamento
de DNA............................................................................................................... 21. Maxi-preparao para extrao de DNA plasmidial (MaxiPrep) ...................... 22. Purificao plasmidial por coluna de gradiente de Csio (CsCl2) ..................... 23. Tranfeco de DNA plasmidial com lipossomos em clulas de camundongo.. 24. Ensaio de proliferao celular in vitro.................................................................25. Ensaio de ciclo celular...................................................................................... 26. Tumorignese in vivo......................................................................................... 27. Ensaio de metstase experimental....................................................................
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28. Zimograma......................................................................................................... 29. Imunohistoqumica............................................................................................. 30. Ensaio de migrao celular in vitro.....................................................................31. Ensaio de invaso celular in vitro....................................................................... 32. Ensaio de imunoprecipitao............................................................................. 33. Anlise Estatstica..............................................................................................
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RESULTADOS......................................................................................................... 68
1. Transformao maligna associada com resistncia ao anoikis........................... 1.1 Morfologia das linhagens ao longo da transformao maligna 1.2 Anlise da proliferao celular in vitro e tumorigenicidade in vivo das
linhagens celulares derivadas das clulas melan-a....................................... 1.3 Anlise da resistncia ao anoikis ao longo da transformao maligna
dos melancitos............................................................................................. 2. Padro de expresso de Timp1 ao longo da transformao maligna..................
2.1 Anlise da atividade de Mmps reguladas por Timp1 ao longo da transformao maligna dos melancitos..................................
3. Expresso de Timp1 regulada por mecanismos epigenticos............................. 3.1 Expresso do RNA mensageiro de Timp1 em clulas melan-a aps
tratamento com agente desmetilante...............................................................3.2 Presena de dinucleotdeos CpG na seqncia genmica do gene Timp1...3.3 Nvel da metilao de DNA no gene Timp1.
4. Papel da expresso de Timp1 nos melancitos e em clulas de melanoma...............................................................................................................
4.1 Expresso do RNA mensageiro de Timp1 em clulas melan-a e Tm5 aps transfeco com plasmdeo de expresso para Timp1.........................
4.2 Superexpresso de Timp1 no influencia na proliferao celular... 4.3 A superexpresso de Timp1 causa resistncia ao anoikis em
melancitos e em clulas de melanoma cultivados por 96 horas em suspenso......................................................................................................
4.4 A superexpresso de Timp1 causa resistncia ao anoikis em melancitos melan-a cultivados em soft-agar................................................
4.5 A superexpresso de Timp1 causada pelo tratamento com agente desmetilante 5-Aza-CdR no resulta na resistncia ao anoikis em melancitos melan-a.....................
4.6 A superexpresso de Timp1 em melancitos melan-a no capaz de induzir crescimento tumoral in vivo...
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4.7 A superexpresso de Timp1 aumenta a migrao in vitro de clulas de melanoma....... ..............................
4.8 A superexpresso de Timp1 em clulas de melanoma no resulta em fentipo mais invasivo in vitro........
4.9 Possvel participao de Timp1 na sinalizao celular..................................
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DISCUSSO............................................................................................................ 106
REFERNCIAS........................................................................................................ 116
ABSTRACT
APNDICE
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Modelo de progresso do melanoma proposto por Clark......................... Figura 2. Principais passos na formao da metstase........................................... Figura 3. Estrutura primria da protena TIMP1....................................................... Figura 4. Mapa esquemtico de genes que flanqueiam TIMP1............................... Figura 5. Mecanismo de metilao de DNA............................................................. Figura 6. Metilao de DNA e cncer.......................................................................Figura 7. Modelo de transformao maligna de melancitos associado resistncia ao anoikis........................................................................... Figura 8. Produto de RT-PCR gerado a partir de cDNA enriquecido para o gene Timp1................................................................................ Figura 9. Esquema de seleo dos clones de Timp1 senso e anti-senso............... Figura 10. Morfologia dos melancitos melan-a e das linhagens obtidas aps ciclos seqenciais de bloqueio de ancoragem......................................................... Figura 11. Proliferao celular in vitro...................................................................... Figura 12: Tumorigenicidade in vivo das linhagens derivadas de clulas melan-a..Figura 13: Linhagens estabelecidas aps submeter melancitos a ciclos seqenciais de bloqueio de ancoragem so mais resistentes ao anoikis que a linhagem parental melan-a....................................................................................... Figura 14. Cluster de genes associados ao cncer de Mus Musculus.................... Figura 15. Aumento da expresso do RNA mensageiro de Timp1 durante a transformao maligna dos melancitos melan-a.................................................... Figura 16. Anlise da expresso da protena Timp1 durante a transformao maligna dos melancitos melan-a............................................................................ Figura 17. Anlise da atividade das metaloproteases 2 e 9 durante a transformao maligna dos melancitos melan-a.................................................... Figura 18. O tratamento com agente desmetilante induz a expresso de Timp1 em melancitos melan-a.......................................................................................... Figura 19. Representao esquemtica da localizao dos stios CpG no promotor e primeiro exon de Timp1......................................................................... Figura 20. A desmetilao do promotor e primeiro exon de Timp1 est correlacionada com sua expresso nos melancitos melan-a................................. Figura 21. A desmetilao progressiva do promotor e primeiro exon de Timp1 est correlacionada com sua expresso durante a transformao neoplsica dos melancitos melan-a............................................... Figura 22. Superexpresso de Timp1 em melancitos melan-a e em clulas de melanoma Tm5..............................................................................
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Figura 23. A superexpresso de Timp1 no afeta a proliferao das linhagens melan-a e Tm5.................................................................................. Figura 24. Clulas melan-a superexpressando Timp1 tornam-se resistentes ao anoikis...................................................................................................................... Figura 25. Clulas melan-a expressando Timp1 so capazes de formar colnias em soft-agar como a linhagem de melanoma Tm5................... Figura 26. Clulas melan-a tratadas com agente desmetilante no se tornam resistentes ao anoikis....................................................................... Figura 27. Ensaio de tumorigenicidade in vivo de melancitos melan-a superexpressando Timp1......................................................................................... Figura 28. Ensaio de tumorigenicidade in vivo de clulas de melanoma Tm5 superexpressando Timp1......................................................................................... Figura 29. Metstase experimental in vivo de clulas de melanoma Tm5 superexpressando Timp1......................................................................................... Figura 30. Ensaio de migrao celular in vitro dos melancitos melan-a e de clulas de melanoma Tm5 superexpressando Timp1.............................................. Figura 31. Ensaio de invaso celular in vitro dos melancitos melan-a e de clulas de melanoma Tm5 superexpressando Timp1.............................................. Figura 32. A protena Timp1 est associada com 1 integrinas..............................
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LISTA DE ABREVIATURAS
g micrograma
L microlitro
M micromolar
1C linhagem obtida aps submeter cluals melan-a um ciclo de
bloqueio da adeso ao substrato.
2C linhagem obtida aps submeter cluals 1C um ciclo de
bloqueio da adeso ao substrato.
3C linhagem obtida aps submeter cluals 2C um ciclo de
bloqueio da adeso ao substrato.
4C linhagem obtida aps submeter cluals 3C um ciclo de
bloqueio da adeso ao substrato.
4C3, 4C11, Tm1 e Tm5 diferentes linhagens de melanoma obtidas a partir da
diluio limitante de esferides formados aps submeter a
linhagem 4C a um ciclo de bloqueio da adeso ao substrato.
ATP adenosina-trifosfato
bp pares de base
BSA soro albumina bovina
cDNA DNA complementar
dinucleotdeo CpG nucleotdeo citosina precedido de uma guanina
DNA cido desoxirribonucleico
DNMT DNA metiltransferase
DTT ditiotreitol
EDTA cido etilenodiamino tetractico
FACS Fluorescence Activeted Cell Sorting
GST gene suppressor de tumor
Ig Imunoglobulina
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IL interleucina
ilha CpG regio rica em dinucleotdeos CpG
Kb quilo base
kDa quilo Dalton
MB membrana basal
MBD methyl binding protein
MEC matrix extracelular
mg miligrama
mL mililitro
mM milimolar
MMP metaloprotease de matriz
nM nanomolar
pb pares de base
PBS Tampo salino fosfato
PCR Reao em cadeia da polimerase
PMA ster de forbol-miristato
RGP melanoma primrio de fase de crescimento radial
RNA cido ribonuclico
rpm rotao por minuto
SDS dodecil sulfato de sdio
SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
Timp inibidor de metaloprotease de matriz
v/v volume a volume
VGP melanoma primrio de fase de crescimento vertical
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RESUMO
Embora a resistncia ao anoikis seja considerada um importante processo
envolvido no fentipo maligno, a relao causal entre transformao neoplsica e
crescimento independente de ancoragem continua indefinida. Para estudar essa
correlao, foi desenvolvido em nosso laboratrio um modelo experimental de
transformao maligna de melancitos murinos, em que melancitos melan-a foram
submetidos a ciclos seqenciais de bloqueio de ancoragem. Ao longo deste processo,
foram estabelecidas tanto linhagens celulares correspondendo a fases intermedirias
da progresso tumoral como linhagens de melanoma, as quais so progressivamente
resistentes ao anoikis e representam fases distintas da progresso tumoral. Anlises de
expresso gnica mostraram aumento da expresso de Timp1 nas linhagens de
melanoma quando comparadas linhagem parental de melancitos. Ainda que descrita
como inibidora de MMPs, essa protena foi recentemente associada resistncia ao
anoikis em clulas epiteliais de mama humana. Deste modo foram analisadas neste
trabalho: 1) a relao entre expresso de Timp1 e aquisio do fentipo resistente ao
anoikis e 2) a possvel regulao epigentica da expresso de Timp1 por metilao de
DNA neste modelo. Enquanto clulas melan-a expressam baixos nveis de Timp1,
todas as linhagens derivadas desta expressam nveis elevados desta protena. O
tratamento dos melancitos melan-a com o agente desmetilante 5-aza-2-deoxicitidina
resultou em aumento significativo da expresso de Timp1. De fato, a anlise pelo
ensaio Methylation sensitive-Single Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE) mostrou
aumento progressivo na desmetilao do gene Timp1 em paralelo a sua crescente
expresso ao longo da transformao maligna. A superexpresso de Timp1 em clulas
melan-a resultou no aumento da sobrevivncia das mesmas em condies
independentes de ancoragem, mas foi incapaz de transform-las. Alm disso, o tempo
de latncia para o aparecimento de tumores foi menor para clulas de melanoma
transfectadas com Timp1, indicando que esta molcula pode estar associada com a
agressividade do tumor. Esses resultados mostram aumento da expresso de Timp1
durante a transformao maligna, em decorrncia da desmetilao gnica progressiva,
associado ao aumento da resistncia ao anoikis, mas no aquisio de um fentipo
maligno transformado.
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INTRODUO
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Introduo
1. Melanoma
Em 2005 o cncer foi responsvel por 13% das mortes ocorridas no mundo,
sendo que mais de 70% destas ocorreram em pases de mdia ou baixa renda (WHO,
2006). No ano passado, foram estimados 59.940 novos casos de melanoma nos
Estados Unidos, com uma expectativa de 8.110 mortes (American Cancer Society,
2007). Estima-se que em 2008 dentre todos os tipos de cncer o de pele ser o mais
incidente na populao brasileira com 120.930 casos novos, dos quais 4,9% sero de
melanoma (INCA, 2007). Mesmo sendo o tipo de cncer de pele mais raro, o
melanoma responsvel pela maioria das mortes (aproximadamente 80%)
relacionadas ao cncer de pele (Lewis et al., 2005; Medic et al., 2007), sendo que
apenas 14% dos pacientes com melanoma metasttico sobrevivem por cinco anos
(American Cancer Society, 2003).
A maioria dos pacientes diagnosticados com melanoma primrio curada aps
exciso cirrgica do tumor (Miller & Mihm, 2006). Porm, em estdios avanados
raramente tratvel por no responder s formas de terapia utilizadas atualmente e
por isso apresenta prognstico ruim com taxa de sobrevida mdia de seis meses
(Wascher et al., 2003; Miller & Mihm, 2006). Diferente da maioria, o melanoma no est
associado idade, sendo um dos tipos de cncer mais comuns e letais entre pessoas
na faixa dos 20 a 35 anos. Por afligir jovens e adultos na meia idade, o impacto
socioeconmico e psicolgico enorme, pois h perda de produtividade destes
indivduos causada pela patologia (Houghton & Polsky, 2002; Tsao et al., 2004).
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do melanoma so histrico
familiar, mltiplos nevos (benignos ou atpicos) e ocorrncia de melanoma prvio.
Fatores de risco adicionais incluem sensibilidade ao sol, exposio solar excessiva e
doenas imunossupressoras. Cada um desses fatores corresponde a uma
predisposio gentica ou um estressor ambiental que contribuiro para a gnese do
melanoma (Miller & Mihm, 2006). Alis, o melanoma visto como um dos melhores
exemplos de como gentica e meio ambiente interagem na patogenicidade do tumor
(Houghton & Polsky, 2002), j que sua incidncia influenciada pela cor da pele e
parmetros geogrficos como altitude e latitude (Armstrong & Kricker, 2001).
1
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Introduo
A exposio radiao ultravioleta o nico fator de risco relacionado ao meio
ambiente conhecido em melanoma e o aumento dramtico na incidncia de
melanomas nos ltimos 50 anos pode ser associado em parte s mudanas de hbitos
em relao ao sol (Tsao et al., 2004), j que ocorre mais frequentemente em locais do
corpo que so expostos radiao solar. Alm disso, o melanoma
predominantemente uma doena de populaes de pele clara e sua incidncia de 5 a
20 vezes menor nas populaes de pele escura. Dentro da populao caucasiana, a
incidncia influenciada pela proximidade ao Equador, sugerindo uma associao
desta doena com a exposio solar. Nos Estados Unidos esta relao bem evidente,
j que a incidncia do melanoma de duas a trs vezes maior nos estados do Sul
quando comparada aos estados do Norte (American Cancer Society, 2007). Por outro
lado, dados epidemiolgicos sugerem que exposies crnicas ou de baixo grau luz
ultravioleta induzem proteo contra danos ao DNA, enquanto que exposies intensas
e intermitentes com freqentes queimaduras causam danos genticos (Gilchrest et al.,
1999).
O melanoma se origina a partir dos melancitos epidermais ou a partir de clulas
precursoras de melancitos. Melancitos so clulas produtoras do pigmento melanina,
derivadas da crista neural, que migram para a pele durante o desenvolvimento e esto
normalmente confinadas sobre a membrana basal da epiderme num padro no
randmico (Bennett, 1993; Hsu et al., 2002). Por meio de prolongamentos dendrticos,
os melancitos interagem com queratincitos que se encontram na camada basal e
superficial da pele (Miller & Mihm, 2006). Cada melancito transfere melanossomos
contendo pigmentos por estes prolongamentos para aproximadamente 36
queratincitos basais e suprabasais, formando a unidade de melanina epidermal. Uma
vez nos queratincitos, o pigmento protege a pele da absoro de radiao solar
nociva. Os queratincitos so considerados parceiros celulares dominantes dos
melancitos na epiderme e so capazes de controlar a proliferao, grau de
prolongamento dendrtico (morfologia) e quantidade de melanina contida nos
melancitos, por estabelecerem contato direto por meio de receptores de adeso
clula-clula, como a E-caderina (Meier et al., 1998; Hsu et al., 2002).
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Introduo
Baseado em caractersticas clnicas e histopatolgicas, cinco fases da progresso
do melanoma foram propostas (Clark et al., 1984; Meier, 1998): clusters de melancitos
normais (nevo comum), nevo displsico, melanoma primrio de fase de crescimento
radial (RGP), melanoma primrio de crescimento vertical (VGP), e melanoma
metasttico (Figura 1).
A progresso de um melancito para um nevo comum e no acompanha
mudanas genticas. O nevo comum tem tempo de vida finito e geralmente no
carrega anormalidades citogenticas (Mancianti et al., 1993). Meier e colaboradores
(1998) acreditam que essa progresso ocorra pela perda de controle do
comportamento dos melancitos pelos queratincitos, mediada pelo contato normal
clula-clula. Realmente, alteraes na expresso de molculas de adeso celular
como caderinas, integrinas e protenas da superfamlia das imunoglobulinas so
importantes para o crescimento e a metstase do melanoma (McGary et al., 2002). A
diminuio dos nveis de E-caderina parece ser responsvel pela reduo da interao
entre melancitos e queratincitos (Hsu et al., 1996; Li et al., 2001). De modo inverso, o
aumento nos nveis de N-caderina pode permitir que clulas de melanoma interajam
com fibroblastos presentes no estroma (Smalley ecol., 2005), o que pode facilitar sua
sobrevivncia fora da epiderme (Hsu et al., 2002; Haass et al., 2005).
Mudanas genticas acompanham o desenvolvimento de nevos displsicos que
apresentam citologia e arquitetura atpicas, e so considerados precursores do
melanoma (Kraemer & Greene, 1985). Estas clulas podem surgir a partir de um nevo
comum preexistente ou como novas leses (Miller & Mihm, 2006).
O aparecimento do melanoma primrio RGP gradual e espontneo, e pode no
requerer mudanas moleculares adicionais. Estas clulas so capazes de se espalhar
horizontalmente na epiderme e na parte superior da derme, mas so raramente
metastticas (Houghton & Polsky, 2002) e por isso esto associados a um bom
prognstico (Gaglioli & Sahai, 2007).
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Introduo
Figura 1. Modelo de progresso do melanoma proposto por Clark. Os melanomas so classificados histologicamente de acordo com sua locao e estgio da progresso. Cinco estgios foram propostos
na evoluo do melanoma com base nesses critrios histolgicos: nevo adquirido e congnito comum
sem mudanas displsicas; nevo displsico com estrutura e arquitetura atpicas; melanoma primrio de
fase de crescimento radial (RGP), melanoma primrio de crescimento vertical (VGP), e melanoma
metasttico (Clark et al., 1984). Figura modificada de Miller & Mihm, 2006.
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Introduo
Invaso local e metastatizao so processos responsveis pela morbidade e
mortalidade associadas ao melanoma. O aparecimento de caractersticas invasivas
ocorre na fase de crescimento vertical (VGP), quando clulas de melanoma so
capazes de penetrar a membrana basal, crescer intradermicamente e metastatizar
(Guerry et al., 1993). Alm disso, essas clulas apresentam inmeras anormalidades
citogenticas, sugerindo uma considervel instabilidade genmica (Meier et al., 1998).
O desenvolvimento do melanoma metasttico, a partir de melanomas primrios
VGP, ocorre quando essas clulas dissociam-se da leso primria, migram atravs do
estroma adjacente e invadem os vasos linfticos e/ou sangneos para formar o tumor
em stios distantes (Haass et al., 2005). A invaso e migrao do melanoma esto
relacionadas com alteraes na adeso celular. Normalmente, a adeso celular
controla a migrao da clula, organizao dos tecidos e organognese (Johnson,
1999). Distrbios na adeso contribuem para a invaso do tumor, interao tumor-
estroma e sinalizao entre clulas tumorais e clulas normais (Miller & Mihm, 2006)
Embora haja na literatura inmeros trabalhos com diferentes modelos (tecidos,
linhagens celulares e anticorpos) indicando mudanas em vrias molculas envolvidas
na gnese do melanoma, as alteraes responsveis pelo desenvolvimento e a
progresso do melanoma ainda no so totalmente conhecidas.
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Introduo
2. Resistncia ao anoikis e transformao maligna
Em organismos multicelulares, as clulas no vivem isoladas, ao invs disso, elas
encontram-se associadas com clulas vizinhas e com o ambiente extracelular (Assoian,
1997), do qual a matriz extracelular (MEC) faz parte. Alm de servir como suporte fsico
para a adeso das clulas, a MEC tambm garante a elas informao necessria para
sua proliferao, migrao, diferenciao e sobrevivncia em relao ao seu contexto
dentro de um rgo ou tecido (Lukashev & Werb, 1998; Valentijn et al., 2004).
A ancoragem da clula aos componentes da MEC mediada por molculas de
adeso do tipo integrinas, que alm de garantirem a ligao estrutural entre a MEC e o
citoesqueleto, so responsveis pela ativao de molculas de sinalizao que iro
governar seu destino (Reddig & Juliano, 2005; Sepulveda et al., 2005). A perda do
contato das integrinas com os componentes da MEC tem efeito deletrio para a vida de
uma clula, o que a leva a um tipo especfico de apoptose, denominado anoikis (Frisch
& Francis, 1994). Esse fenmeno ocorre mesmo quando elas so cultivadas na
presena de todos os fatores de crescimento e nutrientes necessrios sua
sobrevivncia (Meredith et al., 1993). Durante o processo de anoikis, todos os aspectos
que caracterizam a apoptose, incluindo fragmentao nuclear e permeabilidade da
membrana, so observados (Fadeel & Orrenius, 2005).
O anoikis foi descoberto primeiramente em clulas epiteliais, mas j foi observado
em inmeros tipos celulares (Meredith et al., 1993; Frisch & Francis, 1994). Estudos
mostraram sua participao durante o desenvolvimento embrionrio (Coucouvanis &
Martin, 1995) e na manuteno da homeostase de diferentes tecidos como a pele
(Polakowska et al.,1994), tecido epitelial (Hall et al., 1994) e glndulas mamrias
(Boudreau et al., 1995). Quando o controle do anoikis perdido, clulas aderentes
podem tanto entrar em uma fase estacionria do ciclo celular, como proliferar sem as
restries de adeso at que um ambiente adequado seja encontrado (Frisch &
Ruoslahti, 1997; Reed, 1999; Frisch & Screaton, 2001).
A capacidade de sobreviver independentemente de ancoragem considerada
passo importante para a transformao maligna das clulas, alm de ter participao
fundamental durante a progresso tumoral atravs do aumento do tempo de
sobrevivncia na ausncia da adeso, facilitando a migrao e a colonizao em
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Introduo
rgos distantes (Shanmugathasan & Jothy, 2000; Grossmann, 2002; Daz-Montero &
McIntyre, 2003). Em modelos animais, os tumores resistentes ao anoikis apresentam
incidncia maior de leses metastticas e aumento na sobrevivncia de clulas
circulantes no sangue (Howlett et al., 1995; Nikiforov et al., 1996; Zhu et al., 2001).
Particularmente em tumores no epiteliais como melanomas, foi demonstrado que a
transformao neoplsica confere resistncia ao anoikis (Petitclerc et al., 1999; Zhu et
al., 2001). Esta propriedade, observada nas clulas quando cultivadas in vitro, pode ser
correlacionada ao seu potencial oncognico encontrado in vivo (Wang, 2004).
A resistncia ao anoikis pode ser decorrente de vrios mecanismos como
alteraes no padro de molculas de adeso celular, perda da funo de genes
supressores de tumor, como PTEN e p53, expresso de oncogenes, como ras, raf, rac
e src, aumento no nvel de sinais de sobrevivncia, inativao de membros envolvidos
em vias de sinalizao de sobrevicncia ou mesmo defeitos na execuo das mesmas
(Hanahan & Weinberg, 2000; Grossmann, 2002). A diferena de expresso desses
fatores influenciada pelo ambiente, microambiente, fatores genticos e epigenticos,
e, como so fundamentais em vrios processos biolgicos, pode contribuir tanto com o
incio da transformao maligna como com a progresso tumoral (McGary et al., 2002).
Apesar da forte correlao entre a resistncia de clulas transformadas ao anoikis
e sua capacidade de formar tumores in vivo, a evidncia direta de uma relao causal
entre estas duas caractersticas ainda no foi claramente estabelecida.
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Introduo
3. Timp1
3.1 Timp e cncer
A metstase responsvel pela maioria das mortes causadas pelo cncer e o
processo de sua formao pode ser resumido em uma srie de passos distintos em
que a clula tumoral deixa o tumor primrio, invade os tecidos adjacentes e migra para
stios distantes atravs do sistema circulatrio, onde estabelece o tumor secundrio
(Woodhouse et al., 1997). Durante esse processo, necessrio que essas clulas
adquiram caractersticas que as tornem capazes de migrar por diferentes
compartimentos e invadir a MEC (Figura 2).
A principal barreira que impede a disseminao tumoral a membrana basal
(MB), uma forma especializada de MEC composta de uma rede de colgeno tipo IV,
laminina, perlecan e nidognio (Albini, 1998). A invaso da MB considerada um
evento fisiolgico raro, regulado cuidadosamente, que ocorre, por exemplo, durante o
desenvolvimento placentrio, quando clulas trofoblsticas invadem o endomtrio, e
durante a angiognese, onde clulas endoteliais invadem sua prpria membrana basal
vascular a fim de extravasar e formar um novo capilar (Liotta et al., 1991). Por isso, o
tumor classificado como no invasivo enquanto suas clulas permanecerem dentro
das barreiras da MB e torna-se invasivo a partir do momento em que adquirem a
capacidade de romp-las e invadir tecidos adjacentes (Kopfstein & Christofori, 2006).
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Introduo
Figura 2. Principais passos na formao da metstase. O primeiro passo (a) ocorre com a transformao celular e proliferao tumoral, seguido de intensa vascularizao que ocorre geralmente
quando a massa do tumor excede 2 mm de dimetro (b). A invaso local ocorre (c) e a desadeso e a embolizao de uma nica clula ou de clulas agregadas (d) ocorre em seguida. Aps sobreviverem na circulao sanginea, as clulas tumorais ficam presas nos capilares de rgos distantes por aderirem
nas clulas do endotlio capilar. O extravasamento ocorre depois (e), provavelmente pelos mesmos mecanismos envolvidos na invaso inicial. A proliferao dentro do rgo secundrio completa o
processo metasttico (f). Para continuar proliferando, a micrometstase precisa desenvolver uma rede de vasos e escapar das defesas do organismo. Figura modificada de Fidler, 2003.
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Introduo
Enzimas proteolticas, atravs da capacidade em degradar as protenas da MEC,
tornam-se componentes importantes para o processo de transformao maligna das
clulas. Com o seqenciamento do genoma humano, mais de 500 genes foram
identificados como codificadores de proteases ou protenas do tipo protease, com um
nmero enorme sendo associado ao processo tumoral (Lpez-Otn & Overall, 2002).
Dentre estas, as metaloproteases de matriz (MMPs) um grupo de 24 enzimas que
degradam os componentes da MEC e da MB (Brinckerhoff & Matrisian, 2002) tm
sido o foco de muitas pesquisas contra o cncer (Coussens et al., 2002; Egeblad &
Werb, 2002). Essa famlia de glicoprotenas secretada como pr-enzima latente,
ativada pela protelise de uma regio conservada presente no domnio N-terminal e
est dividida em seis grupos dependendo do tipo de substrato que degradam (Visse &
Nagase, 2003).
As MMPs so reguladas tanto em nvel transcricional como traducional
(Westermarck & Khri, 1999). Esses mecanismos de regulao operam
coordenadamente para garantir que a expresso e a atividade das MMPs ocorram
apenas onde a protelise necessria. Entretanto, tumores malignos apresentam
estratgias que evitam esses mecanismos reguladores e propiciam atividade
proteoltica que acompanha o desenvolvimento do cncer e da metstase (Overall &
Lpez-Otn, 2002).
A transcrio gnica das MMPs influenciada por fatores que incluem citocinas,
fatores de crescimento, hormnios, oncogenes e promotores tumorais (Westermarck &
Khri, 1999). Em nvel protico, a atividade biolgica das MMPs determinada por
seu estado de ativao. Como descrito anteriormente, a maioria das MMPs secretada
pelas clulas em forma latente e a converso para sua forma funcionalmente ativa
requer um processo de ativao de vrios passos especficos (Hofmann et al., 2005).
Aps ativao, a atividade das MMPs modulada atravs de inibidores comuns de
endopeptidases, como as 2-macroglobulinas, que esto presentes no plasma e fludo
dos tecidos e, mais especificamente, pelos inibidores de metaloproteases de matriz
(TIMPs) (Overall & Lpez-Otn, 2002; Hofmann et al., 2005). Quatro membros da
famlia TIMP (TIMP1, TIMP2, TIMP3 e TIMP4) foram identificados em vertebrados, e
podem ser encontrados ancorados na MEC ou secretados pela clula (Brew et al.,
2000). TIMPs so protenas de 21 a 34 kDa, que possuem uma estrutura com dois
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-
Introduo
domnios, um N- e um C-terminal de 125 e 65 aminocidos, respectivamente, com cada
um contendo trs ligaes dissulfeto conservadas (Williamson et al., 1990; Murphy et
al., 1991) (Figura 3). O domnio N-terminal contm a regio de maior homologia entre os quatro membros e suficiente para inibir a atividade proteoltica das MMPs (Murphy
et al., 1991; Willenbrock & Murphy, 1994; Caterina et al., 1997; Huang et al., 1997). A
inibio das MMPs pelos TIMPs ocorre atravs de ligao resistente denaturao
pelo calor e degradao proteoltica, mas reversvel e no-covalente, formando um
complexo estequiomtrico de 1:1 (Gomez et al., 1997; Brew et al., 2000). O domnio C-
terminal de TIMP parece ser importante para a interao com outras protenas e para a
formao de complexos com as pr-MMPs, retardando ou at impedindo o processo de
ativao das MMPs (Lambert et al., 2004).
O balano entre as atividades da protease e do inibidor determina o potencial
proteoltico do tumor, e a diminuio nos nveis de TIMP est geralmente
correlacionada com a tumorignese (Khokha et al., 1989). Desse modo, aumentos de
expresso e atividade das MMPs so encontrados em quase todos os cnceres
humanos. Interessantemente, a expresso de seus inibidores, TIMPs, tambm se
encontra geralmente aumentada em vrios cnceres. Dentre eles, TIMP1 foi associado
a um prognstico negativo em muitos cnceres humanos incluindo cncer de mama
metasttico, cncer coloretal, linfoma e carcinoma de pulmo (non-small cell lung
carcinoma), sugerindo um valor promissor de TIMP1 como marcador prognstico do
tumor (Kossakowska et al., 1991; Zeng et al., 1995; Fong et al., 1996; Ree et al., 1997;
McCarthy et al., 1999; Schrohl et al., 2004). Este foi um achado inicialmente inesperado
considerando o papel bem estabelecido de TIMP1 na inibio da degradao da MEC
pelas MMPs, invaso da clula tumoral e formao de metstases.
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Introduo
Figura 3. Estrutura primria da protena TIMP1. O diagrama mostra uma reprentao esquemtica da seqncia de aminocidos de TIMP1, incluindo seis pontes dissulfeto formadas pela ligao de cistenas.
Os stios de N-glicosilao encontram-se nos aminocidos 30 e 78 (Q). Na figura esto indicadas as alas formadas pelas pontes dissulfeto (L1 a L6) e a juno entre os domnios N- e C-terminal da protena (Stop). Figura modificada de Caterina et al., 1998.
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Introduo
3.2 Aspectos gerais de TIMP1
O gene TIMP1 est localizado no cromossomo humano Xp11.1-p11.4 e seu RNA
mensageiro (mRNA) de 900pb codifica uma protena de 184 aminocidos e de massa
molecular variando de 29 a 34kDa, dependendo do grau de glicosilao (Carmichael et
al., 1986; Huebner et al., 1986; Lambert et al., 2004). Essa glicosilao parece ter papel
em vrias funes incluindo a conformao correta da protena, o transporte da
molcula para a superfcie da clula e o aumento de sua estabilidade (Caterina et al.,
1998). Derry e Barnard (1992) demonstraram que o gene TIMP1 encontra-se dentro do
intron seis do gene synapsin I (SYN1) tanto em camundongos como em humanos
(Figura 4). Sua transcrio ocorre na direo oposta deste gene em camundongos e presumivelmente em humanos. O gene ARAF, que tambm transcrito na mesma
direo de TIMP1, est situado a 10kb de distncia (Derry & Barnard, 1992).
TIMP1 na maioria das vezes apresenta-se na forma solvel e sua expresso
induzida e geralmente tecido-especfica, sendo maior no sistema reprodutivo (Chirco et
al, 2006), embora j tenha sido descrita em uma variedade de culturas celulares
(Welgus et al., 1985; Cawston et al., 1986; Bord et al., 1999; Ries et al., 1999).
Camundongos que tiveram o gene Timp1 silenciado permanecem viveis, mas
apresentam reduo no tempo de vida reprodutivo e aumento na resistncia a
Pseudomonas aeruginosas (Gomez et al., 1997).
O promotor de TIMP1 no possui TATA box e a regulao de sua expresso
ocorre primariamente em nvel transcricional envolvendo vrios elementos responsivos
como AP-1, Sp1, NF-kappaB e fatores de transcrio CRE (Logan et al., 1996; Botelho
et al., 1998; Trim et al., 2000; Dean et al., 2000; Sohara et al., 2002; Aicher et al.,
2003; Bachmeier et al., 2005). Consequentemente, a expresso de TIMP1 regulada
por vrios fatores incluindo steres de forbol, soro, citocinas (TGF-, IL-6, IL-1 e IL-1),
fatores de crescimento (b-FGF, PDGF, EGF), entre outros (Gomez et al., 1997;
Lambert et al., 2004). Embora ainda no esteja claro como a regulao da expresso
de TIMP1 ocorre em cnceres humanos e se o aumento de sua expresso contribui ou
no para a progresso do tumor, muitos estudos clnicos o reportam como um
promissor marcador tumoral em malignidades humanas.
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-
Introduo
Figura 4. Mapa esquemtico de genes que flanqueiam TIMP1. O gene TIMP1 encontra-se no cromossomo X dentro do intron seis do gene SYN1, mas com transcrio oposta. O gene ARAF1 est
situado a 10kb de distncia de TIMP1 e transcrito na mesma direo. Os demais genes, ELK1, ZNF41
e ZNF157, encontram-se num raio de aproximadamente 100kb de distncia de TIMP1. Tel: telmero;
Cen: centrmero. Figura modificada de Anderson e Brown, 1999.
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Introduo
Sabe-se que TIMP1 inibe a atividade da maioria das MMPs, exceto MMP-19 e
vrios membros da subfamlia das metaloproteases tipo membrana (MT-MMPs), e
suprime a atividade da desintegrina e metaloprotease 10 (ADAM-10) (Baker et al.,
2002). Alm de se ligar no stio ativo das MMPs, TIMP1 tambm capaz de formar um
complexo estvel com a pr-MMP9 atravs de seu domnio C-terminal, retardando sua
ativao (Fassina et al., 2000).
3.3 Outras funes de TIMP1
A funo primria descrita para a famlia TIMP foi sua habilidade de inibir as
MMPs, entretanto inmeros trabalhos tm relatado uma variedade de outras funes
como induo da proliferao celular, inibio da angiognese, participao na
embriognese e inibio de apoptose. Algumas destas funes so atribudas
inibio das MMPs, entretando dados recentes da literatura tm monstrado que TIMPs
tambm exibem atividades celulares independentes desta inibio.
3.3.1 Regulao da proliferao celular
Quando TIMP1 foi identificado, foi descoberto ser idntico protena de
potencializao da atividade eritride (EPA), capaz de estimular a proliferao e
diferenciao de precursores dos eritrcitos murinos, clulas de leucemia mielide
crnica humana K-562, e da linhagem celular de leucemia ELM-1-1-3 (Gasson et al.,
1985; Docherty et al., 1985; Niskanen et al., 1988; Murate et al., 1993). Desde ento
inmeros trabalhos descreveram seu papel na promoo da proliferao de diversos
tipos celulares incluindo queratincitos, condrcitos, fibroblastos, clulas epiteliais e
endoteliais, clulas linfides e mielides, hepatoma, carcinoma de mama e
osteosarcoma humano (Bertaux et al., 1991; Hayakawa et al, 1992; Yamashita et al.,
1996; Kikuchi et al., 1997; Fata et al., 1999; Baker et al., 2002; Wang et al., 2002). Uma
srie de resultados parece provar que a promoo da proliferao celular por TIMP1
ocorre independentemente de sua atividade de inibir as MMPs, j que a reduo da
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-
Introduo
capacidade inibidora de TIMP1 no altera sua habilidade em estimular a proliferao
celular (Hayakawa et al., 1994; Chesler et al., 1995; Guedez et al., 1998a).
3.3.2 Regulao da angiognese
O processo de angiognese requer a invaso da clula endotelial na matriz
intersticial (Carmeliet & Jain, 2000). Portanto, os efeitos pr-angiognicos das MMPs
via degradao dos componentes da MEC e as atividades anti-angiognicas dos
TIMPs atravs da capacidade de inibir as MMPs tm sido extensivamente estudados in
vitro, assim como em modelos animais (Fassina et al., 2000). O envolvimento dos
TIMPs na angiognese foi demonstrado pela primeira vez em embries de galinhas
onde a angiognese foi inibida por TIMP1 e TIMP2 (Takigawa et al., 1990). A
superexpresso de TIMP1 em clulas tumorais pancreticas reduziu a angiognese e a
implantao destas clulas (Bloomston et al., 2002). Como TIMP1 est principalmente
envolvido no controle da MMP9, uma das molculas que medeia o processo de
extravasamento celular pela digesto do colgeno tipo IV da MB vascular, esta
atividade anti-angiognica de TIMP1 est envolvida com a inibio das MMPs (Lambert
et al., 2004).
3.3.3 Regulao da apoptose
Como descrito anteriormente, interaes clula-matriz extracelular e o
remodelamento da MEC por enzimas especficas influenciam enormemente na
sobrevivncia da clula, e a dissociao de clulas dependentes de ancoragem MEC
resulta em apoptose (Frisch & Francis, 1994; Boudreau et al., 1996).
Consistentemente, foi demonstrado que a superexpresso da MMP3 induz
apoptose em clulas epiteliais de mama in vitro e em camundongos transgnicos
(Boudreau et al., 1995), e que esta induo de apoptose significativamente inibida
quando camundongos transgnicos para a expresso de Mmp3 so cruzados com
camundongos que superexpressam Timp1 (Chirco et al., 2006). A inibio de apoptose
por TIMP1 atravs da inibio das MMPs tambm foi relatada em clulas estreladas
hepticas ativadas (Bachem et al., 1992), j que a perda da funo de inibir a MMP
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Introduo
extingue sua atividade anti-apopttica nessas clulas, sugerindo que esta
dependente desta inibio (Murphy et al., 2002). Este envolvimento da inibio das
MMPs na atividade anti-apopttica de TIMP1 pode ser explicado por meio da
preveno da degradao da matriz e consequentemente a extino da morte celular
por anoikis.
Recentemente, muitos estudos tm demonstrado que TIMP1 pode atuar como um
fator de sobrevivncia celular independente de seu papel de inibir as MMPs. Alguns
destes estudos observaram que TIMP1 pode atuar como fator de sobrevivncia em
clulas de linfoma, alm de sua expresso, e no a das MMPs, estar correlacionada
com grau clnico em linfoma no-Hodgkin, sugerindo um mecanismo independente da
inibio das MMPs pelo qual TIMP1 medeia sobrevivncia celular (Kossakowska et al.,
1991; Oelmann et al., 2002). Alm disso, observou-se que TIMP1 aumentava a
sobrevivncia de clulas B do centro germinativo, clulas B normais de tonsila e em
linhagens de linfoma de Burkitt pela supresso da apoptose atravs da induo do
gene anti-apopttico bcl-xL e de fatores de sobrevivncia e de diferenciao de clulas
B, como IL-10, mesmo quando estas clulas eram tratadas com um inibidor de MMP e
com uma forma de TIMP1 que no possuia atividade inibidora de MMP, concluindo que
a regulao da apoptose por TIMP1 nestas clulas independente da inibio das
MMPs (Guedez et al., 1998a; Guedez et al., 1998b; Gaudin et al., 2000; Guedez et al.,
2001).
Adicionalmente, foi demonstrado que a superexpresso de Bcl-2 induz a
expresso de TIMP1 e que este, atuando como uma molcula anti-apopttica
downstream a Bcl-2, protege clulas epiteliais de mama humanas da morte celular
intrnseca e extrnseca, causada por diversos fatores como choque-trmico,
adriamicina, perxido de hidrognio, irradiao por raios-X, e anoikis (Li et al., 1999; Liu
et al., 2003; Liu et al., 2005). A proteo contra apoptose nessas clulas foi efetiva
quando se comparou um mutante de TIMP1, o mesmo que falhou em inibir a apoptose
em clulas hepticas ativadas, com seu controle normal, sugerindo que a regulao
especifica da apoptose independe da atividade de inibir as MMPs em clulas epiteliais
de mama humana. Em concordncia com esses estudos, Lee e colaboradores (2003)
relataram a habilidade de TIMP1 em inibir a apoptose em clulas de carcinoma de
mama humano ser decorrente da ativao seqencial de molculas envolvidas na
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Introduo
cascata da via de sinalizao de sobrevivncia (c-Scr, PI3-K e AKT) e no da inibio
das MMPs.
Juntos, torna-se claro que a regulao da apoptose por TIMP1 dependente ou
independente da inibio de MMP coexiste. Em um microambiente onde a degradao
da MEC afeta a sobrevivncia, possvel prever que TIMP1 regula a apoptose
primariamente atravs da inibio das MMPs. Se a sobrevivncia celular regulada por
um estimulo independente das MMPs, TIMP1 pode ser considerado um determinante
crtico da morte celular atravs de sua funo em regular vias de transduo de sinais
intracelulares. pouco provvel que a regulao da morte celular dependente e no
das MMPs seja mutuamente exclusiva, parecendo haver mais uma interao entre
elas, dependendo do estimulo pr-apopttico, do microambiente celular, dos nveis de
MMPs, e da disponibilidade de um receptor hipottico para TIMP1 na superfcie das
clulas.
A primeira evidncia de que TIMP1 poderia sinalizar atravs de um receptor de
membrana celular ocorreu a partir de estudos com protenas recombinantes de TIMP1
marcadas radioativamente ligando-se a superfcie celular de clulas de linfoma
mielide crnico e queratincitos (Chirco et al., 2006). Desde ento, muitos
investigadores tm focado seus trabalhos na identificao de um receptor para TIMP1
em diversos tipos celulares (Luparello et al., 1999; Ritter et al., 1999; Tan et al., 2003).
Recentemente, anlises de imunoprecipitao e microscopia confocal revelaram a
interao da molcula CD63 com TIMP1 e com 1 integrina, e suas co-localizaes na
superfcie das clulas epiteliais de mama humana (Jung et al., 2006). A molcula CD63
uma protena transmembrana da famlia das tetraspaninas que faz ligao com
diversos tipos de protenas e, na membrana plasmtica, os membros desta famlia,
incluindo a CD63, so conhecidos por interagir com molculas de adeso celular como
as integrinas, regular vias de transduo de sinais incluindo as de adeso celular,
motilidade e sobrevivncia (Berditchevski, 2001; Hemler, 2001; Yunta & Lazo, 2003).
Nas clulas epiteliais de mama humana, quando a expresso de CD63 foi diminuda,
observou-se efetiva reduo na ligao de TIMP1 na superfcie celular, na sua co-
localizao com 1 integrinas e, consequentemente, reverso do estado de ativao da
integrina mediada por TIMP1, da sinalizao de sobrevivncia celular e da inibio da
apoptose mesmo em clulas que superexpressavam TIMP1. Alm disso, os autores
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Introduo
conseguiram demonstrar correlao entre expresso de TIMP1 e nvel de 1 integrina
na superfcie da clula independente da adeso celular (Jung et al., 2006).
A identificao de um receptor para TIMP1 na superfcie da clula apenas o
comeo para explicar as diversas aes moleculares exercidas por esta molcula. O
complexo mecanismo da via de sinalizao de sobrevivncia por TIMP1 no
microambiente tecidual ainda necessita intensa investigao.
3.4 TIMP1 e eventos epigenticos
Recentemente, alguns trabalhos vm sugerindo a participao de eventos
epigenticos, como a metilao do DNA, na regulao da expresso de Timp1 (Xu et
al., 1998; MacDougall et al., 1999; Huang et al., 2000). Alm de participarem da
regulao da expresso gnica, esses eventos tambm esto envolvidos na inativao
do cromossomo X, onde o gene TIMP1 se encontra. Em mamferos, essa inativao
silencia a maioria dos genes de um dos dois cromossomos encontrados nas fmeas. O
cromossomo X humano preserva seu status de ativao quando isolado em clulas
somticas hbridas de roedores/humanos, e esses hbridos, que podem conter tanto o
cromossomo X ativo como o inativo, tm sido usados para avaliar o estado de
inativao dos genes ligados a ele (genes ligados ao X). O gene TIMP1 expresso em
alguns, mas no em todos os cromossomos X inativos desses hbridos, sugerindo que
este gene est propenso tanto reativao como variabilidade da sua inativao. J
que muitos genes que escapam da inativao do cromossomo X encontram-se em
grupos, Anderson e Brown (1999) examinaram a expresso de quatro genes (ARAF1,
ELK1, ZNF41 e ZNF157) encontrados aproximadamente 100kb de distncia de TIMP1
(Figura 4) e constataram que os quatro genes eram expressos apenas pelo cromossomo X ativo, demonstrando, portanto, que os fatores que permitem a
expresso de TIMP1 a partir do cromossomo X inativo so nica e exclusivamente
especficos para este gene. Alm disso, para determinar se essa variao da inativao
de TIMP1 uma funo do ambiente da clula hbrida ou tambm se poderia ser
observada em humanos, os autores desenvolveram um ensaio de anlise alelo-
especifico para avaliar a expresso de TIMP1 em mulheres. A expresso dos dois
alelos foi detectada em 37,5% das mulheres analisadas, enquanto que o restante das
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Introduo
mulheres no apresentou expresso de TIMP1 no cromossomo X inativo, sugerindo
que a inativao deste gene polimrfica em mulheres.
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Introduo
4. Metilao de DNA e cncer
Atualmente so conhecidas inmeras alteraes moleculares que foram descritas
em melanomas malignos, quando comparados aos melancitos. Diversas outras, a
maioria talvez desconhecida, esto sendo descobertas a partir de anlises
comparativas de perfis de expresso gnica de melanomas de vrias fases (Curtin et
al., 2005; Haqq et al., 2005; Kabbarah & Chin, 2006; Gray-Schopfer et al., 2007;
Jnsson et al., 2007). Com esse acesso infindvel de informaes, certamente, o mais
importante ser distinguir as causas primrias da transformao maligna de
melancitos.
O principal evento durante um processo de transformao pode ser acarretado
por uma mudana celular que clonalmente herdada. Este evento poder contribuir
para uma eventual malignidade, o que ocorreria independentemente e no como um
resultado secundrio de algumas outras mudanas oncognicas. Todas as outras
alteraes, ocorrendo como conseqncia da mudana primria, poderiam ser
chamadas de mudanas secundrias (Bennett, 2008). Inmeras tcnicas podem ser
utilizadas para detectar centenas destas mudanas (Winnepenninckx et al., 2006;
Hoek, 2007; Johansson et al., 2007; Stark & Hayward, 2007), mas infelizmente nem
todas contribuiro para a malignidade. Portanto, identificar eventos primrios de
extrema importncia, pois, por definio, so a causa do desenvolvimento tumoral.
Conseqentemente, durante sua evoluo clonal, tal evento primrio resultaria em um
clone que apresentaria uma vantagem de crescimento comparado aos seus vizinhos,
ou uma vantagem alternativa e seletiva como capacidade de migrao (Hoek et al.,
2006).
A maioria dos estudos sobre a etiologia do cncer considera as alteraes
genticas (mutao, deleo, amplificao e translocao) como os nicos
mecanismos responsveis pela gnese do tumor (Davies et al., 2002; Houghton &
Polsky, 2002; Carr et al., 2003; Chin, 2003; Medic et al., 2006; Miller & Mihm, 2006;
Gagglioli & Sahai, 2007). Recentemente, entretanto, eventos epigenticos tem atrado
a ateno dos investigadores, e um nmero crescente de trabalhos tm demonstrado a
participao de alteraes epigenticas tanto na iniciao como na promoo de
tumores e, ao que tudo indica, esses eventos so to importantes quanto as mutaes
21
-
Introduo
(Baylin & Herman, 2000). Eventos epigenticos podem alterar o estado fenotpico sem
que haja mudanas no gentipo e, mesmo sendo potencialmente reversveis, so
geralmente herdados durante a diviso celular (Laird, 2005). Neste processo, mltiplos
mecanismos interagem para estabelecer coletivamente um estado da cromatina,
envolvendo modificaes em histonas, associao de protenas, atividade
transcricional e, em mamferos, metilao do DNA (Robertson & Jones, 1998).
A nica modificao epigentica que ocorre no DNA de mamferos a metilao
no carbono C5 da citosina que precede a guanina nos dinucleotdeos CpG (Bird, 2002)
(Figura 5), e tem sido reconhecida como um importante mecanismo de regulao da expresso gnica destas clulas (Jones & Takai, 2001; Jones & Baylin, 2002). A
maquinaria da metilao de DNA em mamferos composta pelas DNA
metiltransferases (DNMTs), que estabelecem e mantm o padro de metilao do
DNA, e pelas methyl binding proteins (MBDs), que esto envolvidas no reconhecimento
da metilao (Robertson, 2005).
Em clulas normais, a metilao ocorre predominantemente em regies
repetitivas do genoma, incluindo DNA satlites, elementos transponveis e retrovrus
endgenos (Robertson, 2002). Alm disso, participa da inativao do cromossomo X e
do imprinting genmico, que definido como uma modificao epigentica de um
cromossomo parental especfico, no gameta ou no zigoto, que leva expresso
diferencial de dois alelos de um gene na clula somtica do descendente (Feinberg et
al., 2002). Ilhas CpG (regies ricas em dinucleotdeos CpG), localizadas em
promotores de cerca de 50% de todos os genes, apresentam-se geralmente
desmetiladas (Jones & Baylin, 2002), embora um aumento no nmero de excees
tenha sido identificado (Liu et al., 2005; Song et al., 2005) (Figura 6). A metilao do DNA pode reprimir a transcrio gnica diretamente, atravs da inibio da ligao de
fatores de transcrio especficos e, indiretamente, pelo recrutamento de MBDs e suas
associaes a protenas repressoras e remodeladoras da cromatina (Robertson, 2005).
22
-
Introduo
Figura 5. Mecanismo de metilao de DNA. As fitas de DNA esto enroladas em volta de um octmero de histonas, formando os nucleossomos. Estes nucleossomos so organizados em cromatina, que o
bloco de construo dos cromossomos. A metilao de DNA ocorre no carbono 5 da citosina que
precede uma guanina, e esta reao catalizada pelas DNA metiltransferases (DNMTs). Essa metilao
garante uma assinatura epigentica nica que regula a expresso gnica. Figura modificada de
Rodenhiser & Mann, 2006.
23
-
Introduo
Figura 6. Metilao de DNA e cncer. O diagrama mostra uma regio representativa do DNA genmico de uma clula normal. Essa regio contm heterocromatina pericentromrica hipermetilada rica em
repeties e um gene suppressor de tumor (GST) ativamente transcrito associado a uma ilha CpG
hipometilada (indicada em vermelho). Em clulas tumorais, a heterocromatina rica em repeties torna-
se hipometilada e isso contribui para a instabilidade genmica, uma caracterstica de clulas tumorais,
por meio do aumento de eventos mitticos recombinantes. Metilao de novo de ilhas CpG tambm
ocorre em tumor, e pode resultar no silenciamento transcricional de genes que regulam a proliferao.
Mudanas no padro de metilao do DNA parecem ocorrer no incio da tumorignese. Figura
modificada de Robertson, 2005.
24
-
Introduo
O estabelecimento adequado e a manuteno dos padres de metilao so
essenciais para o desenvolvimento normal dos mamferos e para o funcionamento do
organismo adulto. Alm de ser responsvel pelo silenciamento da expresso gnica, a
metilao do DNA mantm a estabilidade genmica, tendo em vista a vasta quantidade
de regies repetitivas, que, quando desmetiladas, podem favorecer recombinaes e
causar a desregulao transcricional de genes prximos a estas regies (Eden et al.,
2003). Por isso, sua importncia tem sido cada vez mais ressaltada por meio de um
nmero crescente de estudos com doenas humanas que ocorrem quando padres
epigenticos no so apropriadamente estabelecidos e/ou mantidos (Egger et al.,
2004). Alm de ser comumente relacionada ao desenvolvimento do cncer humano
(Brueckner & Lyko, 2004; Das & Singal, 2004; Jiang et al., 2004; Levenson, 2004),
anormalidades epigenticas so encontradas em vrias outras doenas, entre elas
desordens neurolgicas, psiquitricas e imunes, e malformaes congnitas
(Robertson, 2005).
Inmeros trabalhos mostram a hipermetilaao de DNA reprimindo a transcrio de
genes que codificam supressores de tumor (Zheng et al., 2000; Jackson-Grusby et al.,
2001), reguladores do ciclo celular (Gonzalez-Gomez, 2003), enzimas responsveis
pelo reparo do DNA (Dobrovic & Simpfendorfer, 1997; Chan et al., 2002), receptores de
hormnios (Nass et al., 2000) e promotores de apoptose (Soengas et al., 2001). De
fato, dados obtidos de estudos de screening de alteraes epigenticas no genoma de
clulas tumorais demonstraram que os produtos de genes modificados
epigeneticamente esto envolvidos na regulao de todas as funes celulares e que o
silenciamento epigentico destes genes contribui com a tumorignese (Herman &
Baylin, 2003). Nos ltimos cinco anos, estudos com melanomas malignos revelaram
por exemplo a hipermetilao aberrante de regies promotoras de pelo menos 50
genes (Paz et al., 2003; van der Velden et al., 2003; Gallagher et al., 2005). Embora o
padro epigentico anormal de genes possa ocorrer em qualquer fase da progresso
tumoral, estudos tm indicado que ele ocorre com maior freqncia durante os estgios
iniciais do processo neoplsico (Yamada et al, 2005).
A perda da metilao global um evento freqente e precoce no cncer, e est
relaciona com a gravidade da doena e com o potencial metasttico de muitos tipos de
tumores (Widschwendter et al., 2004). A perda da metilao em promotores gnicos
25
-
Introduo
tambm pode ocorrer durante a carcinognese. A desmetilao acompanhada pelo
aumento da expresso tem sido relatada em alguns genes como o gene SERPINB5,
inibidor de serina protease (tambm conhecido como maspina) em cncer gstrico
(Akiyama et al., 2003), bem como o oncogene -synuclein (SNCG) em melanoma
(Wada et al., 2004) e nos cnceres de mama e de ovrio (Gupta et al., 2003), e a
famlia de genes MAGE, que codifica antgenos tumorais de funo desconhecida (De
Smet et al., 1999). No incio da tumorignese, a hipometilao global pode predispor
instabilidade genmica e, conseqentemente, mais alteraes genticas, enquanto que
a hipometilao do promotor poderia ser um evento tardio, que permitiria a adaptao
das clulas tumorais em seu ambiente local e promoveria a metstase. Entretanto, a
perda do controle epigentico que reativa a transcrio de genes no desenvolvimento
de cnceres ainda muito pouco compreendida.
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-
Introduo
5. Modelo de transformao neoplsica
Com o objetivo de estudar a relao entre resistncia ao anoikis e transformao
maligna de uma maneira mais direta, o modelo de estudo de transformao maligna de
melancitos murinos utilizado durante esse trabalho foi desenvolvido no nosso
laboratrio a partir da restrio da adeso ao substrato da linhagem no tumorignica
de melancitos, melan-a (Correa et al., 2005; Oba-Shinjo et al, 2006). Nele, a condio
de impedimento seqencial de ancoragem foi suficiente para o estabelecimento tanto
de linhagens celulares no tumorignicas, correspondentes s etapas que levam
transformao dos melancitos melan-a, como de linhagens de melanoma com
diferentes nveis de agressividade (Figura 7).
Melan-a uma linhagem de melancitos pigmentados imortalizados que foi
estabelecida a partir de melanoblastos epidermais normais de embries de
camundongos C57BL (Bennett et al., 1987). Estas clulas proliferam em condies
semelhantes quelas requeridas pelos melancitos e melanoblastos de camundongos
normais no estabelecidos, como dependncia de forbol miristato acetato (PMA) e pH
extracelular baixo. Elas no formam tumores em camundongos singenicos ou nude,
mesmo quando inoculadas em quantidade elevada (2107 clulas por animal), e retm
todas as caractersticas de melancitos normais testadas, exceto pela resposta
proliferativa toxina da clera na presena de PMA e pela senescncia (Bennett et al.,
1987).
Clulas melan-a (105 clulas/mL) foram mantidas em suspenso por 96 horas
tempo que corresponde a um ciclo impedimento de ancoragem. Apesar de no serem
tumorignicas, as clulas melan-a formaram pequenos esferides em uma baixa
proporo de aproximadamente 0,1%. Esses esferides foram transferidos para uma
placa de cultura, cultivados em condies normais de adeso e expandidos, dando
origem a uma nova linhagem, denominada 1C (linhagem obtida aps um ciclo de
bloqueio da adeso ao substrato). Essa sublinhagem de melan-a foi submetida a um
novo ciclo de impedimento de ancoragem e, aps 96 horas, clulas sobreviventes
foram resgatadas e a sublinhagem 2C (dois ciclos de bloqueio de adeso ao substrato)
foi obtida.
27
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Introduo
1C 2C, 3C, 4C melan-a
anoikis
Diluio limitante
96h
Linhagens de Melanoma
Figura 7. Modelo de transformao maligna de melancitos associado resistncia ao anoikis. Representao esquemtica do protocolo experimental que resulta na transformao dos melancitos
melan-a. Melancitos no tumorignicos da linhagem melan-a foram submetidos a ciclos seqenciais de
bloqueio de ancoragem. Os esferides formados aps submeter estas clulas ao 5 ciclo de bloqueio de
ancoragem foram clonados e todos os clones, selecionados aleatoriamente, foram tumorignicos quando
inoculados subcutaneamente em camundongos singenicos. Desta forma, diferentes linhagens de
melanoma foram obtidas, apresentando diferentes taxas de proliferao tanto in vitro quanto in vivo,
alm de diferentes padres de pigmentao. 1C, 2C, 3C e 4C: clulas melan-a submetidas,
respectivamente, a 1, 2, 3 e 4 ciclos de bloqueio de ancoragem; 96h: tempo de cultivo em condio de
bloqueio de ancoragem em horas.
28
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Introduo
Estes ciclos seqenciais de impedimento de ancoragem por 96 horas, seguidos
pelo cultivo em adeso e expanso das clulas sobreviventes, foram repetidos dando
origem s linhagens 3C e 4C (trs e quatro ciclos de bloqueio da adeso ao substrato,
respectivamente). As linhagens 1C, 2C, 3C e 4C, como a parental, no so capazes de
formar tumores in vivo, mas j apresentam crescimento independente de PMA (Oba-
Shinjo et al., 2006).
Esferides formados aps submeter a linhagem 4C a um ciclo de bloqueio da
adeso ao substrato foram sujeitos diluio limitante originando diferentes linhagens
de melanoma (4C3, 4C11, Tm1 e Tm5, entre outras). Esses clones tambm
apresentaram capacidade de crescimento independente de PMA, uma caracterstica de
clulas de melanoma em cultura (Mufson et al., 1979), e foram testados quanto a sua
tumorigenicidade, sendo transplantados subcutaneamente (5105 clulas/animal) no
dorso de camundongos C57BL/6 singenicos. Surpreendentemente, todos os clones
analisados derivados dos esferides da linhagem 4C mostraram-se tumorignicos, com
perodos de latncia para o aparecimento do tumor variando de 12 a 30 dias.
Posteriormente, estes clones foram avaliados quanto capacidade de formao de
esferides e mostraram-se capazes de formar esferides em uma proporo 20 a 320
vezes maior que as clulas parentais. Alm disso, estas clulas apresentam diferenas
fenotpicas como pigmentao, velocidade de crescimento em cultura, agregao e
capacidade metasttica (Oba-Shinjo et al., 2006).
Assim, este modelo confere uma vantagem excepcional para elucidar quais
mecanismos esto envolvidos no incio da tumorignese e quais deles so
responsveis pela sua progresso. Isso porque foram estabelecidas tanto linhagens
celulares no tumorignicas, correspondentes s etapas que levam transformao
dos melancitos melan-a, como linhagens de melanoma com diferentes nveis de
agressividade, sendo que todas elas, bem como a linhagem parental melan-a, tm uma
origem gentica comum.
Esta heterogeneidade sugere a contribuio de mecanismos epigenticos na
origem da neoplasia. Portanto, as teorias que propem uma origem epigentica para a
transformao maligna (Rubin, 2001 e 2005; Esteller, 2005 e 2006; Baylin & Ohm,
2006; Feinberg et al., 2006) tambm fundamentam as bases do estabelecimento deste
29
-
Introduo
modelo. Deste modo, possvel que o impedimento de adeso ao substrato atue ento
como um fator desencadeador da transformao celular induzindo, atravs de
mecanismos epigenticos, alteraes cumulativas ao longo dos ciclos de bloqueio de
adeso ao substrato.
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OBJETIVOS
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Objetivos
1. Objetivo geral
Identificar genes superexpressos ao longo da transformao maligna de
melancitos melan-a induzida pelo bloqueio de adeso ao substrato e correlacionar
seus papis na aquisio do fentipo resistente ao anoikis.
2. Objetivos especficos
Determinar o nvel de expresso de Timp1 ao longo da transformao maligna
dos melancitos;
Estudar uma possvel regulao epigentica da expresso deste gene;
Investigar o papel biolgico de Timp1 na aquisio do fentipo resistente ao
anoikis.
Investigar o papel biolgico de Timp1 na transformao maligna dos
melancitos.
31
-
MATERIAL
-
Material
1. Comit de tica em Pesquisa
O desenvolvimento deste projeto foi autorizado pelo Comit de tica em
Pesquisa da Universidade Federal de So Paulo/Hospital So Paulo, sob o
processo de nmero 175/07.
2. Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6, do sexo feminino,
com 6 a 8 semanas de idade, obtidos do biotrio do Centro de
Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade
Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina. Os animais foram
mantidos em condies padronizadas de temperatura e iluminao (ciclo 12/12
horas claro/escuro), sem restrio alimentar. A manipulao e manuteno dos
animais estiveram de acordo com procedimentos padro definidos no Guia
Internacional de Princpios para a Pesquisa Biomdica Envolvendo Animais
(CIOMS, Genebra, 1985).
3. Anticorpos
Anticorpo primrio policlonal produzido em coelho, direcionado a
seqncias de aminocidos especficas da regio carboxi-terminal do inibidor
de metaloprotease 1 (TIMP1) humano, reativo para amostras de camundongo,
rato e humano, procedentes da Affinity BioReagents (ABR, Golden, CO, USA);
Anticorpos primrios policlonais produzidos em cabra, direcionados a
seqncias de aminocidos especficas de regies da beta-actina, MMP9 e
CD34, reativos para amostras de camundongo, procedentes da Santa Cruz
Biotechnology, Inc. (San Diego, CA, USA);
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-
Material
Anticorpo secundrio policlonal produzido em cabra, direcionado IgG
de coelho, e anticorpo secundrio policlonal produzido em coelho, direcionado
IgG de cabra, conjugados com HRP (Horseradish Peroxidase), procedentes
da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA).
Anticorpo secundrio policlonal produzido em cabra, direcionado IgG
de coelho, conjugado com Alexa 610, procedentes da Molecular Probes
(Eugene, OR, USA)
4. Drogas e reagentes
-mercaptoetanol, fosfato de sdio monobsico (NaH2PO4), fosfato de
sdio dibsico (Na2HPO4), formamida deionizada, Nonidet P-40, ortovanato de
sdio, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), polyoxyethilenesorbitan
monolaurate (Tween 20), procedentes da Amresco (Slon, Ohio, USA);
5-Aza-2-deoxicidina (5-Aza-CdR), aprotinina, 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI), Corante tetrazolium amarelo solvel 3-(4,5,-
dimethylthiazol)-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), leupeptina,
procedentes da Calbiochem (Darmstadt, Germany);
cido actico glacial, cido clordrico 37% (HCl), azul brilhante
Comassie R-250, azul de bromofenol, azul de toluidina, cloreto de potssio
(KCl), cloreto de sdio (NaCl), clorofrmio, dimetilsulfxido (DMSO), etanol
absoluto, extran, formaldedo 37%, fosfato de potssio (K2HPO4), hidroquinona,
isopropanol, metanol, xilol e xyleno cyanol, procedentes da Merck (Darmstadt,
Germany);
cido brico, ampicilina, bicarbonato de sdio, geneticina (G418), meio
de cultura RPMI 1640, penicilina-estreptomicina, soro fetal bovino, procedentes
da Gibco (Carlsbad, CA, USA);
cido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfnico (HEPES), albumina
de soro bovino (BSA), brometo de etdeo, diethylpyrocarbonate (DEPC),
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-
Material
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), phorbol 12-myristate13-acetate (PMA),
procedentes da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA);
gar, procedente da Vetec Qumica Fina LTDA (Rio de Janeiro, RJ);
agarose (DNA typing grade), dNTP Mix, fenol saturado em Tris-HCl
UltraPure Buffer-Saturated Phenol, LB Broth Base, Lipofectamine 2000
Transfection Reagent, tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris base),
tris[hydroxymethyl]aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), TRIzol,
procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);
Cmaras de Boyden modificadas Transwell, procedentes da Corning
(Acton, MA, USA);
Colunas de purificao de DNA GFX PCR DNA and Gel Band
Purification, filmes para autoradiografia Hyperfilm ECL, membranas de
PVDF, procedentes da Amersham (Piscataway, NJ, USA);
Colunas Wizard minipreparation, procedentes da Promega (Madison,
WI, USA);
Criotubos, filtros com membrana de 0,2 m para meio de cultura celular
Filtropur, placas de cultura celular de 100 mm e de 60 mm de dimetro, placas
de Petri para cultura de bactria, placas plsticas de cultura celular contendo 6,
24 e 96 poos, ponteiras de micropipetas com capacidade de volume mximo
de 0,1, 0,2 e 1 mL, tubos para microcentrfuga com capacidade de volume
mximo de 0,2, 0,5, 1,5 e 2,0 mL e tubos para centrfuga com capacidade de
volume mximo de 15 e 50 mL, procedentes da Sarstedt AG & Co. (Nmbrecht,
Germany);
Kit de deteco de quimioluminescncia SuperSignal West Pico
Chemiluminescent Substrate procedente da Pierce Chemical (Rockford, IL,
USA);
Kit QIAquick Gel Extraction, procedentes da Qiagen (Valencia, CA,
USA);
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Material
Leite em p desnatado Molico, procedente da Nestl (So Paulo, SP);
Marcadores de peso molecular para DNA, procedentes da Fermentas
International Inc (Ontrio, Canad);
MATRIGEL Basement Membrane Matrix, procedentes da Becton
Dickinson Labware (Bedford, MA, USA);
Permount, procedente da Fisher Scientific (New Jersey, NJ, USA);
Reagente Bio-Rad protein assay dye reagente concentrate, procedente
da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA);
Soluo de tripsina 0,25%/EDTA 0,5mM, procedente do Instituto Adolfo
Lutz (So Paulo, SP).
5. Enzimas
1:1 Taq/TaqStart antibody, procedente da BD Biosciences Clontech
(Palo Alto, CA, USA);
DNA polimerase BioTools DNA PolymeraseRecombinant from
Thermus thermophilus procedente da BioTools (Madri, Espanha);
DNase I (Amplification Grade), Ribonuclease A (RNAse A),
RNAseOUT, Superscript III, procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA,
USA);
Enzima Liberase, procedente da Roche (Basel, Switzerland);
Enzimas de restrio BamHI e NotI, procedentes da New England
Biolabs (Ipswich, MA, USA);
Taq DNA polimerase recombinante, T4 DNA Ligase e enzimas de
restrio Bgl2, EcoRI e XhoI, procedentes da Fermentas International Inc.
(Ontrio, Canad).
35
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Material
6. Linhagens celulares
Diversas linhagens celulares foram utilizadas neste estudo e representam
fases distintas da transformao maligna de melancitos murinos e da
progresso do melanoma. A linhagem de melancitos melan-a (Bennett et al.,
1987) foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Michel Rabinovitch da Disciplina de
Parasitologia da Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP). As demais
linhagens (2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1 e Tm5) foram estabelecidas aps
submeter clulas melan-a a ciclos seqenciais de impedimento de ancoragem
ao substrato (Correa et al., 2005; Oba-Shinjo et al., 2006).
7. Oligonucleotdeos
M13 (-21), Oligo(dT)12-18 Primer, T3 Promoter e T7 Promoter, Timp1 F,
Timp1 R, Act F, Act R, procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);
Timp1SNuPE R, S1, S2, S3, procedentes da Operon Biotechnology
(Huntsville, AL, USA);
Timp1Transf F, Timp1Transf R, procedentes da Integrated DNA
Technologies (Idt, Coralville, IA, USA).
8. Programas
Para a quantificao da intensidade dos pixels presentes na imagem das
bandas geradas por eletroforese em gel de agarose 1%, foi utilizado o
programa Image Processing and Analysis in Java, ImageJ 1.38b (Wayne
Rasband, National Institute of Health, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/).
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MTODOS
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Mtodos
1. Meios de cultura
1.1 Preparao dos meios de cultura
Os meios de cultura para o cultivo de bactrias foram preparados com gua
deionizada e esterilizados em autoclave a 120C por 15 minutos. No caso do cultivo
das clulas de mamferos, os meios de cultura tambm foram preparados com gua
deionizada, mas esterilizados por filtrao positiva atravs de membrana de 0,2 m.
1.2 Meios para cultivo de bactrias
Meio LB: 200 mg/L de LB Broth Base.
Meio LB amp: meio LB acrescido de 100 g/mL de ampicilina.
Meio LB gar: meio LB acrescido de 2% de gar e 100 g/mL de ampicilina.
1.3 Meios para cultivo e manuteno de clulas de mamferos
Meio RPMI: 10 g de RPMI 1640, acrescido de 10 mM HEPES, 24 mM de
bicarbonato de sdio, 10mL/L de penicilina-estreptomicina e 200 nM de PMA. O pH do
meio de cultura foi ajustado para 6,9.
Meio R5: meio RPMI suplementado com 5% de SFB.
Meio R10: meio RPMI suplementado com 10% de SFB.
Meio de congelamento: 10% de DMSO em SFB (v/v).
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Mtodos
2. Cultivo e manuteno dos estoques celulares de mamferos
Todas as linhagens utilizadas neste trabalho (clulas melan-a e as linhagens
derivadas 2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1 e Tm5) foram cultivadas em monocamadas em
placas plsticas de cultura celular de 100 mm de dimetro, em meio R5, at atingirem
subconfluncia. O pH e a temperatura da cultura foram mantidos atravs de incubao
em estufa com atmosfera de 5% de CO , a 37C.2 Estoques celulares foram
armazenados em criotubos, congelados em meio de congelamento e mantidos em
nitrognio lquido.
2.1 Cultivo celular em suspenso
Para os ensaios de bloqueio de adeso ao substrato, as placas plsticas de
cultura de 100 mm de dimetro foram previamente recobertas com um fino filme de
agarose 1% para impedir a ade