蛋白质研究技术•蛋白质含量测定•蛋白质分子量测定•蛋白质电泳分析•蛋白质层析分析•蛋白质免疫分析•现代蛋白质研究策略

1  蛋白質定量法• Biuret  法　 銅離子在鹼性溶液中，會與蛋白質胜鏈上的

carbonyl 基結合，生成紫色的複合物 .• Lowry • UV  吸光法 : 由於各種蛋白質所含芳香族氨基酸組成不一，

它們在 280 nm 的吸光能力亦不同 • Coomassie Blue (dye binding)  法

2 分子量测定• 膠体過濾法 • 梯度電泳法 • 其他分子量測定方法 • a 超高速離心法 • b 由氨基酸序列計算分子量 • c 質譜儀分析 • d 电泳分析　

泳动率只和分子的大小有关

以电泳确定蛋白质的分子量

3 蛋白質構造與組成分析  • N- 端或 C- 端氨基酸決定 • 氨基酸組成分析 • 氨基酸定序法 •   cDNA 間推法 • Edman 直接定序法 • 短肽图譜 • 蛋白質的專一性水解 • 檢定胜汰群的方法 • 其他相關方法 • 分子消光係數 • 蛋白質分子結構分析

A 氨基酸序列测定• 蛋白质序列测定的关键步骤：

（ 1 ）氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来（化学法）： （ 2 ）正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基（衍生生色基团， HPLC 分离分析）

• N 端序列分析 N 端分析原理： Edman 降解法 N 端蛋白质自动序列仪 N 端封闭：甲酰甲硫氨酸、乙酰丝氨酸、苏氨酸

  N-端或 C-端氨基酸決定：

• C 端序列分析 C 端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，环化，进一步转化为乙内酰硫脲（ TH ）→Alkylation 烷基化修饰硫原子，形成 ATH 衍生物→酸性条件下， ATH 衍生物与 [NCS]- 反应而被裂解生成 ATH- 氨基酸，新的 C末端自动形成 TH 。

B 蛋白质序列拼接

• 用几种的方法断裂多肽样品，形成几套肽段，分别测定肽段的氨基酸序列后，根据不同裂解方法得到的肽段不同，找出不同裂解方法下具有的共同跨切口的重叠肽，可以拼接出整个多肽的氨基酸序列。

C 蛋白质测序的新方法• 用测定核酸序列的方法推测蛋白质的序

列： 以待测蛋白质为抗原免疫动物得到

相应的抗体，并以此抗体去沉淀合成这种蛋白质的多核糖体，分离出其中的 mRNA 并将它反转录成 cDNA ，通过测定 cDNA 的核苷酸序列，反推知蛋白质的氨基酸序列。

DNA

RNA(mRNA)

protein

?

蛋白质测序新方法原理

• 由蛋白質基因的核甘酸序列，可推得其 氨基酸序列，是目前最常用的定序方法

(reverse biochemistry) 。此基因一般選殖 自 cDNA 庫，在經過群殖、定序等工作，

轉譯成蛋白質的氨基酸序列後，就可進 行系統性的分析工作；通常以電腦程式

搜尋比對，例如 PC/GENE (個人電腦用 ) 或 GCG (工作站 )。

4 蛋白质分析技术

蛋白质分析技术免疫學工具的利用︰

• 若能得到蛋白质的抗体，則對此蛋白质的研究將有非常大的幫助，因為抗体的專一性很高，可做為專一性的探針，廣泛地應

用在 ELISA、免疫沉澱 或免疫轉印 上。

蛋白質的微量分析技術

总蛋白分析

总结• 单击显示 蛋白质相关研究技术