8 expo sea food 2012
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Mitos y realidades de la técnica
de PCR para el diagnóstico de
enfermedades
en organismos acuáticos
I D&
Jorge Cáceres Martínez
Ensenada, B.C. Septiembre 2012
¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase
chain reaction) es una técnica de amplificación de
secuencias de ADN in vitro
ADN
Con el surgimiento de la técnica de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), sin duda
se ha dado un avance sin precedente en el encuentro del
ADN de patógenos; sin embargo, por sí misma, no
substituye al proceso de diagnóstico de enfermedades.
Cuando se detecta un episodio de mortalidad en
acuicultura, se desencadena una carrera contra el tiempo
para encontrar la causa
La presión por obtener resultados inmediatos puede
compararse con aquella que enfrenta la policía y los
políticos para encontrar a un culpable de un delito y se
toma como tal al primer sospechoso que aparece en la
escena.
¿Quién es el culpable?
PCR
¿Hay algo aquí?
Si encuentran ADN del sospechoso en la víctima, se puede
caer en el error de notificar que se tiene al culpable del
delito y condenarlo.
¿Qué?
La realidad puede ser bien diferente, el sospechoso pudiera
ser el cónyuge, hijo, pariente o cualquier otra persona que
pudo haber saludado o estornudado sobre la víctima antes
de que ocurriera el delito. Desde luego, habrá ADN de esas
personas en la víctima y no son para nada culpables.
El encontrar al culpable implica el estudio de la escena del
crimen, los antecedentes de la víctima, el perfil del
delincuente, los presuntos motivos del crimen, la existencia
de pruebas físicas, etc. Es decir, que se trata de un proceso
y no de una técnica.
Algunos casos en acuicultura
Ulrich et al. (2007) reportaron infección por
Haplosporidium nelsoni, agente causal de la enfermedad
conocida como MSX (por sus siglas en inglés,
Multinuclear Sphere X) en el ostión Americano
Crassostrea virginica y otras especies de ostión en el
Golfo de México, utilizando únicamente análisis de PCR.
Esta información amplía el rango de distribución del
patógeno y documenta nuevos hospederos; sin
embargo, el ensayo utilizado no fue validado para las
aguas del Golfo de México y si consideramos, que en los
estudios previos realizados en la zona durante más de
20 años por expertos patólogos, no se ha detectado a
este patógeno (Burreson 2008), es necesaria una
validación correcta de la información.
Respecto al virus de la mancha blanca del camarón, se
han publicado registros de falsos positivos en la
langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus
asociados con la escasa especificidad de los
iniciadores utilizados para la reacción de PCR (Claydon
et al. 2004).
Recientemente, en Canadá hubo un reporte
afirmando que la Anemia Infecciosa del Salmón
(ISA) se había encontrado en salmones de la
Columbia Británica. Esto causó un efecto inmediato
en el sector.
Canada Completes Infectious Salmon Anaemia Testing: NoConfirmed Cases in BC Salmon
December 2, 2011: The Government of Canada in collaboration with theProvince of British Columbia has completed testing all samples relatedto the suspected infectious salmon anaemia investigation in BC. Basedon the final results, there are no confirmed cases of the disease in wildor farmed salmon in BC.
Otro ejemplo interesante es el de Vazquez-Boucard et al. (2012),
quienes a través de hibridación in situ, muestran que el ostión
Japonés, Crassostrea gigas, puede acumular al virus de la mancha
blanca del camarón pero no es infectado por el mismo. Las
partículas virales se acumulan en los espacios inter-filamentos de
las branquias pero no se establecen en algún tipo de célula. Si
estos ostiones se hubieran analizado únicamente mediante PCR
podría haberse interpretado, erróneamente, que C. gigas estaba
infectado por WSSV.
Las pruebas de PCR que quieran usarse en el proceso
de diagnóstico de una enfermedad, deben ser
rigurosamente validadas con respecto a otras técnicas
y conocimientos específicos.
1.- No hay mortalidades
2.- No hay signos clínicos de alguna alteración
negativa.
3.- No hay evidencias de alteraciones fisiológicas.
4.- No hay evidencias visuales del patógeno.
5.- Nunca se ha reportado el patógeno para la zona o
la especie.
6.- Se sabe que el hospedero no es susceptible al
patógeno.
7.- Las técnicas convencionales no detectan al
patógeno.
Caso positivo por PCR, pero…
¿PRIMICIA CIENTÍFICA?
¿ESCÁNDALO SANITARIO?
ALTO!
Hay que confirmar esa
información
?
El diagnóstico de una enfermedad infecciosa es un
proceso y no una técnica; el proceso parte del
conocimiento de los conceptos básicos de la patología y su
aplicación a una situación biológica en particular. Para ello
deben de utilizarse diferentes técnicas, observaciones y
criterios que nos llevarán a la conclusión de si hay una
enfermedad infecciosa o no.
Los resultados de la aplicación de una técnica de PCR
para detectar la presencia o ausencia de un agente
patógeno en particular, deben ser evaluados e
interpretados por un patólogo especializado.
2. FTM
3. Histología
4. PCR-secuenciación
ITS, NTS
5. HIS
Caso confirmado
El objetivo sanitario, nos va a permitir definir qué técnicas o
técnica, en particular, debemos utilizar en el proceso de
diagnóstico. La propia OIE, sugiere el empleo de diferentes
técnicas de acuerdo con el objetivo buscado (OIE 2012).
1.- Vigilancia epidemiológica sobre la presencia o ausencia de
un agente patógeno confirmado en una especie susceptible
y dentro de zonas geográficas para las que se conoce la
distribución del agente patógeno y el hospedero.
+ O -
Se elegirá la técnica de mayor especificidad, sensibilidad ydisponibilidad. Típicamente, más no exclusivamente, la técnicade PCR.
Se define el tamaño de muestra, la temporalidad y frecuenciadel muestreo a partir del conocimiento del ciclo de vida delagente patógeno y del hospedero, ya sea en una producciónacuícola y/o población natural.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
~309 pb
2.- Vigilancia epidemiológica sobre el efecto del agente
patógeno confirmado en una especie susceptible y
dentro de zonas geográficas para las que se conoce la
distribución del agente patógeno y el hospedero.
Se utilizarán técnicas que permitan conocer el grado de
desarrollo de la enfermedad y el efecto en el hospedero.
Además de la técnica usada para determinar presencia o
ausencia, deberán emplearse otras que nos indiquen el
avance y efecto del proceso infeccioso. Típicamente, más no
exclusivamente, la técnica histológica. El tamaño de muestra y
su temporalidad es el mismo que en el caso anterior.
3.- Seguimiento de un brote epidemiológico de un agente
patógeno confirmado en particular en una especie
susceptible y dentro de zonas geográficas para las que se
conoce la distribución del agente patógeno y el
hospedero.
En estos casos se utilizan técnicas para determinar presenciao ausencia, técnicas para determinar su efecto en elhospedero y técnicas para determinar su efecto en lapoblación. Típicamente, más no exclusivamente, análisis enfresco y estimaciones de mortalidad.
Se dirige el muestreo de manera directa hacia la zona
afectada, se modifica el tamaño de muestra a las condiciones
prevalecientes, se aumenta la frecuencia del muestreo a
partir del conocimiento del ciclo del proceso infeccioso del
agente patógeno, ya sea en una producción acuícola o/y
población natural.
Estimación de la condición sanitaria de una especie nueva en
una localidad nueva.
Cuando no se sabe la condición sanitaria de una especie en
particular en una determinada localidad geográfica, y se requiere
iniciar una vigilancia sanitaria, lo recomendable es determinar la
carga parasitaria de la especie a vigilar y ver si alguno de sus
parásitos es potencialmente un patógeno.
Una vez correctamente identificado este presunto patógeno y su
efecto en el hospedero, desarrollar o utilizar las técnicas validadas
para establecer su vigilancia y el seguimiento de brotes.
Otro enfoque es el de aplicar la técnica de la PCR para detectar la
presencia de patógenos específicos sin considerar la distribución
conocida de tales patógenos ni la susceptibilidad del hospedero.
En este caso se va a ciegas y si se llega a detectar un patógeno
específico, su identidad y establecimiento en el hospedero
(verdadera infección) deben ser completamente demostradas.
Además, deben iniciarse estudios específicos sobre susceptibilidad
y efecto en el hospedero. La OIE define, en este sentido, lo que es
un caso sospechoso y lo que es un caso confirmado, en cualquiera
de las situaciones, se recomiendan técnicas específicas para la
comprobación del caso y la participación, en caso necesario, de
laboratorios de referencia de la propia OIE.
Interpretaciones erróneas de análisis por PCR son
especialmente controversiales en el caso de patógenos
de declaración obligatoria ante la OIE, por lo que sus
infecciones deben ser plenamente comprobadas.
Burreson (2008) hace un llamado a investigadores,
revisores y editores de revistas a ser particularmente
cautos respecto a la interpretación de este tipo de
resultados y, en su caso, mostrar las evidencias
completas y contundentes sobre el diagnóstico de
enfermedades infecciosas.
Nuevos patógenos del ostión
Confirmados por PCR
y secuenciación
GATACCATTAGGCCTTGGTTGA