CARACTERIZAÇÃO, EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO POR CROMATOGRAFIA DE COMPOSTOS DE URUCUM
Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis...
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Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de
Corynebacterium pseudotuberculosis
Revisão bibliográficaOs antígenosExtraçãoPurificação
Material e métodoExtraçãoPurificação
Membrana
Parede
Ag. Extra
celulares
Ag. Intra
celulares?
Ag. fracamenteligados à parede
Ag. de parede /membrana
Representação esquemática da localização das frações antigênicas de C. pseudotuberculosis
Peptidoglicano
Ácidos teicóicos
Camadalipídica
Quantidade de material solúvel extraído de parede celular de C. pseudotuberculosis por vários métodos de extração
(Cameron and Purdom, 1971)
1ra Fase 2da Fase 3ra Fase 4a Fase Resultado(% de material solúvel)
Ácido Tricloro Acético Gelado(ATAG) / / /
Traço
Etanol/Dietileter (E/D) ATAG / / TraçoE/D ATAG Formamide / TraçoE/D ATAG Enzima Streptomyces
Albus/ Traço
E/D ATAG Lisozima / 4,0E/D ATAG H2SO4 Enzima S.A. TraçoE/D ATAG H2SO4 Lisozima TraçoE/D SDS Enzima S.A. / 0E/D SDS Lisozima / 0,4E/D ATAG SDS 2% Enzima S.A. 0E/D ATAG SDS 2% Lisozima TraçoE/D ATAG 1N NaOH 100ºC, 10 min Enzima S.A. 90E/D ATAG 1N NaOH 100ºC, 10 min Lisozima 90E/D ATAG 1N NaOH 37ºC, 18 horas Enzima S.A. 0E/D ATAG 1N NaOH 37ºC, 18 horas Lisozima 40
Conclusões: Excepcional resistência das paredes celulares de C. pseudotuberculosis a tudo !!!.
Peso Molecular dos antígenos imunodominantes do sobrenadante de cultura de C. pseudotuberculosis
em ovinos-caprinos.
2025,1
31,6
39,8
63,168,1
30
55
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 4 5 6 7 8
PM
(kD
a)
Walker J. et al, 1994 Ter Laak E.A. et al, 1992 Ellis J.A. et al, 1991.2
Braithwaite C.E. et al, 1993 Sting R. et al, 1998
Peso Molecular dos antígenos imunodominantes da fração celular de C. pseudotuberculosis em
ovinos-caprinos.
20 2231,6 35,5 39,8
45,756
63
79
100
2231,5
40
64 68
120
43
0
20
40
60
80
100
120
140
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
PM
(k
Da
)
Ellis J.A. et al, 1991.2 Braithwaite C.E. et al, 1993 Sting R. et al, 1998Ellis J.A. et al, 1991.1 Muckle C.A. et al, 1992
As frações antigénicas de Corynebacterium pseudotuberculosis
Antígenos extracelulares
Frações antigénicas Peso MolecularDe 2 a 6 De 20 a 68 KDa
Antígenos fracamente ligados à parede
Frações antigénicas Peso Molecular5 (Muckle et al, 1992) 22, 31,5, 43, 64 e 68
KDa
Antígenos celulares (parede/membrana, intracelulares)
Frações antigénicas Peso MolecularDe 7 a 11 De 12 a 120 KDa
Extração dos antígenos de C. pseudotuberculosis
Autores Técnicas Resultados
Muckle et al, 1993 Sonicado 3 x 10 min. Ok
Ellis et al, 1991 Sonicado durante 15 min. Sonicado 3 min. + EE Digestão com lizozima,37C Octyl Glucoside 1%,2h,TA
Ok Ok Ok, muitos resíduos Solubilização partial
Braihwaite , 1993 Detergentes SDS, DOC,TDAB, CHAPS e NP40(1%, 60ºC, 30 min.)
Todos os detergentestêm resultados iguais
Sting et al, 1998 SDS 2%, 1 h, 100ºC. Ok
Purificação dos antígenos de C. pseudotuberculosis
Autores Técnicas Oque
Resultados
Soucek et al,1971
Precip. S.A., Etanol C. Troca Iónica
Sobrenadan
te
Purificação x 176Precip. 50% atividadeexotoxinaTroca iónica não adequada
Egen et al,1988
Diálise contra água(HPLC)
C. Isoelec. Focusing
Sobrenadan
te
3 bandas: 14, 21 e 31,7 kda14 e 21 kd não reconhecidas
Muckle et al,1993
C. Exclusão (ColunaSuperose 6)
S-Layer
4 bandas (PM ?) incluindo31,5 kda (exotoxina)
Wilson et al,1995
Precip. S. A. C. Hidrofóbica
Sobrenadan
te
Bandas 31,5 e 40 kdaBandas <20 kda:contaminantes do meio
Sonicado Separação por
gradiente de sucrose Enzimas
S-Layer (1) Extracelulares (4)Intracelulares (2)
Parede/MembranaPurificada
C.pseudotuberculosis
MassaBacteriana
Meio decultura
LavagemNaCl
ou LiCl
Extração pordetergentes/Sonicado
Centrifugação 10000 g, 15 min.
Purificação
Centrifugação100000 g, 1 hora
Bactériasinteiras
Filtração: 0,45 e 0,22 m Cromato Exclusão
Extração dosantígenos
Celulares (3)
Proposta de extração dos antígenosfracamente ligados à parede de C. pseudotuberculosis
Obtenção de células por centrifugação(10000 g, 15 min., 4ºC)
Turner M. S. et al, 1997 Muckle C. A. et al, 1992
Lavagem com volume 2 lavagens de 3 volumes deigual de NaCl 0,15 M NaCl 1 M em PBS 0,1 M, pH
7,4. Centrifugar cada lavagemResuspender em 500 l 10000 g, 10 min., 4ºC. Poolde LiCl 5M dos sobrenadantes e centrifug.
25000 g, 2 h, 4ºC.Deixar no gelo 15 min. ecentrifugar 16000 g 5 min.,guardar o sobrenadante. Diálise contra PBS 0,01 M
S-Layer (1)
Proposta de extração dos antígenosextracelulares de C. pseudotuberculosis
Obtenção do meio de cultura (BHI) porcentrifugação
(10000 g, 15 min., 4ºC)
Filtração prévia com filtro 0,45 e 0,25 m
Cromatografia de exclusão Sephacryl S-100Superfine
Extracelulares (4)
TTTeeesssttteee 111::: SSSooonnniiicccaaadddooo dddaaa bbbaaaccctttééérrriiiaaa iiinnnttteeeiiirrraaa 5 x 1, 5 x 3 , 3 x 10 min.
TTTeeesssttteee 222::: DDDeeettteeerrrgggeeennnttteeesss eee bbbaaaccctttééérrriiiaaa iiinnnttteeeiiirrraaaDetergentes: CHAPS (amfotérico)
DOC (aniónico) Concentração: 2%, 1 hora,TRITON X-100 (não iónico) a 37 ºC, sob agitaçãoSDS (aniónico: o controle)
TTTeeesssttteee 333::: SSSooonnniiicccaaadddooo eee dddeeettteeerrrgggeeennnttteeesss dddaaa bbbaaaccctttééérrriiiaaa iiinnnttteeeiiirrraaaA depender dos resultados dos testes 1 e 2, extração com
detergentes suaves em baixa concentração (1%), 37ºC, 1 hora e sonicado.
TTTeeesssttteee 444::: VVVaaannntttaaagggeeemmm dddooosss iiinnnhhhiiibbbiiidddooorrreeesss dddeee ppprrrooottteeeaaassseeeCocktail de inhibidores de proteases
TTTeeesssttteee 555::: TTTrrraaatttaaammmeeennntttooosss cccooommm aaasss pppaaarrreeedddeeesss///mmmeeemmmbbbrrraaannnaaasss pppuuurrriiifffiiicccaaadddaaasssA metodologia vai depender dos resultados dos testes 2, 3 e 4
Proposta de extração dos antígenos celulares deC. pseudotuberculosis
Celulares (3)
Esquema de vacinação: (3 coelhos por extrato) • Injeção inicial SC: 0,5 mg de proteína com adjuvante de Freund completo,• Boosts a cada 30 dias, 0,25 mg, SC (Freund incompleto) ou IV (Ag sem adjuvante)• Sangria 15 dias após cada boost.
Obtenção de soro para imunodifusão e Cromatografia de imunoafinidade
(E. Harlow and D. Lane, 1988, Weare et al, 1982)
C. Imunoafinidade ReversaFrações obtidas a partir de PAGE
NÃO DESNATURANTE
ImunodifusãoFrações antigénicas
extraídas (4)
Preparação do soro:• Aquecimento 56ºC, 30 min.• Precipitação com (NH4)2SO4 ou Cromatografia Exclusão• Resuspensão em NaHCO3 (CIAR)• Desalinização (Diálise ou Sephadex G-25) (ID)
Cromatografiade Exclusão
- Sephacryl (S-100 SF),
PAGE preparativo (sem SDS, sem Mercaptoetanol)
para Cromatografia de Imunoafinidade Reversa.
Cromatografia de ImunoAfinidadeReversa
Cromatografia de Exclusão
Purificaçãodos antígenos
S-Layer (1) Extracelulares (4)Intracelulares (2) Celulares (3)
- Dosagem das proteínas (A280, Lowry)Indicadores: - Teste de imunodifusão em gelde progresso - SDS PAGE e Imunoblot
Celulares (3)
Extracelulares (4)
PAGE não desnaturante
Bandas contaminantes
Sóro anti “Contaminantes”
Gel de Sepharose 6MBativado com Brometo
de cyanógeno+
Cromatografia de Imunoafinidade Reversa
Extração por detergentes/Sonicado
E. Celulares (3)
Controle de qualidade
LowryPAGE / Imunoblot
Outros Extratos
E. Intracelulares (2)
E. Extracelulares (4)
E. S-Layer (1)
Soro ID (4)EXTRAÇÃO
•Lowry•Soro ID•PAGE / Imunoblot
Extratos 1 e 2 Extratos 3 e 4
C. Exclusão
C. Exclusão
C. I. A. R.
PURIFICAÇÃO