第一章 蛋白质的化学

第一节氨基酸第二节蛋白质的共价结构第三节蛋白质的三维结构第四节蛋白质的结构与功能第五节蛋白质的分离纯化和鉴定

第一节 氨基酸（ amino acid ）

一、氨基酸—蛋白质的构件分子 二、氨基酸的分类三、氨基酸的酸碱化学四、氨基酸的化学反应五、氨基酸的物理性质六、氨基酸的分析分离

一、氨基酸—蛋白质的构件分子 （一）蛋白质的水解 —→ —→ —→ —→蛋白质 蛋白胨 多肽 二肽 氨基酸 蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样

可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解 .

1 、酸水解常用 6 mol/L 的盐酸或 4 mol/L 的硫酸在 105-110℃条件下进行水解，反应时间约 20 小时。此法的优点是不引起消旋，得到的是 L-氨基酸。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。

2 、碱水解

一般用 5 mol/L 氢氧化钠煮沸 10-20 小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏；产生消旋现象，其产物是D- 型和 L- 型氨基酸的混合物。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏

3 、酶水解

应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。但水解往往不彻底，产物为较小的肽段。目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（ proteolytic enzyme ）或称蛋白酶（ proteinase ）已有十多种。最常见的蛋白水解酶有以下几种：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。

（二） α- 氨基酸的一般结构

蛋白质都由 20 种常见氨基酸（基本氨基酸）组成。氨基酸的结构通式： 19 种氨基酸具有一级氨基（ -NH3+ ）和羧基（ -COOH ）结合到 α 碳原子（ Cα ），同时结合到（ C

α ）上的是 H 原子和各种侧链（ R ）； Pro 具有二级氨基（ α- 亚氨基酸）。

L-α- 氨基酸的结构通式

COOH │

H2N — C — H │ R

从氨基酸的结构通式可以看出：1、构成蛋白质的氨基酸均为 L—α—氨基酸。2  、除 R为 H（甘氨酸）外，其余氨基酸均具有旋光性。3 、 各种氨基酸的区别在于侧基 R 基上。

氨基酸的构型：构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外，均含有 α— 碳原子，在空间各原子有两种排列方式： L— 构型与 D— 构型，它们的关系就像左右手的关系，互为镜像关系，下图以丙氨酸为例：

二、氨基酸的分类

（一）根据来源分：内源氨基酸和外源氨基酸（二）从营养学角度分：必需氨基酸和非必需氨基酸（三）根据是否组成蛋白质来分：蛋白质中常见氨基酸、蛋白质中稀有氨基酸和非蛋白氨基酸

1 、蛋白质中常见氨基酸的结构

甘氨酸 Glycine 脂肪族氨基酸（中

性）

H2N CH C

H

OH

O

氨基乙酸

主要区别在侧链 R 基的不同

氨基酸的结构

脂肪族氨基酸（中性）

H2N CH C

CH3

OH

O

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

- 氨基丙酸

氨基酸的结构

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

脂肪族氨基酸（中性）

H2N CH C

CH

OH

O

CH3

CH3

- 氨基异戊酸

氨基酸的结构

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 Leucine

脂肪族氨基酸（中性）

H2N CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

- 氨基异己酸

氨基酸的结构

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 Leucine

异亮氨酸 Ileucine

脂肪族氨基酸（中性）

- 氨基 -- 甲基戊酸

2

氨基酸的结构

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 Leucine

异亮氨酸 Ileucine

脯氨酸 Proline

亚氨基酸（杂环）HN

C

OH

O

- 吡咯烷基 -- 羧酸

氨基酸的结构

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 Leucine

异亮氨酸 Ileucine

脯氨酸 Proline

甲硫氨酸 Methionine

脂肪族氨基酸（含硫）

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

S

CH3

- 氨基 -- 甲硫基丁酸

氨基酸的结构

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 Leucine

异亮氨酸 Ileucine

脯氨酸 Proline

甲硫氨酸 Methionine

半胱氨酸 Cysteine

脂肪族氨基酸（含硫）

- 氨基 -- 巯基丙酸

氨基酸的结构

脂肪族氨基酸（碱性）

精氨酸 Arginine

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

NH

C

NH2

NH

- 氨基 -- 胍基戊酸

氨基酸的结构

脂肪族氨基酸（碱性）

精氨酸 Arginine

赖氨酸 LysineH2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

CH2

NH2

， - 二氨基己酸

氨基酸的结构

碱性氨基酸（杂环）

精氨酸 Arginine

赖氨酸 Lysine

组氨酸 Histidine

H2N CH C

CH2

OH

O

N

NH

- 氨基 -- 咪唑基丙酸

氨基酸的结构

天冬氨酸 Aspartate 脂肪族氨基酸（酸性）

H2N CH C

CH2

OH

O

C

OH

O

- 氨基丁二酸

氨基酸的结构

天冬氨酸 Aspartate

谷氨酸 Glutamate

脂肪族氨基酸（酸性）

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

C

OH

O

- 氨基戊二酸

氨基酸的结构

丝氨酸 Serine 脂肪族氨基酸（含羟基）

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

- 氨基 -- 羟基丙酸

氨基酸的结构

丝氨酸 Serine

苏氨酸 Threonine脂肪族氨基酸（含羟基）

H2N CH C

CH

OH

O

OH

CH3

- 氨基 -- 羟基丁酸

氨基酸的结构

天冬酰胺 Asparagine 脂肪族氨基酸（含酰

胺）

H2N CH C

CH2

OH

O

C

NH2

O

氨基酸的结构

天冬酰胺 Asparagine

谷酰胺 Glutamine

脂肪族氨基酸（含酰胺）

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

C

NH2

O

氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸

PhenylalanineH2N CH C

CH2

OH

O

- 氨基 -- 苯基丙酸

氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸

Phenylalanine

酪氨酸

Tyrosine

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

- 氨基 -- 对羟苯基丙酸

氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸

Phenylalanine

酪氨酸

Tyrosine

色氨酸

Tryptophan

Trp

H2N CH C

CH2

OH

O

HN

- 氨基 -- 吲哚基丙酸

按 R 基极性分类 20 种常见氨基酸

(1) 非极性 R基团氨基酸： 8种— Ala Val Leu Ile Phe Pro Met Trp

(2) 极性不带电荷 R基团氨基酸： 7种— Ser Thr Asn Gln Tyr Cys Gly

(3) 带负电荷 R基团氨基酸： 2种— Asp Glu(4) 带正电荷 R基团氨基酸： 3种— Lys Arg His

根据 R 侧链基团解离性质的不同，可将氨基酸进行分类：

1. 酸性氨基酸—— Glu ， Asp ；侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。

2. 碱性氨基酸—— His ， Arg ， Lys ；侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。

3. 中性氨基酸—— 侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电荷的氨基酸。可分为：

a) 极性氨基酸： Gly ， Tyr ， Cys ， Ser ， Thr ， Asn ， Gln ；

b) 非极性氨基酸： Ala ， Val ， Leu ， Ile ， Pro ， Phe ，Met， Trp 。

2. 蛋白质中几种重要的稀有氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有 4- 羟基脯氨酸、 5- 羟基赖氨酸、 N- 甲基赖氨酸、和 3,5- 二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。

NH

HO

COOH

4-ôÇ»ù¸¬°±Ëá

H2NCH2CHCH2CH2CHCOOH

OH NH2

5-ôÇ»ùÀµ°±Ëá

NH2

CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH

6-N-¼×»ùÀµ°±Ëá

HO

I

I

CH2CHCOOH

NH2

3,5-¶þµâÀÒ°±Ëá

3. 非蛋白氨基酸

广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结合态，但并不存在蛋白质中的一类氨基酸，大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物。

H2N-CH2-CH2-COOH H2N-CH2-CH2-CH2-COOH

- 丙氨酸 - 氨基丁酸

三、氨基酸的酸碱化学

1. 氨基酸的兼性离子形式 氨基酸的两个重要性质：氨基酸晶体的熔点 高（ 200C ）；氨基酸使水的介电常数增高。 H +H3N-C-COO-

R

氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以兼性离子形式存在。

2. 氨基酸的两性解离在不同的 pH 条件下，两性离子的状态也随之发生变化。

COO-

C HH3N+

R

-pK1'

+

H+

H+

COOH

C HH3N+

R H+

H+

+

pK2'- COO

-

C HH2N

R

pH 1 7 10 净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子 负离子 等电点 pI

在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的— NH3+ 正离子（酸）和能接受质子的— COO- 负离子（碱），为两性电解质。

OH- OH-

R—CH—COOH R—CH—COO- R—CH—COO- │ H+ │ H+ │ NH3

+ NH3+ NH2

pH < pI pH = pI pH > pI

在酸性溶液 k1’ 在晶体状态或水溶液中 k2

’ 在碱性溶液中 中的氨基酸 的氨基酸 的氨基酸 R+ R± R-

k1’ =[ R±][ H+]/[ R+] k2

’=[ R-][ H+]/[ R±] k1

’ 和 k2’ 分别是— COOH 和 +H3N— 的表观解离常数。

表观解离常数可用测定滴定曲线方法求得（拐点）。

当 [ R±]=[ R+]时， pH=p k1’ , 当 [ R±]=[ R-]时， pH=p

k2’

丙氨酸的解离：

N+H3 N+H3 OH-

[ Ala ] [H+] H3C C COOH H3C C COO- + H+ K’1= [Ala+] H H Ala+ Ala

N+H3 NH2 OH-

[Ala-] [H+] H3C C COO- H3C C COO- + H+ K’2= [Ala ] H H

Ala Ala-

K´1 、 K´2 分别代表α-COOH 和 α-NH3+ 的表观解离常数，若侧链 R基有可解离的基团，其表观解离常数用 K´R表示。

酸性溶液中

两性离子状态

丙氨酸的滴定曲线：

1.0 0.5 0 0.5 1.00

7

13

pK´1=2.34

pI=6.02

pK´2=9.69

Ala+Ala+ Ala

Ala

Ala Ala-

Ala-

A

B

p H

HCl NaOH

丙氨酸的滴定曲线

当 1mol/L 的丙氨酸溶于水时，溶液的 pH约为 6，此时丙氨酸为两性离子状态 Ala

物质的表观解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。

利用 Handerson-Hasselbalch公式

pH= pk’+ ㏒ [质子受体 ]/[质子供体 ]，

已知 pk1’ pk2

’ ，可求出任一 pH 下一

种氨基酸的各种离子的比例。

氨基酸的等电点（ isoeletric point ）及其计算氨基酸的等电点：当外液 pH 为某一 pH 值时，氨基酸处于兼性离子状态，氨基酸分子中少数解离时，所含的 -NH3

+和 -COO-数目正好相等，即氨基酸净电荷为 0 。氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动，这一 pH 值即为氨基酸的等电点，简称 pI。

氨基酸等电点的计算：侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的 pK’1和 pK’2的算术平均值： pI = (pK’1 + pK’2)/2

同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其 pI 值也决定于两性离子两边的 pK’值的算术平均值。

酸性氨基酸： pI = (pK’1 + pK’ R-COO

- )/2

硷性氨基酸： pI= (pK’2 + pK’R-NH2 )/2

对侧链不解离的氨基酸，如 Gly

k1

’ =[ R±][ H+]/[ R+] k2’=[ R-][ H+]/[ R±]

在 pI， [ R-]=[ R+] k1

’ .k2’=[ H+]2 pH=（ pk’1+pk’ 2 ） /2=pI

COO-

C HH3N+

R

-pK1'

+

H+

H+

COOH

C HH3N+

R H+

H+

+

pK2'- COO

-

C HH2N

R

对侧链解离的氨基酸，如 AspAsp+ Asp± Asp- Asp ＝

k1 k2 k3

在 pI时，主要以 Asp±存在， [Asp-]和 [ Asp+] 很小且相等， [Asp ＝ ]可忽略。k1’ =[ Asp±][ H+]/[ Asp +] k2

’=[ Asp -][ H+]/[ Asp±] pI=（ p k’1+p k’ 2 ） /2如 LysLys++ Lys+ Lys± Lys- k1 k2 k3

在 pI时，主要以 Lys±存在， [Lys -]和 [Lys +] 很小且相等， [Lys++]可忽略。 pI=（ pk’2+p k’ 3 ） /2

二十种氨基酸的 pK ，及等电点

3. 氨基酸的甲醛滴定．

pK'2 H+

COO-

CH2

NH2

COO-

CH2

NH3+

+

COO-

CH2

NHCH2OH

HCHO

HCHOCOO-

CH2

NH(CH2OH)2

用途：可以用来直接测定氨基酸。（滴定终点由 12 左右移至 9 附近 , 即酚酞的变色区域 )

羟甲基衍生物

等电点 :1. 某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的 pK值和的一半。

2.在氨基酸等电点以上任何 pH ， AA 带净的负电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电点以下任何 pH ， AA 带净的正电荷，在电场中向阴极移动。

3.在一定 pH范围中，溶液的 pH离 AA 等电点愈远， AA带净电荷愈多。

四、氨基酸的化学反应

COOH

C HH2N

R

亚硝酸盐反应烃基化反应酰化反应脱氨基反应西佛碱反应

成盐成酯反应成酰氯反应脱羧基反应叠氮反应

侧链反应

四、氨基酸的化学反应1 1

与茚三酮反应

与茚三酮反应

用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。

CC

CO

O

O

茚三酮C

CC

O

O

OH

OHH2O

H2O水合茚三酮

+NH3

弱酸

紫色

脯氨酸与茚三酮反 应的产物：

N+

黄色化合物

四、氨基酸的化学反应 2

2

成肽反应

成肽反应

用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。

H2N C

R1

H

C OH

O

H N

H

C COOH

R2

H

+H2O

N

H

C COOH

R2

H

H2N C

R1

H

C

O-

ëļü

四、氨基酸的化学反应

AADNFB+ 多肽 蛋白

3

、

与2

、4-

二硝基氟苯反应-- 用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质 NH2末端

氨基酸 .亦称 Sanger反应

弱碱 DNP-AADNP-多肽DNP- 蛋白

+ HF

酸解

DNP-AA （有机相） + 游离 AA （水相）

（黄色）黄色

四、氨基酸的化学反应

4

、

与苯异硫氰酸酯反应

用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质 NH2末端氨基酸 .亦称 Edman反应

弱碱 AAPITC+ 多肽 蛋白

AAPTC—多肽 蛋白硝基甲烷中

与酸作用

PTH-AA + 少一个 AA 的多肽或蛋白（乙酸乙酯）

Edman （ 苯 异 硫 氰 酸 酯 法 ） 反 应

N H 2 C H C

O

R 2

N C S N H C H C

O

R 2

N C H C

O

R 1

H

H

N

H

S :C

C H C

O

R 1

H N N H C H C

O

R 2

SN

H

C

N H OC

R 1

C H

N

CO C H

N H

SC

R 1

PTH-AA

四、氨基酸的化学反应

55

、与丹磺酰氯反应

、与丹磺酰氯反应

用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质 NH2末端氨基酸 .

DNS +

AA 多肽 蛋白

弱碱DNS-

AA 多肽 蛋白酸

DNS-AA + 游离 AA（乙醚抽提，有荧光）

N(CH3)2

SO2Cl

H2N CH C

R O

HN CH C

R O

SO2

N(CH3)2

+

Ë®½â

N(CH3)2

SO2 HN CH C

R O

OH

+ °±»ùËá

µ¤»Çõ£ÂÈ

¶àëÄN-¶Ë

µ¤»Çõ£N-¶Ë°±»ùËá

µ¤»Çõ£°±»ùËá

6

．侧链基团的化学性质

巯基（ -SH ）的性质

羟基的性质

咪唑基的性质

(1) Millon反应：检测 Tyr 或含 Tyr 的蛋白质的反应。 Millon试剂：汞的硝酸盐与亚硝酸盐溶液。 产物：红色的化合物。(2) Folin反应：检测 Tyr 或含 Tyr 的蛋白质的反应。 Folin试剂：磷钼酸、磷钨酸混合溶液。 产物：蓝色的钼蓝、钨蓝。(3) 坂口反应：检测 Arg 或含 Arg 的蛋白质的反应。 坂口试剂： α—萘酚的碱性次溴酸钠溶液。 产物：砖红色的沉淀。

侧链反应（颜色反应）：

(4) Pauly反应：检测 His 、 Tyr 及含 His 、 Tyr 蛋白质的反应。

试剂：对氨基苯磺酸盐酸溶液、亚硝酸钠、碳酸钠混合溶液

产物：橘红色的化合物。

(5) 乙醛酸的反应：检测 Trp 或含 Trp 蛋白质的反应。

当 Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中叠加时，产生分层现象，界面出现紫色环。

(6) Cys 的反应： Cys 或含 Cys 蛋白质与亚硝基亚铁氰酸钠在稀氨的溶液中，产生一种红色的化合物。

蛋白质的化学修饰：是指在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂（称化学修饰剂）起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。

五、氨基酸的物理性质

除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性 -碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。

1.1. 氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性

2. 氨基酸的光吸收 构成蛋白质的 20 种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区 (<220nm) 均有光吸收。

在近紫外区 (220-300nm) 只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。

酪氨酸的 max＝ 275nm ，苯丙氨酸的 max＝ 257nm ，

色氨酸的 max＝ 280nm.

3. 高熔点4. 一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。

5. 氨基酸一般有味

六、氨基酸的分析分离纸层析（分配层析的一种）分配柱层析分配薄层层析离子交换层析气液层析高效液相层析

作业 :1. 按 R 基团的极性 ( 非极性 , 极性不带电荷 ,极性带负电荷 , 极性带正电荷 )对 20 中常见氨基酸进行分类 , 分别写出各氨基酸的结构式及三字符 .

2.计算下列溶液的 pH值 :(1)0.1mol/L Gly 与 0.05mol/L NaOH 的等体积混合液 .(2) 0.1mol/L Gly 与 0.05mol/L HCl 的等体积混合液 .