Avances i nve s t i g amos en la Ptoclnccio') ele Biocombusl i l i le*

Figura 7.5. Microfotografias TEM de las carbonillas, (a) Biodiesel, (b) Diesel, (c) Pnntex-lJj (d) Vulcan.

7.3.3. Efecto del uso de biodiesel en la reactividad de la carbonilla generada La reactividad de un material de carbonoso depende de diferentes variables como son su composición, estructura, su área superficial o la presencia de cenizas. En concreto, la com-posición de las cenizas es determinante ya que puede afectar la velocidad de oxidación por la presencia de metales que pueden actuar como catalizadores.

En la Figura 7.6 se presentan los perfiles de combustión no catalizada en NOx + Oz de las diferentes carbonillas obtenidas en condiciones de reacción a temperatura programada (RTP) hasta 800°C utilizando una velocidad de calentamiento de 10°C/min. Se pudo apre-ciar que la combustión tiene lugar en un intervalo de temperatura entre 250 - 750°C según la carbonilla, y que existen diferencias en la velocidad de reacción, siendo las carbonillas diesel y biodiesel las más reactivas. Estas diferencias se pueden correlacionar con los resul-tados obtenidos de la caracterización de las carbonillas. Las carbonillas con mayor orden estructural, formadas por un mayor contenido en carbón fijo, requieren una temperatura más elevada para la oxidación. Como tendencia general, las carbonillas modelo son menos reactivas que las carbonillas reales, lo que puede atribuirse a su menor contenido en hete-roátomos (principalmente oxígeno) y/o a su mayor orden grafitico.

Por otro lado, se determinó el efecto del uso de una catalizador compuesto por cobre (fase activa), que en un estudio previo resultó ser el más efectivo para la combustión de carbo-nilla procedente del diesel convencional [25]. En la figura 7.7 se muestran los perfiles de RTP y se observa una disminución de la temperatura de inicio del proceso de combustión

| del material particulado y un aumento de la velocidad de reacción en todas las carbonillas,

| 141 | mm

l . tec io ile! uso lie Biodiesel en la Emisión de Contaminantes Atmosféricos

aunque el efecto es más significativo en las carbonillas reales. En la Tabla 7.3 se presentan los datos del parámetro T50% (temperatura requerida para oxidar el 50% de la carbonilla) que reflejan claramente la diferencia en reactividad de las carbonillas y el efecto del cataliza dor. Se observa que, en presencia del catalizador de Cu, el COz es el producto mayoritario. Los datos de selectividad de la reacción no catalizada permiten concluir que el catalizador aumenta notablemente la selectividad a CO, del proceso de combustión de la carbonilla.

100

75

Biodiesel

Diesel

400 500 Temperatura (°C)

600

Vulcan

700

Figura 7.6. Perfiles de combustión de carbonilla en NOx + 02.

En la Figura 8 se muestra los resultados obtenidos en condiciones isotermas (a temperatu-ras entre 500-525°C) en presencia y ausencia de catalizador. Se observa la mayor reactividad de la carbonilla biodiesel respecto a la carbonilla diesel, lo que se puede atribuir al mayor contenido de oxígeno y cenizas que contienen metales como Na o K (que se utilizan en el proceso de generación del biodiesel) y que pueden catalizar la reacción de combustión de la carbonilla. La presencia de estos metales en la carbonilla biodiesel fue corroborada por FRX. En presencia del catalizador de cobre se consigue, a una temperatura de 480°C, que la velocidad de oxidación de la carbonilla sea igual a la velocidad de producción de la misma, Además, se consigue también que la selectividad hacia el CO, sea del 100%.

100 í

75 Biodiesel

50 Diesel

200 300

Vuloan

4<X) 500 600 Temperatura (*C)

Figura 7.7. Perfiles de combustión de carbonilla en NOx + 02

700

'a por Cu/Al203.

mate ' 1142 | •••ism

A\anees invesrigativus en 1.1 i'roauccinn ele mncurnpustibk-s

CU/A120, - Biodiesel

Biodiesel *

Velocidad de producción

Carbonilla

* . Diesel

Printex - U

4 9 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4 5 Temperatura (°C)

*Calculada utilizando diesel como combustible. Figura 7.8. Velocidad de oxidación de la carbonilla en condiciones isotermas.

Conclusiones Este estudio ha permitido concluir que la naturaleza del combustible condiciona algunas de las propiedades fisicoquímicas y la reactividad de la carbonilla producida. Las cuatro carbonillas estudiadas (carbonilla diesel, carbonilla biodiesel, Printex - U y Vulcan) presen-taron resultados similares en la caracterización realizada por DRX, espectroscopia Raman y espectroscopia DRIF. Sin embargo, se observaron ciertas diferencias en el tamaño prome-dio de partícula y en el contenido de oxígeno y cenizas. La carbonilla biodiesel resultó más reactiva que la carbonilla diesel y que las carbonillas modelo, lo que puede ser atribuido al mayor contenido de oxígeno, a la presencia de metales con propiedades catalíticas (Na y K) y al menor tamaño de partícula.

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I J 44 J —

Avances Investiga ti vos en la Producción de Biocombustibles

C PITT U LO 8

ESTANDARIZACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS PARA LA

PRODUCCIÓN DE BIOETANOL Juan Carlos Higuita Vásquez*,

Carlos Ariel Cardona Alzate, Juan Pablo Mariscal Moreno,

Javier Mauricio Naranjo Vasco, Christian Fernando Triana Carantón

Introducción Los procesos fermentativos representan un gran componente en el creciente y rápido de-sarrollo de procesos para la producción de etanol y otros biocombustibles que, dado su potencial, hace necesario su completo entendimiento con el fin de no sólo optimizar estos procesos sino también identificar oportunidades. En este sentido, el proceso global debe ser discriminado, identificando en cada una de las etapas las características relevantes y los puntos críticos que afecten la calidad del desempeño global. Puede incluirse en estas etapas la caracterización de materias primas, las condiciones de operación, las operaciones de pre y post tratamiento y las particularidades de productos y subproductos. El correcto entendi-miento de cada una de estas etapas permitirá mediante su integración, alcanzar resultados satisfactorios y mejores rendimientos.

Una de las etapas determinantes del proceso global es la etapa de fermentación. El uso de microorganismos en la producción de bioetanol y la amplia variedad de especies nativas y modificadas usadas en la etapa de conversión y en etapas de pretratamiento de las materias primas, justifican los crecientes esfuerzos investigativos por optimizar las capacidades me-tabólicas de éstos, sea a través de técnicas clásicas de mejoramiento o modificaciones gené-ticas. Además de esto, los procesos fermentativos deben ser constantemente optimizados con el fin de maximizar el potencial de cada una de las cepas mejoradas [1].

Universidad Nacional de Colombia-Sede Maníjales, Plantas Piloto de Biotecnología y Agroindustria, Campus 'La Nubia, Manuales, AA 127, Colombia. Tel-fax: +57-68879400 Ext. 55880.E-mai!:jchigmtav@unal.edu.co

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I siantlai >n y Sdecc i"n de M ¡crourganismos tle interés para la Producción de Bioetanol

Este capítulo recopila algunas de las metodologías implementadas a nivel investigativo e industrial para manejar adecuadamente los agentes biológicos empleados en la fermenta-ción, la caracterización, las tendencias para su mejoramiento y la importancia de adelantar programas de estandarización de microorganismos. También se presentan características metabólicas de dos de los principales microorganismos utilizados a nivel industrial y los procedimientos de mayor uso para el mejoramiento de cepas con características deseables.

Al final de este capítulo se presenta un protocolo simplificado que permita establecer crite-rios para la selección preliminar de microorganismos para la producción industrial de bioe-tanol a partir de dos de los principales grupos de materias primas: compuestos azucarados y materiales lignocelulósicos.

8.1. Estandarización de microorganismos empleados a nivel industrial

Un proceso de estandarización comprende un análisis detallado de las condiciones bajo las cuales se realiza el proceso de producción de biocombustibles, que incluye el acondiciona-miento de las materias primas y del agente biológico encargado de llevar a cabo los proce-sos de pretratamiento y fermentación, las condiciones de operación, y de acuerdo con lo anterior las condiciones de productos y subproductos. La estandarización permite conocer detalladamente cada uno de los pasos que componen el proceso global y las implicaciones que cada uno de éstos tiene con el fin de garantizar condiciones estándar.

Es necesario conocer el microorganismo utilizado, para así someterlo a condiciones que no comprometan el desempeño de éste y que por el contrario permitan alcanzar los máximos rendimientos de acuerdo con sus condiciones metabólicas. Un proceso de estandarización de microorganismos conlleva una serie de medidas y técnicas, que van desde la identifica-ción taxonómica hasta las condiciones de almacenamiento. Más detalladamente pueden considerarse los siguientes aspectos:

8.1.1. Aislamiento de microorganismos Antes de poder determinar las características de un microorganismo en particular y de ser usado en una etapa de fermentación, éste debe ser aislado en un cultivo puro, libre de agentes contaminantes que afecten el proceso, disminuyan el rendimiento, consuman nutrientes y sustrato, inhiban el agente principal, etc. El procedimiento general consiste en usar un medio de cultivo sólido o líquido y condiciones de incubación tales que estimulen el crecimiento del organismo deseado y/o condiciones adversas para el crecimiento de 1 flora microbiana contaminante (e.g., proveer algún sustrato específico, emplear temperatu-ras determinadas, incluir sustancias inhibidoras, etc.). Esta técnica es conocida como cultiv

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ices "Invesngiiàvos en la Producción cíe Biocumbusabie?-

de enriquecimiento. Una vez el microorganismo deseado ha aumentado en cantidad con respecto a otros, debe ser purificado para garantizar que el cultivo contenga solamente or-ganismos del tipo deseado. La siembra de alícuotas del cultivo en medios sólidos es común-mente empleada y presenta la ventaja adicional de permitir identificar morfológicamente los cultivos de interés. La identificación es la etapa siguiente en el protocolo de estandarización de microorganismos.

8.1.2. Identificación de microorganismos Para comprobar si el microorganismo aislado y purificado es el organismo deseado, debe adelantarse un procedimiento de identificación taxonómica. Existen muchos métodos para tal fin, que se diferencian según la confiabilidad en sus resultados, la complejidad de su im-plementación y el tipo de microorganismos que puede identificar.

La identificación mediante criterios morfológicos puede realizarse a nivel macroscópico de acuerdo con el aspecto característico de las colonias del microorganismo que ha crecido en un medio de cultivo sólido, y a nivel microscópico dadas las características morfológi-cas particulares de géneros y especies de microorganismos. Las técnicas de tinción son de especial importancia para resaltar características microscópicas relevantes, especialmente la presencia de pared celular. La identificación mediante criterios bioquímicos se fundamenta en expresar las características metabólicas de un microorganismo, sea por medio de com-plejos enzimáticos o cromogénicos, detectando si alguna actividad metabòlica específica se lleva a cabo (e.g, presencia o ausencia de una determinada actividad enzimàtica, grupo de enzimas o vías metabólicas alternas, crecimiento a una temperatura específica, crecimiento en presencia de inhibidores, asimilación de diferentes fuentes de carbono, asimilación de compuestos nitrogenados, generación de CO„ etc.). Aunque los criterios morfológicos y bioquímicos se han implementado con relativo éxito durante muchos años, son métodos tediosos, prolongados y más aún dado que en la mayoría de los casos la identificación no se realiza con base a un solo método, sino a la combinación de más de uno (e.g., identificación de bacterias con base a criterios morfológicos, tinción diferencial, pruebas bioquímicas y serológicas). Así, se han introducido errores en la ubicación taxonómica mediante estas técnicas especialmente en levaduras [2], Estas dificultades se han solucionado con la aplica-ción de criterios moleculares, basados en el análisis de fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos, siendo las más utilizadas la electroforesis de cariotipo, el análisis de microsaté-lites, el polimorfismo de longitud del DNA mitocondrial, el polimorfismo longitudinal de los fragmentos de restricción del RNA ribosomal, el polimorfismo del DNA amplificado aleatoriamente y el análisis de los RNA de bajo peso molecular.

8.1.3. Almacenamiento Con el fin de preservar microorganismos de interés industrial o científico, es necesario desarrollar metodologías que permitan evitar al máximo la pérdida de viabilidad, reducir

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modificaciones genéticas que alteren las características metabólicas del organismo y, lo más importante, que garanticen su supervivencia por tiempo prolongado. En este sentido es necesario considerar los métodos disponibles para llevar a cabo la conservación, de acuerdo con el tipo de microorganismo a conservar y de los costos que genera la implementación de alguno de ellos. Adicionalmente, otras características tales como la forma y el porcentaje de recuperación y los costos de su implementación deben ser consideradas.

Los métodos tradicionalmente empleados para el almacenamiento de cultivos de microor-ganismos puros, son:

8.1.3.1. Subcultivos seriados Con el fin de obtener un cultivo de trabajo viable, los microorganismos puros son periódi-camente trasladados a medios frescos (i.e., líquidos o sólidos). Los medios de mantenimien-to sólidos son más favorables que los líquidos dado que permiten conservar los microor-ganismos por períodos de tiempo más prolongados. Algunos microorganismos pueden ser sembrados en tubos sellados con agar inclinado y conservarse por períodos cercanos a 10 años [3]. Las ventajas de los subcultivos seriados es la simplicidad y la aplicabilidad a cultivos que son sensibles a métodos de conservación más severos, pero en términos generales no es un método satisfactorio dado el elevado riesgo de contaminación, la selección no deseada de mutantes en cada resiembra, la reducción de estabilidad genética en cada repique (dege-neración) y la necesidad de confirmar periódicamente la identidad del microorganismo.

8.1.3.2. Conservación a bajas temperaturas Los cultivos mantenidos en agar inclinado pueden conservarse en un refrigerador (4 — 8°C) o en un congelador (-20°C - -80°C) y ser repicados preferiblemente en intervalos de 6 me-ses [4]. Estos períodos pueden extenderse a un año si la superficie del agar es cubierta con aceite vegetal estéril. Una buena estrategia de almacenamiento consiste en mezclar el medio de cultivo líquido con glicerol. Esta mezcla puede conservarse a temperaturas de -20°C, pero algunos laboratorios emplean temperaturas cercanas a los -80°C.

Las actividades metabólicas de los microorganismos pueden reducirse considerablemente almacenándolos a temperaturas muy bajas (-150°C a -190°C) empleando nitrógeno líquido como refrigerante. La utilización de este método en hongos, bacterias, virus, algas, levadu-ras, células animales y vegetales ha sido satisfactoria, por lo que éste puede catalogarse como el método de preservación umversalmente aplicable [4]. La mayor desventaja son sus eleva-dos costos, dada la necesidad de reponer periódicamente el nitrógeno líquido evaporado.

8.1.3.3. Liofílización En este método de conservación, se prepara una suspensión de microorganismos que es congelada y sometida a presiones de vacío, lo que resulta en la sublimación del agua celular.

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V.anees Invesiiírarivos en la Produce.c i ne Biocombust iblcs

La técnica involucra el crecimiento del cultivo de microorganismos hasta la fase estaciona-ria, la resuspensión de las células en un medio protector (leche, suero o glutamato de sodio) y su transferencia a una ampolla la cual es inmediatamente sellada después del proceso de liofilización. Se ha reportado viabilidad celular por periodos superiores a 20 años [3], pero la estabilidad del cultivo depende de muchos factores tales como el medio de crecimiento, la edad y fase del cultivo inicial, así como de la concentración celular de la suspensión uti-lizada.

8.1.3.4. Conservación en agua destilada Se conocen reportes de la implementación de este método en algunos hongos y bacterias. Los organismos en fase estacionaria conservados en un medio sólido, son resuspendidos en agua destilada estéril, el recipiente es sellado adecuadamente, mantenido a temperatura am-biente y en ausencia de luz. La adición de nutrientes y de soluciones tamponantes permite alcanzar mavor estabilidad del cultivo [5].

8.1.3.5. Recuperación de los microorganismos preservados La viabilidad de los microorganismos preservados depende de factores no sólo durante el periodo de conservación sino también en el procedimiento de recuperación. La temperatura ala cual se da la recuperación, el tipo y cantidad de medio empleado, así como la rapidez a la cual son solubilizados en el medio de recuperación, son sólo ejemplos de características por considerar. Las modificaciones generadas en los microorganismos al ser sometidos a esta serie de condiciones de estrés pueden superarse al realizar mínimo dos resiembras en medio líquido, recuperando la totalidad o parte de las características fisiológicas perdidas [3],

8.2. Principales microorganismos empleados para la producción de bioetanol

Son numerosos los microorganismos reportados en la literatura que emplean sustratos azu-carados, amiláceos y lignocelulósicos para la producción de bioetanol. Los tipos de micro-organismos más frecuentemente utilizados son levaduras y bacterias. Las técnicas de mejo-ramiento de microorganismos, sección 4, son de vital interés y están en continuo desarrollo con el fin de mejorar la economía global del proceso de obtención de bioetanol, siendo de mayor utilidad las técnicas de modificación genética, que a pesar de su gran potencial no presentan en la actualidad una aplicabilidad directa a nivel industrial. En la Tabla 8.1 se presentan los principales microorganismos productores de etanol y la gama de sustratos fermentables.

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Tabla 8.1: Principales microorganismos empleados en la producción de etanol y vía fermentativa- Í5

M I C R O O R G A N I S M O S U S T R A T O S F E R M E N T A R L E S

Saccharomyces cerevisiae Glucosa, fructosa, maltosa Schizosaccharomvces pom be Glucosa, fructosa, maltosa Klu y veromyees marxian us Glucosa Candida slieliatae Glucosa, xilosa Pichia stipitis Glucosa, xilosa Pachisolen tannophilus Glucosa, xilosa, glicerol Zvm o mon as mob i lis Glucosa, fructosa, sacarosa Clostridium thermocellum Glucosa, celulosa Thermoanaerobacter thermosaccharolvticum Glucosa, xilosa

De la tabla anterior, los microorganismos más empleados a nivel industrial son la levadu Saccharomyces cerevisiae y la bacteria gram negativa Zymomonas mobilis, esta ultima principal-mente empleada en procesos de utilización de materiales ligne ¡celulósicos.

8.2.1. Bioquímica de los microorganismos fermentadores Una de las características que debe ser tenida en cuenta es el reconocimiento de las parti-cularidades bioquímicas de la producción de etanol a partir de sustratos asimilables. Est permite conocer con cierto grado de detalle qué condiciones deben satisfacerse y los prin-cipales subproductos que van a ser obtenidos.

8.2.1.1. Fermentación de azúcares simples por levaduras y bacterias En muchos procesos de fermentación, la oxidación de azúcares simples bajo condicione anaerobias involucra dos fases: la oxidación de la glucosa y el metabolismo de piruvato. El metabolismo de la glucosa ocurre de la misma manera, tanto en la respiración aerobi como en la respiración anaeróbica y se da frecuentemente a través de la vía glucolítica d Embden-Meyerhof-Parnas o EMP. Sin embargo, si el oxígeno no está disponible para su uso como aceptor externo de electrones (como ocurre en la respiración aerobia) o e microorganismo no tiene la capacidad de utilizar componentes orgánicos alternativos tales como nitratos o sulfatos, la molécula portadora de electrones NAD+ debe ser regenerada donando electrones hacia componentes orgánicos intermediarios [6], Teniendo en cuenta las diferentes alternativas bioquímicas para la fermentación de los azúcares, se presenta a continuación una descripción de la ruta de biosíntesis de producción de etano! de dos mi-croorganismos modelo implementados y reportados en la literatura científica: S accharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis.

S accharomyces cerevisiae: la principal vía metabòlica de este tipo de microorganismo en la pro-ducción de etanol es la glucólisis o vía EMP, a través de la cual una molécula de glucosa es metabolizada y dos moléculas de piruvato son producidas. Bajo condiciones anaerobias, el

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Avances t • <\ eatjgaovns en 11 l 'rnduccion ge Biocombi mobles

piruvato es posteriormente reducido a etanol con emisiones de CO, obteniéndose un ren-dimiento estequiométrico teórico de 0,51 l g de etanol y 0,489g de CO, por l g de glucosa metabolizada. Sin embargo, se ha observado que a nivel experimental e industrial sólo se alcanza entre el 87% y el 95% del rendimiento teórico para el etanol, ya que esta levadura también utiliza la glucosa en la producción de otros subproductos, [7], En la glucólisis se producen dos moléculas de ATP, las cuales son empleadas para llevar a cabo la biosíntesis de las células de la levadura lo cual involucra una variedad de biorreacciones que requieren energía. Además, la producción de etanol está estrechamente ligada al crecimiento celular del microorganismo, lo que significa que éste debe ser generado como un subproducto. Sin el consumo continuo de ATP por parte del microorganismo que está en crecimiento, el metabolismo glucolítico se vería interrumpido inmediatamente, debido a la acumulación intracelular de ATP, causando una inhibición a la fosfofructoquinasa (PFK), una de las enzi-mas de regulación más importantes en la glucólisis. El mecanismo de producción de etanol a partir de glucosa en las levaduras se presenta en la Figura N° 1, [8],

En la Tabla 8.2 se muestran algunas otras levaduras de importancia industrial empleadas con éxito en la producción de alcohol.

Tabla 8.2: Levaduras empleadas en la producción de etanol utilizando diferentes matenasprimas.

LEVADURA RENDIMIENTO DE

ETANOL (g DE ETANOL/g DE

SUSTRATO) MATERIA PRIMA REFERENCIA

Saccharomyces cerevisiae KF-7

0.51 Desechos de Cocina [9] Saccharomyces cerevisiae LPB-SC

0.4886 Melazas de soya [10]

Pichia stipitis CBS 6054 0.4 -0.45 Mezclas de glucosa y xilosa [11]

Candida shehatae FPL- 702 0.47 Fracciones de fibra de alfalfa [12]

hsi.mdiinz.ICK11I y selección tic Microorganismos de Jnicres imj la Producción de Biocuu

Etanol

Glucosa

„ " ATP ^ HH MAO ADP

' ADH \ f,aDH

Membrana C»iu'ar dt la vadura

Citoplasma

Acetald«hido Glucosa -6 -F

\ PCI

/ PHuvato / PDC * Fructosa -6 • F- ^ jp ATP \

AOP \ I ATP

ADF Fructosa -1.6 • di - F

Enolpiruvato

BllOJ 2 - F- GHcerato

PGM MI)

ATP \ V ^ 3 • F. Gltcarato,

\ \

1.3 • di ? . Gficerato

Ghcaraidchidc - 3 -F -^ÌL^ AOP

/ GAPOH P C K \ AiJ fIAD-WII.

I UADH- li

Figura 8.1 : Ruta metabòlica de la producción de metan o! en S. cerevisiae. HK: Hexoquinasa, PG1: Fosfoglugosiomerasa, PFK: Fosfofructoquinasa, FBPA: Fructosa bifosfato aldolasa, TPI: Triosa fosfato isomerasa, GAPDH: Gliceraldehido-3-fosfato aldolasa, PGK: Fosfoglicerato quinasa, PGM: Fosfogliceromutasa, HNO: Enolasa, PYK: Piruvato quinasa, PDC:

Piruvato descarboxilasa, ADH: Alcohol deshidrogenasa

Las bacterias son consideradas en los procesos fermentativos como los microorganismos más efectivos en la producción de alcohol, ya que crecen a velocidades mayores que la S. cerevisiae y generan mayores rendimientos, por lo tanto es de importancia conocer la rut metabòlica de este microorganismo para la conversión de sustratos a etanol y otros subpro-ductos [6J. La bacteria más estudiada en este tipo procesos es la bacteria Zymomonas mobik que se presenta a continuación.

Zymomonas mobilisi este microorganismo anaeróbico gram negativo produce etanol a par-tir de glucosa por la via Entner-Doudoroff (ED) en conjunto con las enzimas piruvat descarboxilasa (PDC) y alcohol deshidrogenasa (ADH). Comparado con la vía EMP de las levaduras en la cual la enzima PFK es clave y está herméticamente regulada, en el me-canismo de producción de etanol de la Z. mobilis esta enzima no interviene, produciend sólo una molécula de ATP por molécula de sustrato consumido [6], Esto demuestra que la producción de etanol en esta bacteria está desligada de la generación de energía, lo cua se traduce en una menor producción de biomasa y una mayor producción de etanol. Se ha reportado que el rendimiento de la Z. mobilis podría ser tan alto como 97% del rendimient teórico estequiométrico etanol/glucosa, mientras que únicamente el 87 - 95% puede ser alcanzado por la S. cerevisiae. Así, como una consecuencia del bajo rendimiento de ATP, la

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Avances Investjeatívos en la Producción de Biocombusribles

Z. mobilis mantiene un flux metabòlico de glucosa más alto, y consecuentemente, garantiza una productividad de etanol más alta.

A pesar de poseer características mucho más atrayentes que la S. cerevisiae, estas bacterias poseen las siguientes desventajas [8],

• Espectro de sustrato muy específico. • Hace fermentación inestable. • Generación de muchos subproductos. • Altos costos de manipulación de esta especie.

En la Figura 8.2 se muestra el mecanismo de reacción enzimático en la producción de alco-hol por la Z. mobilis, [8].

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Figura 8.2. Ruta metabòlica de Carbohidratos en Z. mobilis, LEVU: ÍJivansacarasa, IN I H: Invertasa, GFOR: Glucosa-Fructosa oxidorreductasa, FK: Fructoquinasa, GK: Glucoquinasa,

GPDH: Glucosa-6-josfato deshidrogenasa, PGL: Fosfogluconolactonasa, EDD: 6-Fosfogluconato deshidratasa, KDPG: 2-keto-3-deoxy-6-fosfogluconato, EDA: 2-keto-3-deoxy-gluconato aldolasa, GNTK: Gluconato quinasa.

En la Tabla 8.3 se muestran algunas especies de bacterias enfocadas en la producción de etanol a partir de diferentes materias primas con su respectivo rendimiento.

I 155 I

j js iandanzacioii v Seleccn m de Mirri»urbanismos de Interes pani la Producción de Bioetanol

Tabla 8.3: Bacterias empleadas en la producción de etanol utilizando diferentes materias primas

BACTERIA RENDIMIENTO DE

ETANOL (g DE E TANOL/g DE

SUSTRATO) MATERIA

PRIMA REFERENCIA

Zvmomonas mobilis ZM4 0,51 Desechos de

fécula hidrolizados [13] Zvmomonas mobilis ATCC 31821 0,488 Fracciones de

fibra de alfalfe [12] Escherichia coli. FBR5 0,49 Cascarilla de arroz [14] Klebsiella oxytoca P2 0,3986 Maltosa [15]

Comparando el desempeño tanto de bacterias como de levaduras, se observa que la produc-ción de alcohol se ve más beneficiada por el uso de bacterias. Pero hay que considerar que algunas especies de levaduras a ciertas condiciones de fermentación mejoran su desempeño de forma notable. De esta manera, la pregunta de cuál microorganismo se debe elegir po ser más apto a nivel industrial (bacteria o levadura) tiene que ser respondida a la luz de s facilidad de manejo. La baja producción de biomasa por parte de bacterias como la Z. mo-bi/is hace necesaria la esterilización del medio de fermentación, lo cual eleva los costos de producción. Por lo tanto, se recomienda dar prioridad a un menor costo de manejo que a rendimiento de alcohol. Lo anterior conduce a que industrialmente se prefiera el uso de la S. cerevisiae sobre la Z. mobilis.

Entre las especies de levaduras mencionadas en la Tabla 8.2, se tienen aquellas que son modificadas genéticamente. El futuro del progreso en la tolerancia al etanol y el rango de posibles sustratos usados en estos sistemas de fermentación podrían mejorarse a través de técnicas de recombinación genética, como las que se muestran más adelante en este capítulo (ver Tabla 8.4).

Debido a su naturaleza procariótica, la manipulación genética en bacterias ha sido llevada a cabo con mucha más facilidad que las levaduras. Hoy en día, a través de la ingeniería ge-nética es posible obtener bacterias más versátiles que pueden producir etanol a partir de materias primas menos costosas y así reducir considerablemente los costos de producció de etanol hasta U$1.20/g. En 1993 en EE.UU. se comenzaron a desarrollar bacterias capa-ces de fermentar todos los azúcares presentes en materiales tales como los lignocelulósicos. Estos materiales son conocidos por presentar tanto hexosas como pentosas, y el reto de 1 ingeniería genética es desarrollar organismos que puedan asimilar ambos azúcares y mejora el rendimiento de producción de etanol [16],

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Avances Invcsiigaiivos en la Producción de Biocombustiblcs

8.2.2. Factores que afectan el desempeño de los microorganismos en la producción de bioetanol Anteriormente se mencionó que los rendimientos teóricos de producto/sustrato reporta-dos en la literatura no eran alcanzados debido a que los microorganismos eran sometidos a condiciones de estrés que comprometían no sólo su fisionomía sino también su metabolis-mo. A partir de esto, se ha visto que el manejo de estos microorganismos presenta ciertas dificultades, específicamente en las condiciones de medios de cultivos y del proceso de fermentación a nivel industrial. En esta sección se presentan tres de los factores más impor-tantes que afectan el desempeño de una cepa en un proceso de fermentación, y la manera como a partir de estos fenómenos se generan criterios en la selección de microorganismos que optimicen la producción de etanol. Estos factores son presentados a continuación:

8.2.2.1. Inhibición por producto A raíz del interés generado en la producción de etanol a altas concentraciones, se ha visto como este factor afecta el desempeño de los microorganismos fermentadores causando inhibición en el crecimiento microbiano y la reducción en el rendimiento producto/sustra-to. En general, una concentración de etanol mayor al 6% tiene un efecto inhibitorio sobre todos lo microorganismos. La mayoría de las cepas toleran una concentración de 5.5 % de etanol en el medio de cultivo [17].

8.2.2.2. Temperatura Algunos microorganismos tales como la Zymomonas mobilis crecen entre 25 y 40°C, con un crecimiento óptimo a 30°C. La composición y la estructura de la membrana plasmática y la concentración de fosfolípidos desmejora cuando la bacteria alcanza una temperatura de 40°C, lo cual conlleva a una pérdida de la integridad de la membrana. Posteriormente, la elevada temperatura resulta en la acumulación de etanol dentro de la célula, lo cual tiene un significativo efecto en la viabilidad de las células [17], En el caso de levaduras, como las es-pecies del género Saccharomyces, la velocidad de producción de alcohol incrementa de forma estable hasta los 30°C y de forma suave hasta los 36°C, pero disminuye a temperaturas su-periores a los 37°C. Algunas cepas son capaces de crecer a temperaturas por encima de los 37°C y son comúnmente nombradas como termofílicas, mientras que otras tienen una tem-peratura máxima superior a los 45°C y son comúnmente llamadas termotolerantes [18],

8.2.2.3. Condiciones de aireación Muchos microorganismos, tanto levaduras como bacterias, crecen en condiciones anae-róbicas y el oxígeno en exceso tiene un efecto negativo sobre la producción de etanol. En las bacterias, por ejemplo, la aireación induce la producción de subproductos incluyendo acetatos, acetaldehídos y lactatos, y además, el oxígeno tiene un efecto inhibitorio sobre el consumo de sustrato y el crecimiento microbiano. A bajas concentraciones de sustrato, las velocidades de crecimiento y el rendimiento de biomasa son independientes de la presencia

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L -.i.i]'.larizaci')n y Selección < !(• Mnr ;< ;,:• ' i¡s?ru )•• de Inlt n i> paia ia Producción de .Bioesanol

de oxígeno. De forma opuesta, a altas concentraciones de sustrato, decrecen los parámetros de crecimiento [17].

8.3. Mejoramiento de microorganismos para la producción de etanol En la sección anterior se presentaron tres de los factores que más afectan el desarrollo de los microorganismos en la producción de etanol. Un microorganismo ideal para ser utilizado a nivel industrial debe cumplir con una gran cantidad de requisitos generales y específicos, de acuerdo con las características propias del proceso de producción de etanol a partir de diferentes materias primas. Algunos requisitos generales que debe cumplir una cepa industrial son:

Posibilidad de obtener cultivos puros. Genéticamente estables. Fácil de conservar por períodos largos de tiempo. Tasa elevada de producción de formas de propagación. Tasa elevada de crecimiento en preinóculo y en fermentador. Ausencia de problemas tecnológicos durante el escalado. Producción rápida de los metabolitos de interés. Fácil separación entre el producto y el microorganismo. Producción mavoritaria del metabolito de interés. Falta de producción de sustancias tóxicas. Susceptible de mejoramiento genético.

Para la producción de etanol a partir de materiales azucarados, amiláceos o lignocelulósicos, las cepas a utilizar deben cumplir con una serie de propiedades específicas, que pueden agruparse en las siguientes necesidades:

• Consumir sustratos económicos tales como residuos agroindustriales. • Disminuir los costos de pretratamiento, consumiendo materias primas en su forma natural. • Reducir fenómenos de inhibición y pérdida de actividad durante la fermentación. • Evitar la producción de subproductos no deseados. • Disminuir los costos y procesos para la separación de biomasa.

Los microorganismos nativos usualmente producen metabolitos de importancia industrial en muy bajas concentraciones, por lo que es necesario incrementar su productividad. Aun-que mayores rendimientos pueden ser alcanzados optimizando el medio de crecimiento y las condiciones de operación, su alcance siempre estará limitado por la máxima capacidad del organismo para sintetizar el producto. Esta productividad potencial está controlada por

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Avances lnvc>m^anvos en la Producción de Biocombustibies

su genoma y por lo tanto, debe ser modificado para incrementar el rendimiento potencial [4]. En términos generales, el mejoramiento de cepas microbianas involucra la aplicación de una técnica o una combinación de estrategias que resulta en el desarrollo de nuevas cepas con fenotipos deseados [1]. Las modificaciones genotípicas hacen posible el direccionar procedimientos para conferir a los microorganismos las características mencionadas ante-riormente con el fin de potenciar su actividad metabólica. Estas nuevas habilidades pueden emplearse en la producción de bioetanol a nivel industrial a partir de diferentes materias primas. Las diversas técnicas utilizadas para aislar o inducir estas modificaciones genéticas, se describen a continuación y se presentan en la Figura 8.3.

Met. Físicas Met. Químicas

Figura 8. 3: Técnicas de mejoramiento de microorganismos

8.3.1. Técnicas de modificación genética no inducida También conocidas como técnicas de crianza clásica o de ingeniería evolutiva, hacen uso de las mutaciones naturales que se dan en un cultivo microbiano. Existe una pequeña probabi-lidad de que un cambio genético ocurra en cada momento en el que la célula se divide. Esta probabilidad será mayor cuanto menor sea el tiempo de generación del microorganismo y por lo tanto no es sorpresivo que un cultivo tienda a ser más heterogéneo a medida que transcurran las generaciones. Los mutantes que presenten las características deseadas son aislados y purificados, con el fin de corroborar sus particularidades fenotípicas y ser conser-vados. Las técnicas más aplicadas en este tipo de modificaciones son:

8.3.1.1.Tamizaje Consiste en brindar condiciones específicas en el medio de crecimiento con el fin de en-contrar microorganismos con el fenotipo deseado (variantes). Por ejemplo, los cultivos a temperaturas elevadas permiten aislar con cierto grado de probabilidad especies termotole-rantes que resistieron la 'presión' a la cual fue sometido el cultivo de microorganismos.

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Bs 1 A N d a R I Z A R L O G Y SdC;RR ' O N . dE M ic runfian i si N U : - D E i N f e r e s para la Produ ccióN. dE Miocumol

8.3.1.2. Adaptación Se emplean fases extensivas de selección, con el fin de conducir el cambio evolutivo según las características deseadas. En tiempos prolongados de cultivo, se presenta un número ele-vado de generaciones, en las cuales aparecen continuamente mutantes que pueden ser selec-cionados. Este es un método poderoso, especialmente cuando se pretende aislar fenotipos formados por determinantes multigénicos. Estas fases extensivas pueden llevarse a cabo mediante transferencias seriadas en cultivos por lotes, cultivos continuos en quimiostato o en siembras sucesivas en medios sólidos, [19].

Las técnicas de modificación genética no inducidas cobran especial atención en el aisla-miento e identificación de microorganismos de fuentes naturales. En el caso de levaduras, se estima que existen más de 600.000 especies no descritas y cerca del 10% pueden ser as-comicetos, grupo que incluye a las levaduras de uso industrial. Cobra entonces importanci adelantar procedimientos de aislamiento de microorganismos provenientes de ambientes extremos, que puedan emplearse en la producción de bioetanol.

En vista de la prolongada práctica en mejoramiento de microorganismos, las técnicas clási-cas de mejoramiento continúan siendo las estrategias más utilizadas. Una de las razones par su continuo interés es que no se requiere de un conocimiento previo de la ruta bioquímic de síntesis, transporte o regulación [1], La principal desventaja de estos métodos es que 1 adición o remoción de características fenotípicas pueden alterar el comportamiento general del microorganismo [19].

8.3.2. Técnicas de modificación genética inducida Parte del genoma del microorganismo es modificado en determinadas condiciones am-bientales (generalmente extremas) o estas alteraciones son generadas mediante técnicas de recombinación, en la cual información genética de algún microorganismo es introducido e el material genético de un hospedero, confiriéndole características fenotípicas con las cuale no contaba. Según los resultados, los procedimientos que generan modificaciones puede clasificarse en controlados y no controlados.

8.3.2.1. Técnicas genéticas no controladas 8.3.2.1.1. Mutación La mutación es un cambio hereditario en la secuencia de bases del ácido nucleico que cons-tituye el genoma de un organismo. Este cambio se puede dar de forma natural o de forrm inducida por medio de agentes mutagénicos.

Según el tipo de mecanismo, la mutación se puede dar: I) en el genoma causando un cambi en el número de cromosomas, II) en el cromosoma causando un cambio en el orden de lo: genes que se encuentran dentro, III) en el gen, conocido también como mutación puntua resultando cambios en la secuencia de bases.

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Avances Investi^ativos en la Producción de Biocombustibles

Las mutaciones utilizadas para la mejora de cepas microbianas generalmente son mutacio-nes puntuales. Una característica de las mutaciones puntuales es que se pueden revertir. Un tevertante se define como una cepa en la cual se restaura el fenotipo de la cepa salvaje que se había perdido en el mutante.

8.3.2.1.2. Agentes Mutagénicos Como se mencionó anteriormente, la mutación se puede dar de forma natural o de forma inducida. Para inducir la mutación en un microorganismo se utilizan agentes mutagénicos que pueden ser físicos y químicos.

Físicos: tanto la luz ultravioleta como las radiaciones ionizantes se utilizan para inducir mu-taciones en microorganismos. Sin embargo, los mecanismos de mutagénesis son bastante diferentes para cada tipo de radiación.

Químicos: existen una serie de agentes químicos que reaccionan directamente sobre el ADN que no se está replicando, ocasionando cambios químicos en las bases, lo que provoca un apareamiento incorrecto. Hay otros compuestos químicos cuya estructura es muy similar a la de las bases nitrogenadas, lo que les permite incorporarse al ADN durante su replicación en lugar de las correspondientes bases. Existen agentes intercalantes que causan mutaciones insertándose entre dos pares de bases del ADN y ocasionando corrimientos en el marco de lectura. Las acridinas no son muy adecuadas para el aislamiento rutinario de mutantes du-rante el desarrollo de cepas ya que tienen poco o ningún efecto mutagénico en bacterias.

8.3.2.2. Técnicas genéticas controladas 8.3.2.2.1. Fusión de protoplastos Los protoplastos son células de las que se ha eliminado la pared celular por tratamiento con enzimas. Para las bacterias se utiliza la lisozima, mientras que para hongos se utiliza quitinasa o celulasas. Los protoplastos deben ser estabilizados contra la lisis por resuspensión en un medio que contenga un estabilizador osmótico como la sacarosa. La fusión de protoplastos normalmente es rara debido a la fuerte carga negativa de la superficie del protoplasto, pero en presencia de polietilenglicol (PEG) los protoplastos se agregan y se produce la fusión acompañada por intercambio de DNA. Después de la fusión se permite la regeneración de la pared celular de tal manera que en la progenie regenerada exista un número significativo de recombinantes.

También se puede inducir la fusión mediante la aplicación de un campo eléctrico, lo que se denomina electrofusión.

8.3.2.2.2. Recombinación genética en bacterias La recombinación genética es el proceso por el cual una hebra de material genético (usual-

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Lstandanzación v Selección de Mi.:r< >< tr^am irnos ele ínteres oara ]a Producc ión de Bioetanol

mente ADN; pero también puede ser ARN) es rota y luego unida a una molécula de ADN diferente. Para que aparezcan nuevos genotipos como consecuencia de la recombinación, es esencial que las dos secuencias homologas sean genéticamente diferentes. Aparte de la fusión de protoplastos, la recombinación genética en bacterias también se puede dar cuan-do se transfieren fragmentos de ADN homólogo desde una célula donadora a una célula receptora, por uno de estos tres procesos:

Transformadon: supone que el ADN donador se encuentra libre en el medio.

Transducáón: donde la transferencia del ADN donador está mediada por un virus.

Conjugaáón-. donde la transferencia implica un contacto célula-célula y la presencia de un plásmido conjugativo en la célula donadora.

En la Tabla N° 4 se pueden observar algunos ejemplos de mejoramiento de microorganis-mos, las técnicas usadas y la característica mejorada.

Tabla 8.4: Ejemplos de mejora de microorganismos, técnicas usadas y característica mejorada.

MICROORGANISMO TÉCNICA DE MEJORAMIENTO

CARACTERISTICA MEJORADA

REFERE NCIA

H. polymorpha

Recombinación con genes de la levadura

Scw. Occidentalis SWA2

Capacidad de hidrolizar y fennentar directamente el almidón [20]

H. polymorpha Recombinación con

genes de T. reseei XYN2 v A. nieer

Capacidad de fermentar xilanos [20]

S. cerevisiae Mutación con el agente

mutagénico EMS Aumento de la tolerancia al etanol

del 10% al 12% [21]

S. cerecevisiae YPB-6

Recombinación con genes de Bacillus

subtilis y Aspergillus awamori

Capacidad de sacarificación y fermentación simultánea del

almidón [22]

S. cerecevisiae Tamizaje Termotolerancia por encima de 38°C [23]

8.4. Principales parámetros a considerar en la selección de microorganismos para la producción de etanol

Los enfoques empleados en la actualidad para mejorar la eficiencia y rendimiento de sus-tratos azucarados, amiláceos y lignocelulósicos son de tipo tecnológico y microbiològico,

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Avances mvesu^auvos eq ui r rouucc ion de rHocum-xisubi.

siendo el primero altamente dependiente del segundo. Está claro que de las características metabólicas de un microorganismo y su desempeño depende en un alto porcentaje el éxito del proceso de producción de bioetanol y que la utilización de microorganismos con ciertas características haría innecesario el uso de algunas operaciones de pretratamiento de mate-rias primas. Por lo tanto, a nivel industrial se hace necesario adelantar procedimientos en la selección de cepas de microorganismos que respondan adecuadamente a las características del proceso.

Un procedimiento de selección de microorganismos para fines determinados puede ade-lantarse de acuerdo con distintas perspectivas. El enfoque experimental, en el cual se evalúa el comportamiento de los microorganismos ante condiciones de operación (laboratorio o escala piloto) y se selecciona aquel con mejor rendimiento, es a simple vista el método más preciso y exitoso. Pero los altos costos incurridos, la duración de los análisis, las in-numerables características que afectan o favorecen el comportamiento metabòlico de un microorganismo y la necesidad de personal especializado, hacen de la experimentación una ruta poco factible para la aplicación en la industria. Por esta razón un protocolo sencillo que reduzca al máximo los costos y tiempo de experimentación es de gran utilidad mucho más en procesos de obtención de alcohol carburante a partir de una materia prima específica y con determinadas condiciones de operación.

Para una materia prima determinada, el protocolo de selección abarca posibilidades de mi-croorganismos que van desde nativos hasta aquellos que son genéticamente modificados. A pesar del gran potencial de la modificación genética, su aplicación a nivel industrial se ve restringida por la inestabilidad metabòlica del microorganismo o por su difícil adquisición. El conocimiento de las características básicas del metabolismo y fisiología de algunos micro-organismos convencionales permite establecer criterios para una selección primaria, y con esto garantizar un desempeño apropiado del proceso de fermentación a nivel industrial.

Los dos parámetros de mayor importancia para seleccionar un microorganismo son la ob-tención de rendimientos elevados en tiempos de operación cortos. Pero no son los únicos criterios a considerar, va que de acuerdo con la materia prima a emplear debe cumplirse otros requisitos. Una posible secuencia de pasos en la selección de las mejores cepas de microorganismos es presentada a lo largo de este capítulo para los tres principales grupos de materias primas.

8.4.1. Materias primas ricas en azúcares Existe gran cantidad de reportes de diversos microorganismos aptos para la producción de etanol. Pero su aplicabilidad a nivel industrial se restringe a unos pocos microorganismos, cada uno con requerimientos diferentes, rendimientos diversos y niveles de éxito desigua-les. Entre los grupos de microorganismos disponibles para la producción de etanol a gran

F:,sr.Liid;n:izii( ion v Nelectjñn ¡K: \1 :t ¡. U nu;'.i¡.I-.I11- • de Interés para la l'roLiuccióA de iSioeianol

escala se encuentran especies de bacterias y levaduras disponibles para ser implementaaas, pero que de acuerdo con sus características hace necesario establecer criterios para su es-cogencia.

Para la utilización de materiales azucarados la escogencia puede realizarse de la siguiente manera:

8.4.1.1. Levadura o bacteria Tomando como ejemplo los miembros más representativos de cada familia, es posible esta-blecer los criterios de selección. La bacteria gram negativa Z. mobilis es catalogado por Drap-cho. et. al\ como el microorganismo más efectivo para la producción de etanol [6], dadas las condiciones metabólicas particulares mencionadas en la sección 3. Pero a nivel industrial la asimilación de materias primas ricas en sacarosa conlleva las siguientes desventajas:

La presencia de sacarosa afecta el rendimiento a etanol, dado que este disacárido (y azúcares similares como la rafinosa) son empleados por la enzima levanosacarasa como iniciador en la formación del polisacárido lévano (compuesto principalmente por unidades de fructo-

Este polisacárido genera inconvenientes a nivel de proceso. Por una parte aumenta drásti-camente la viscosidad del medio de crecimiento, dificultando su manejo, y por otra genera incrustaciones en columnas de destilación y otros equipos, elevando el costo del proceso.

El nivel de producción de ácidos orgánicos ocasiona que el nivel de pH del medio se man-tenga en 4.5 durante la fermentación, haciéndolo susceptible a la contaminación microbia-na. Por lo tanto, es necesario esterilizar el medio y los equipos utilizados en la fermentación con el fin de garantizar el comportamiento de la bacteria, lo que a nivel industrial se traduce en elevados costos.

El manejo del microorganismo dado su baja tasa de producción de biomasa, hace necesario extensas rutinas de crecimiento con el fin de proveer niveles celulares adecuados para e inicio de la fermentación a gran escala.

Por su parte la levadura S. cerevisiae aparte de su milenaria trayectoria como organismo fer-mentador y el elevado grado de domesticación, no presenta las desventajas mencionadas anteriormente como restricciones principales al uso industrial de Z. mobilis. Por ejemplo:

• La presencia de sacarosa no afecta el rendimiento de etanol. • Los subproductos de la fermentación y la concentración a la cual éstos se producen, n

crean efectos colaterales como los generados por el lévano.

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Avances Imest i^aovos en la Producción de Biocombusdbies

• La elevada tasa de crecimiento bajo condiciones aeróbicas facilita el escalado del inoculo hasta las condiciones de cantidad de biomasa requerida para iniciar el proceso de fermen-tación.

Por estas razones, además de la fácil consecución de cepas de levadura a nivel comercial y su menor costo en comparación con cepas bacterianas, en la actualidad es más favorable emplear levaduras para la utilización de materias primas azucaradas.

8.4.1.2. Elección entre diferentes especies y cepas Diferentes especies están disponibles comercialmente para emplearse a nivel industrial. Las diferencias metabólicas y fisiológicas pueden ser aprovechadas para cumplir adecuadamente con los requisitos particulares de la asimilación de sustratos azucarados. La información propia de cada género, especie y cepa puede ser conocida mediante la hoja de vida propia de cada uno, conformada por la serie de reportes industriales, comerciales e industriales o a través de la experimentación a escala de laboratorio y piloto. A partir de esto, la selección debe fundamentarse en el cumplimiento de características necesarias para el aprovecha-miento óptimo según las condiciones comunes de operación. En su orden de prioridad, las características fenotípicas importantes, son:

desistencia a etanol: el etanol altera la polaridad de la membrana celular y del citoplasma cau-sando una interrupción del crecimiento a concentraciones elevadas [24] ya que se generan fugas de iones y metabolitos pequeños. La tolerancia al etanol permite al microorganismo asimilar mayor cantidad de sustrato, aprovechando al máximo la materia prima disponible. Valores promedio de tolerancia al etanol de la S. cerevisiae son 10% y 15% en volumen para crecimiento y fermentación respectivamente.

Termotolerancia: las ventajas de usar levaduras termofílicas son principalmente la reducción de costos de enfriamiento y control de temperatura, la posibilidad de remover continua-mente etanol, disminución de riesgos de contaminación y evitar detenciones del proceso por sobrecalentamiento del caldo de fermentación [24],

Osmotolerancia: los jugos de caña y principalmente las melazas presentan concentraciones considerables de sales y compuestos iónicos. Aunque algunos son de utilidad como factores de crecimiento de las levaduras, su presencia aumenta la presión osmótica del medio afec-tando principalmente el transporte de metabolitos y complejos enzimáticos a través de la membrana celular del microorganismo. Esta propiedad permite emplear melazas con mayor concentración en azúcares, reduciendo los costos de acondicionamiento.

8.4.2. Materias primas lignocelulósicas Debido a que la producción de bioetanol a partir de materiales lignocelulósicos a nivel

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Estandarización v Selcccmn de MicroorirarusiTi 'de Ínteres para !a Producción de Bioetanol

industrial no es una practica actualmente viable, los criterios de selección se fundamentan en reportes científicos, en los cuales se hace uso principalmente de microorganismos gené-ticamente modificados. Por esta razón, una estructura de selección no está tan claramente discriminada como en el caso de asimilación de materias primas azucaradas.

En la producción de bioetanol, lo más importante es determinar la materia prima que ha d ser empleada y cabe mencionar que muchos productos y subproductos agroindustriales son una excelente fuente de celulosa y hemicelulosa. Con base a la composición de la materia prima es que se sugiere un mecanismo de selección de microorganismos termentadores específicos para este tipo de procesos. Algunos productos de interés agroindustrial se mues-tran en la Tabla 8.5, [25],

Tabla 8.5: Composición química de algunos materiales lignocelulósicos (% en base seca)

RESIDUO AGRICOLA CELULOSA HEMICELULOSA LIGNINA REFERENCIA Tallo de Madera Dura 40-50 24-40 15-25 [251 Tallo de Madera Suave 45-50 25-35 25-35 T251 Hierbas 31.98 25.19 18.13 [26] Hojas 15-20 80-85 0 [26] Pulpa Papel 62 16 21 [27]

En el proceso de selección de microorganismos hay que tomar en cuenta que en la etapa de transformación de celulosa y hemicelulosa (hidrólisis) se generan azúcares tales como glucosa, lactosa, fructosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, entre muchas otras [6], La mayoría d los microorganismos tradicionales como son el caso de la S. cerevisiae son capaces de asimilar sólo los azúcares pertenecientes al grupo de las hexosas, como son, por ejemplo, la glucosa, obteniendo rendimientos como los mostrados en la Tabla 8. 2. Una configuración inicial de proceso de fermentación sugiriría dos etapas en sí. Una de ellas sólo para la fermentación de las hexosas y la otra para las pentosas, empleando microorganismos específicos par cada azúcar. Sin embargo, emplear esta configuración en el proceso incrementaría nota-blemente los costos de operación y producción de bioetanol por lo que se haría necesario implementar un microorganismo que fuera capaz de asimilar ambos grupos de azúcares. Algunos autores han sugerido levaduras como la Pichia stipitis o la Candida shehatae para 1 fermentación de materiales lignocelulósicos en donde las hexosas y las pentosas son asimi-ladas simultáneamente.

Otros microorganismos con capacidad de fermentar los dos grupos de azúcares, son la bacterias. Entre las bacterias que mejores resultados han presentado se tiene a la Zymomo-nas mobilis, Escherichia coli y a la Klebsiella oxytoca, tal y como se muestra en la Tabla N° 3. Sin embargo, y como se había mencionado a lo largo de este capítulo, mantener un medio d cultivo de una de estas bacterias, los gastos de adquisición y la estabilidad genética, son lo criterios más fuertes para negar el uso de estas bacterias a nivel industrial.

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Avances Im-esti^ativos <-'" I" Producción_jc_Bic^ombi tiblcs

]abe mencionar que estas bacterias no pueden convertir todos los azúcares per se, sino que enen que ser sometidas, en algunos casos, a alteraciones genéticas que permitan llegar al n deseado. Estas bacterias normalmente son probadas a nivel de laboratorio pero pocas

reces se obtienen resultados igualmente buenos a nivel de escala piloto y esto se debe en ;ran medida a que estas cepas se vuelven inestables en su metabolismo generando otros productos diferentes al etanol. De igual forma sucede con las levaduras, en el caso de la S. ce--evisiae algunas modificaciones han sido hechas a su metabolismo, pero su aplicación directa la industria se ha visto interrumpida por los mismos sucesos que las bacterias modificadas.

Es por ello que los microorganismos más apropiados son la Vicina stipitis y la Candida shehatae w a procesos de fermentación a partir de materiales lignocelulósicos, en donde los sustra-es son una mezcla de azúcares de grupos hexosas y pentosas, y en donde los rendimientos pe se alcazan son altos y los costos de adquisición y manejo son más bajos que las bacterias ; la estabilidad metabòlica es mayor.

De acuerdo con lo anterior, las principales características que deben considerarse al elegir jn microorgansimo, son:

• Asimilación de sustratos: el rendimiento elevado de etanol depende de la cantidad y gama de azúcares asimilables.

• Termotolerancia: los costos de pretratamiento de las materias primas lignocelulósicas es la principal limitante de su aplicación a nivel industrial. Microorganismos termotolerantes permiten implementar exitosamente integración de procesos tales como la sacarificación y co-fermentación simultáneas.

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Avances InvesOfiativos en la Producción de Biocomhusnbje^

CAPÍTULO 9

NUEVAS TECNOLOGÍAS EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE BIOMASA

LIGNOCELULÓSICA

Julián A. Quintero, Carlos A.Cardona*

Introducción La producción biotecnológica de alcohol carburante ha requerido exhaustivos esfuerzos por parte de investigadores e industriales, que buscan sobrepasar las limitantes tecnológicas involucradas en la transformación de materias primas complejas como son las de naturaleza lignocelulósica. A pesar de estos esfuerzos, aún hoy en día existen limitantes técnico-econó-micas para la implementación masiva a nivel industrial de estas materia primas y es por ello que este tema sigue siendo de alta demanda para la investigación a nivel mundial. Más aún cuando se ha percibido la influencia sobre el incremento en los precios de los alimentos que conlleva el uso de materias primas comúnmente usadas en la alimentación humana.

Los principales desarrollos tecnológicos de los últimos años en la producción de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica se han enfocado principalmente en el desarrollo de siste-mas, acondicionamiento y pretratamiento de ésta, para disponer de los azúcares fermentables a menor consumo energético, costo de capital y mayor eficiencia en el aprovechamiento de la materia prima. Igualmente, grandes esfuerzos se han hecho en el desarrollo de microorga-nismos que dispongan de la biomasa con el menor pretatamiento posible o que metabolicen los diferentes azúcares (hexosas y pentosas) comúnmente producidos en pretratamiento de la materia prima. Por otro lado, la deshidratación del etanol para su uso como carburante ha despertado el interés de muchos como consecuencia del alto consumo energético y las limi-tantes termodinámicas que involucra la separación de la mezcla etanol-agua. En este capítulo se presentan los nuevos avances tecnológicos para las tres etapas de proceso mencionadas (pretratamiento, transformación y separación) y se analiza la posibilidad de implementación a escala comercial a corto plazo.

Universidad Nacional de Colombia-Sede Maníjales, Plantas Piloto de Biotecnología y Agroindustria, Campus La Nubia, Maníjales, AA 127, Colombia. Tel-fax: +57-68879400 llxt. 55880.E-mail: ccardonaai@unal.edn.co

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[ _ a s _ T e c n u l ^ ú ^ a p a r t:i r de Biomasa LignoceluJósica

9.1. Biomasa lignoceluiósica

La biomasa lignoceluiósica consiste principalmente de tres tipos de polímeros, celulosa, he-micelulosa y lignina, los cuales se encuentran asociados uno con el otro formando una única matriz sólida que dependiendo de las proporciones que posea de cada polímero le confiere al material propiedades especiales de dureza, flexibilidad y rigidez. Además de estos políme-ros también se encuentran presentes en la biomasa pequeñas cantidades de extractivos [1],

9.1.1. Celulosa La celulosa es un polímero de cadenas lineales de unidades de (l,4)-D-glucopiranosa, uni-das por enlaces glucosídicos 1,4 de la configuración alfa, con un peso molecular promedio de alrededor de 100.000. La celulosa en las plantas conforma tanto estructuras cristalinas como amorfas. Las fibras de celulosa son en su mayoría independientes y se unen mediante enlaces de hidrógeno débiles [2],

9.1.2. Hemicelulosa La hemicelulosa es un polisacárido complejo que existe en asociación con la celulosa en las paredes de las células vegetales. Es una mezcla de polisacáridos, conformados casi exclusi-vamente por azúcares como glucosa, mañosa, xilosa, arabinosa y ácidos metil glucorónico y galacturónico. El componente dominante de la hemicelulosa de maderas duras y plantas agrícolas, como pastos y paja, es el xilano, mientras que para maderas blandas en el gluco-manano [3].

La hemicelulosa tiene un peso molecular menor al de la celulosa (peso molecular promedio de 30.000) y ramificaciones con cadenas laterales cortas que consisten de diferentes azúca-res (ver Figura 2), los cuales son polímeros fácilmente hidrolizables. La hemicelulosa sirve de conexión entre la lignina y las fibras de celulosa y le proporciona mayor rigidez a la matriz celulosa - hemicelulosa - lignina [2].

La solubilidad de los diferentes compuestos de la hemicelulosa en orden descendente es: mañosa, xilosa, glucosa, arabinosa y galactosa. La solubilidad incrementa con el aumento de la temperatura. Sin embargo, la solubilidad de polímeros de alto peso molecular no se puede predecir, debido al desconocimiento de los puntos de fusión [4], La solubilización en agua de los compuestos de la hemicelulosa comienza alrededor de 180 °C bajo condiciones neutrales de acuerdo a Bobleter [5]. Sin embargo, Garrote et al. [6] mencionan que desde 150 °C comienza la solubilización de la hemicelulosa. Otras variables como el contenido de humedad y el pH influencian la solubilización de la hemicelulosa como ha sido mostrado por otros autores [7,8]. Así, el xilano puede ser extraído muy bien en ambientes ácidos o alcalinos, mientras que el glucomanano difícilmente puede extraerse en ambientes ácidos y

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requiere un medio alcalino más fuerte que en el caso del xilano para ser extraído. Por lo que el xilano es considerado como la parte más fácil de extraer.

9.1.3. Lignina En cuanto a la lignina, ésta es un polímero aromático mononuclear altamente ramificado v sustituido que se encuentra adyacente a las fibras de celulosa en las paredes celulares de determinada biomasa, especialmente especies madereras, esta unión forma el complejo lignocelulósico [9]. Este heteropolímero amorfo consiste de tres unidades de fenilpropano (p-cumaril, coniferil y sinail) (ver Figura 3) que se sostienen entre sí mediante diferentes tipos de enlaces. El principal propósito de la lignina es dar soporte estructural a la planta, impermeabilidad y resistencia contra el ataque microbiano y otros agentes oxidantes. La lignina no es soluble en agua y es óptimamente inactiva lo que hace difícil su degradación. La lignina, al igual que la hemicelulosa, comienza a disolverse en agua alrededor de 180 °C bajo condiciones neutrales [5]. La solubilidad de la lignina en ambientes ácidos, neutros o alcalinos depende del precursor (alcoholes p-cumarllico, coniferil, sinapilico o combinación de ellos) de la lignina [10].

Entre la celulosa, la hemicelulosa y la lignina, la hemicelulosa es la más sensible a los trata-mientos termo-químico. Durante un pretratamiento termoquímico los grupos laterales de la hemicelulosa reaccionan primero, seguido de la hemicelulosa presente en la estructura [11],

En la biomasa, la celulosa es generalmente la fracción más grande, alrededor de 40-50% en peso y la hemicelulosa, alrededor de 20-40% [12,13]. Por ejemplo, el bagazo de caña de azúcar contiene 40-50% de celulosa, 20-30* de hemicelulosa, 20-25% de lignina y 1.5-3% de cenizas.

9.1.4. Etanol a partir de biomasa lignocelulósica La producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica consiste principalmente de cin-co etapas diferentes, pretratamiento, hidrólisis de la celulosa, fermentación y separación de producto y tratamiento de efluentes líquidos. El pretratamiento es necesario para mejorar la productividad y el rendimiento total de azúcares monoméricos en la etapa de hidrólisis. La conversión de hemicelulosa y celulosa a azúcares puede realizarse químicamente, mediante ácidos, o enzimàticamente, mediante la adición de celulasas. Las hexosas producidas pueden ser fermentadas a etanol fácilmente, mientras que la fermentación de pentosas es realizada sólo por algunas cepas. El problema que ocurre durante la fermentación es que el etanol producido es un inhibidor de las levaduras y bacterias que llevan a cabo la fermentación. Esto pone un límite a la concentración de azúcares fermentables [14].

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Después de la fermentación el etanol debe ser recuperado del caldo de fermentación me-diante destilación [15]. Furfural hydroximetil furfural (MHF) y otros inhibidores como (probablemente) lignina soluble pueden también generar problemas en la etapa de fermen-tación, debido a que dichos compuestos pueden inhibir o parar la fermentación [16],

Los materiales lignocelulósicos y los residuos urbanos/industriales requieren de pretrata-mientos costosos para convertirse en un sustrato fermentable [17], Los materiales que con-tienen azúcares pueden ser transformados a glucosa y posteriormente ser fermentados bajo condiciones anaeróbicas a etanol y dióxido de carbono mediante glicóüsis. La fosforilación de carbohidratos se lleva a cabo mediante la ruta metabòlica y los productos finales son dos moles de etanol y dióxido de carbono [18]. Las reacciones globales para liberar energía para la biosíntesis producen dos moles de etanol y dióxido de carbono por cada mol de glucosa consumida.

9.2. Tecnologías de pretratamiento

La presencia de lignina en el matriz de hemicelulosa y celulosa, limita el uso completo de estos dos polímeros. Para convertir estas dos moléculas ricas en energía en formas simples es necesario remover la lignina de la biomasa. Diferentes tecnologías de pretratamiento como la hidrólisis acida concentrada [19], hidrólisis acida diluida [20], tratamiento alcalino [21], tratamiento con sulfito de sodio [22,23], tratamiento con clorito de sodio [24], explo-sión a vapor [25], explosión con amoniaco [26], tratamiento con cal [27] y tratamiento con solventes orgánicos [28], han sido usadas para remover lignina y mejorar la sacarificación de la pared celular de los carbohidratos. Las tecnologías de pretratamiento generalmente usadas se pueden reunir en tres grupos dependiendo del fenómeno involucrado, éstos son: mecánicos, térmicos y químicos (ver Tabla 2).

9.2.1. Pretratamiento mecánico La molienda es un pretratamiento mecánico de la biomasa, cuyo objetivo es reducir el ta-maño de partícula y cristalinidad. La reducción de tamaño lleva a un incremento en el área superficial específica y una reducción del grado de polimerización, y a su vez estos factores incrementan el rendimiento total de la hidrólisis en la mayoría de los casos tan sólo de 5-25% (dependiendo del tipo de biomasa, molino y duración de la molienda), pero reduce el tiempo de digestión en 23-59% lo que implica un aumento en la velocidad de hidrólisis. Sin embargo, una reducción de tamaño de partícula inferior a la malla 40 tiene poco efecto so-bre el rendimiento y velocidad de la hidrólisis [29], Al no producirse inhibidores, la molien-da es apropiada para la producción de etanol. Sin embargo, ésta involucra un alto consumo energético [30,31] por lo que no es factible económicamente como pretratamiento.

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Avances Investiga ti TOS en la Producción de Biocomh ustibles

9.2.2 Pretratamiento térmico Durante el pretratamiento térmico la biomasa es calentada. Si la temperatura supera los 150-180°C, parte de la biomasa lignocelulósica, inicialmente la hemicelulosa y después la lignina, comienza a solubilizarse [5,6], La composición de la estructura de la hemicelulosa y de los grupos de ramificación determina la estabilidad térmica, ácida y alcalina de la hemicelulosa. Desde el punto de vista de los componentes dominantes de la hemicelulosa (xilano y gluco-manano), los xilanos son los menos estables, pero la diferencia respecto a los glucomananos es muy pequeña. A temperaturas superiores a 180°C comienza una reacción exotérmica (probablemente solubilización) de la hemicelulosa [32], Esta temperatura es sólo un indica-dor de la temperatura a la cual comienza la reacción exotérmica de la hemicelulosa ya que la reactividad térmica de la biomasa depende grandemente de su composición [14].

Durante los procesos térmicos, parte de la hemicelulosa es hidrolizada y se forman ácidos. Estos ácidos se presume que catalizan la hidrólisis posterior de la hemicelulosa [33], Sin embargo, Liu y Wyman [34] y Zhu et al. [35,36] exponen que existen otros factores dife-rentes a los ácidos formados in situ que juegan un rol importante en la solubilización de la hemicelulosa.

El pretratamiento térmico a temperaturas superiores de 160°C, causa además la solubiliza-ción de lignina. Los compuestos producidos son en su mayoría sustancias fenólicas v tienen en muchos casos un efecto inhibitorio o tóxico sobre las bacterias y levaduras en la fermen-tación [37], Los compuestos solubles de la lignina son muy reactivos y si no son removidos rápidamente se condensarán y precipitarán sobre la biomasa [34], También, condiciones severas de pretratamiento promueven la condensación y precipitación de compuestos so-lubles de lignina, y algunas veces incluso componentes solubles de la hemicelulosa como el furfural y el HMF [38-40],

Los pretratamientos con calor en los cuales se forman sustancias solubles de la hemicelulo-sa y la lignina existe un gran riesgo de formación de compuestos fenólicos y heterocíclicos como la vanilina, etil vanilina, furfural y HMF, especialmente en ambientes ácidos [31]. Estas sustancias son en general inhibidoras. Láser et al. [16] determinaron que para con-centraciones de sólidos superiores al 3% y temperaturas mayores a 220 °C durante un pre-tratamiento térmico de 2 minutos, la producción de etanol es casi completamente inhibida, debido a la formación de furfural. Por otro lado, se deben evitar temperaturas superiores a 250 °C durante el pretratamiento para evitar reacciones de pirólisis que comienzan a dicha temperatura [41].

9.2.2.1. Pretratamiento con vapor/explosión a vapor Durante el pretratamiento la biomasa es colocada en grandes tanques sobre los cuales se aplica vapor a alta presión y temperatura (superiores 240°C) durante unos pocos minutos.

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'•' l'i"OLICCI-¡N ile moetanoi A partir de Biomasa Ugnocclulosica

Pasado el tiempo estipulado, el vapor es liberado y la biomasa es rápidamente enfriada. El objetivo de los pretratamientos con vapor es solubilizar la hemicelulosa para hacer más accesible la celulosa a la hidrólisis enzimàtica y evitar la formación de inhibidores. La dife-rencia entre 'pretratamiento con vapor' y 'explosión a vapor' es la rápida despresurización y enfriamiento de la biomasa al. final de la explosión a vapor, lo cual provoca que el agua en la biomasa 'explote'. Durante este pretratamiento parte de la hemicelulosa se hidroliza y forma ácidos, los cuales pueden catalizar la subsiguiente hidrólisis de hemicelulosa. Este proceso, en el cual el ácido formado in situ cataliza el proceso a sí mismo es conocido como de 'autohidrólisis'. Sin embargo, la función de los ácidos probablemente no es catalizarla solubilización de la hemicelulosa, pero sí catalizar la hidrólisis de los oligómeros solubles de hemicelulosa [42],

El contenido de humedad de la biomasa influye directamente sobre el tiempo requerido del pretratamiento con vapor [41], Por otro lado, el uso de vapor a baja presión (2 bar, 120 °C), inclusive a altos tiempos de pretatamiento (300 min), no tienen un gran efecto sobre la composición de la biomasa, como fue mostrado por Lawther et al. [43] para la paja del trigo.

Los pretratamientos térmicos involucran el riesgo de producir compuestos inhibidores para la fermentación como el furfural, el HMF y sustancias fenólicas solubles. Se han planteado varias formas de minimizar los productos de degradación de la hemicelulosa durante el pre-tratamiento, los cuales incluyen la separación de la biomasa de los condensados generados durante el pretratamiento [44], manteniendo el pH entre 5 y 7 con la adición de un álcali externo [45-46] o mediante la aplicación de un pretratamiento en dos etapas. Sin embargo, aún no es claro si los altos rendimientos a etanol compensan el costo adicional de una se-gunda etapa de pretratamiento [47,48].

El efecto positivo de los pretratamientos con vapor es debido principalmente a la remoción de una gran parte de la hemicelulosa, provocando un incremento de la reactividad de las fibras de celulosa, probablemente porque la celulosa se hace más accesible a las enzimas [16, 49,50],

Algunos microorganismos pueden convertir las pentosas en etanol [51], por lo que la de-gradación de pentosas a furfural durante el pretratamiento térmico resulta en la pérdida de carbono para la producción de etanol. Durante el pretratamiento puede existir condensa-ción y precipitación de lignina soluble, haciendo la biomasa menos digestible y por ende reducir la producción de etanol.

9.2.2.2. Pretratamiento con agua líquida caliente

En este pretratamiento térmico se usa agua caliente en vez de vapor. El objetivo del agua

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