小鼠骨髓细胞染色体标本的小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察制备与观察

实验目的：实验目的：11 ．初步掌握动物骨髓细胞染色体的制备方．初步掌握动物骨髓细胞染色体的制备方

法。法。22 ．了解小鼠骨髓细胞染色体的形态特点。．了解小鼠骨髓细胞染色体的形态特点。

实验原理：实验原理： 染色体是细胞分裂时期遗传物质存在的特定染色体是细胞分裂时期遗传物质存在的特定

形式，是染色质紧密包装的结果。染色体形式，是染色质紧密包装的结果。染色体是有机体遗传信息的载体，对染色体的研是有机体遗传信息的载体，对染色体的研究在生物进化、发育、遗传和变异中有十究在生物进化、发育、遗传和变异中有十分重要的作用。分重要的作用。

核型分析均是以核型分析均是以中期染色体中期染色体为标准，对制为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图像，并将其剪裁排列即成，或用的显微图像，并将其剪裁排列即成，或用专用软件进行分析排列。专用软件进行分析排列。

凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各种处理后，细胞就可进入分裂期此时均可种处理后，细胞就可进入分裂期此时均可用于染色体分析。 用于染色体分析。

在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。此时给动物注射一定剂量的组织之一。此时给动物注射一定剂量的秋秋水仙素水仙素可使许多处于分裂的细胞停滞于中可使许多处于分裂的细胞停滞于中期（ 秋水仙素可阻断纺锤丝微管的组装），期（ 秋水仙素可阻断纺锤丝微管的组装），然后采用常规空气干燥法制备染色体，即然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可供分析的染色体标本。本方可得到大量可供分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作。 操作。

实验材料：实验材料：实验器材：离心管、低速离心机、吸管、实验器材：离心管、低速离心机、吸管、

牙签、剪刀、载玻片、显微镜等。牙签、剪刀、载玻片、显微镜等。实验试剂： 实验试剂： 100µg/ml100µg/ml 秋水仙素、秋水仙素、 0.075M 0.075M

KClKCl 、、 CarnoyCarnoy 固定液、固定液、 Giemsa Giemsa 染液、染液、 ppH6.8H6.8 磷酸缓冲液、 磷酸缓冲液、 0.85% NaCl0.85% NaCl 生理盐水、生理盐水、0.4% KCl0.4% KCl （低渗液）等。（低渗液）等。

小鼠腿一只小鼠腿一只

实验步骤：实验步骤：11 ．．秋水仙素注射秋水仙素注射 称出小白鼠的体重，然后按称出小白鼠的体重，然后按 22 ～～ 4µg/g4µg/g 体重的剂量经腹腔体重的剂量经腹腔

注射注射秋水仙素秋水仙素，， 33 ～～ 4h4h 后颈椎脱臼法处死。后颈椎脱臼法处死。22 ．．取出股骨取出股骨 取出小鼠后肢的取出小鼠后肢的股骨股骨，剔除附着的肌肉，剪去股骨两端关，剔除附着的肌肉，剪去股骨两端关节。节。

33 ．．剪碎股骨于生理盐水剪碎股骨于生理盐水 直接用手术剪将股骨剪碎于含有直接用手术剪将股骨剪碎于含有 5 ml 0.85% NaCl5 ml 0.85% NaCl 的培养的培养皿中，皿中，反复剪碎，使反复剪碎，使骨髓细胞析出骨髓细胞析出，溶液成悬液状。，溶液成悬液状。

44 ．．收集细胞收集细胞 用吸管反复用吸管反复吸打细胞吸打细胞，使细胞团块分散，转入两支，使细胞团块分散，转入两支 1.5ml1.5ml

离心管中。注意股骨碎片不要吸入离心管中。离心管中。注意股骨碎片不要吸入离心管中。 3000 rpm3000 rpm离心离心 1010 分钟收集细胞分钟收集细胞。。弃去上清弃去上清。（注意：可合并两支。（注意：可合并两支管内沉淀）管内沉淀）

55 ．室温低渗．室温低渗 加入加入 0.40.4％％ KClKCl溶液溶液 1ml1ml ，，轻微吸放混匀轻微吸放混匀细胞，然细胞，然

后将离心管在室温下后将离心管在室温下低渗低渗 20min20min 。。66 ．． CarnoyCarnoy 固定液预固定固定液预固定 低渗结束后在离心管中加入低渗结束后在离心管中加入 0.5ml Carnoy0.5ml Carnoy 固定液进固定液进

行行预固定预固定，用，用吸管轻微混匀吸管轻微混匀，可避免细胞结块，室，可避免细胞结块，室温固定温固定 55 分钟后，混匀以分钟后，混匀以 2000 rpm2000 rpm 离心离心 10min10min 。 。

77 ． ． CarnoyCarnoy 固定液重新固定固定液重新固定 弃去上清液，弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：新配制的甲醇：冰醋酸冰醋酸 (3:1)(3:1)固定液固定液 1.5ml1.5ml ，用滴管小心将细胞团，用滴管小心将细胞团块打散，继续固定块打散，继续固定 1010 分钟。分钟。

88 ．． 2000 rpm2000 rpm 离心离心 1010 分钟，留少量固定液后分钟，留少量固定液后用滴管用滴管小心将细胞团块打散，制成均匀的细胞悬液。小心将细胞团块打散，制成均匀的细胞悬液。

99．．在干净、湿冷的载玻片在干净、湿冷的载玻片上以上以高距离滴高距离滴22 ～～ 33滴上层细胞悬液滴上层细胞悬液，，气干气干或在酒精灯上或在酒精灯上文火烘干。注意在滴片时要有一定的高度文火烘干。注意在滴片时要有一定的高度（大于（大于 40cm40cm ），使细胞膜破裂后易于使），使细胞膜破裂后易于使染色体散开，并尽量使滴片上的细胞分布染色体散开，并尽量使滴片上的细胞分布均匀，不要重叠。 均匀，不要重叠。

1010 ．气干，染色。．气干，染色。 在一块洁净的玻板上，将玻片标本有细胞的一面在一块洁净的玻板上，将玻片标本有细胞的一面朝下用牙签架空于玻板上。朝下用牙签架空于玻板上。

1111 ．用滴管将配好的染液充满于玻板与载玻片之间．用滴管将配好的染液充满于玻板与载玻片之间的空隙中，的空隙中，注意注意载片上有细胞面的进行染色并在载片上有细胞面的进行染色并在滴加染液时注意排除气泡。视室温而定，染色滴加染液时注意排除气泡。视室温而定，染色 1515分钟。 分钟。

1212 ．染色后，轻轻揭起玻片，倾斜玻片在自来水管．染色后，轻轻揭起玻片，倾斜玻片在自来水管下下细水流冲洗细水流冲洗数秒，冲掉染液，擦干玻片标本底数秒，冲掉染液，擦干玻片标本底面和四周，显微镜观察和分析。面和四周，显微镜观察和分析。注意注意不要搞错沾不要搞错沾有细胞的一面。选择染色较好、较分散、形态清有细胞的一面。选择染色较好、较分散、形态清晰的细胞分裂相，进行显微观察。晰的细胞分裂相，进行显微观察。

结果与讨论：结果与讨论：绘制染色体图 ：（小鼠骨髓细胞染色体） 绘制染色体图 ：（小鼠骨髓细胞染色体）

对于小鼠骨髓细胞染色体标本的制作，一般包括以下几个要对于小鼠骨髓细胞染色体标本的制作，一般包括以下几个要点： （重点）点： （重点）

11 ．用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂．用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在分裂中期，使中期染色体停留在赤道面处。停滞在分裂中期，使中期染色体停留在赤道面处。

22 ．用低渗法使将细胞膨胀， 以至于在滴片时细胞被胀破，．用低渗法使将细胞膨胀， 以至于在滴片时细胞被胀破，使细胞的染色体铺展到载玻片上。使细胞的染色体铺展到载玻片上。

33 ．空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平，经．空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平，经 GiemsGiemsaa 染色后便可观察到染色体的图像。染色后便可观察到染色体的图像。

44 ．倒置染色法：在玻璃板上用牙签做支架，使标本载玻片．倒置染色法：在玻璃板上用牙签做支架，使标本载玻片的标本面向下放置到支架上，然后用滴管在玻璃板和标本的标本面向下放置到支架上，然后用滴管在玻璃板和标本载玻片之间滴加载玻片之间滴加 GiemsaGiemsa 染液，在操作时应注意，滴染液染液，在操作时应注意，滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。此时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。此法一是可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以法一是可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。 防止染色颗粒沉淀，影响观察。