实验二 实验二 SDSSDS －－ PAGEPAGE 测定蛋白质 测定蛋白质 相对分子质量 相对分子质量

实验二 实验二 SDSSDS －－ PAGEPAGE 测定蛋白质 测定蛋白质 相对分子质量 相对分子质量

【【目的要求目的要求】】

学习 SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

掌握垂直板电泳的操作方法。

运用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量及染色鉴定。

【【实验原理实验原理】】

电泳 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。PAGE PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（ PAG）是由单体单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂交联剂甲叉双丙烯酰胺 (Bis)在加速剂加速剂四甲基乙二胺 ((TEMED)) 和催化剂催化剂过硫酸铵 (AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为 PAGEPAGE。 PAGEPAGE具有电泳和分子筛的双重作用。

CH2=CH

C=O

NH2

丙烯酰胺丙烯酰胺

N,N, N’-N’- 甲叉甲叉

双丙烯酰胺双丙烯酰胺

CH2=CH

C=O

NH

CH2

NH

C=O

CH2=CH

聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺

CH2-CH

C=ONH2

CH2-CH

C=O

NH

CH2

NH

C=O

CH2-CH

CH2¯ CH

C=O

NH2

CH2-CH

C=ONH2

CH2-CH

CH2-CH

CH2-CH

C=ONH2

CH2-CH

CH2-CH( )n

( )n

( )m

( )m

PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变改变 AcrAcr 浓度或浓度或 AcrAcr 与与 BisBis 的比例可以得的比例可以得到到不同孔径的凝胶。不同孔径的凝胶。

PAGEPAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统连续系统电电泳体系中泳体系中缓冲液 pH值与凝胶中的相同 . 带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应靠电荷和分子筛效应。不连续系统中不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还还具有浓缩效应具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS和含有巯基乙醇的样品处理液， SDSSDS是一种很强的阴离子表面活性阴离子表面活性剂剂，它可以断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。

【【 SDS-PAGESDS-PAGE 基本原理基本原理】】

强还原剂巯基乙醇强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与 SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质蛋白质 --

SDSSDS

复合物复合物。。

蛋白质分子结合结合 SDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。

有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDSSDS和巯基乙醇巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的 MW。

将已知分子量的标准蛋白质标准蛋白质在 SDS-PAGESDS-PAGE 中的电泳迁移率对分子量的对数作图对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。

当蛋白质的分子量在 17,000～ 165,000之间时， 蛋白质蛋白质 -SDS-SDS 复合物复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：

lgMW = K - bmlgMW = K - bm

浓缩效应浓缩效应浓缩胶（大孔胶大孔胶）

浓缩胶缓冲液 pH6.7 Tris-pH6.7 Tris-

HClHCl, 电极缓冲液 pH8.3pH8.3

Tris-Gly Tris-Gly

解离度 ： Cl> 蛋> Gly

mclcl>m 蛋蛋>mGlyGly

凝胶中 Cl －为快离子， Gly －为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。

缓冲液缓冲液

样品样品

浓缩胶浓缩胶

分离胶分离胶

SDS-PAGESDS-PAGE 过程有浓缩效应和分子筛效应过程有浓缩效应和分子筛效应

浓缩效应浓缩效应

样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应 ( 缓冲液缓冲液 pH8.3pH8.3)

蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。

缓冲液 缓冲液 样品样品 浓缩胶浓缩胶

分离胶分离胶

浓缩效应浓缩效应

样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应 ( 缓冲液缓冲液 pH8.3pH8.3)

蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。

缓冲液 缓冲液 样品样品 浓缩胶浓缩胶

分离胶分离胶

浓缩效应浓缩效应

样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应 ( 缓冲液缓冲液 pH8.3pH8.3)

蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。

缓冲液 缓冲液 浓缩胶浓缩胶 样品样品

分离胶分离胶

浓缩效应浓缩效应

样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应 ( 缓冲液缓冲液 pH8.3pH8.3)

蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。

缓冲液 缓冲液 浓缩胶浓缩胶 样品样品

分离胶分离胶

分子筛效应分子筛效应

蛋白质样品进入分离胶（小孔小孔胶胶）后 pH增大 (pH 8.9 pH 8.9

Tris-HC1Tris-HC1) ， Gly －解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。

缓冲液缓冲液

浓缩胶浓缩胶

分离胶分离胶

分子筛效应分子筛效应

分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。

缓冲液缓冲液

浓缩胶浓缩胶

分离胶分离胶

【【操作方法操作方法】】１、安装１、安装夹心式垂直板电泳槽 1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿

用手接触灌胶面的玻璃。3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面

对上贮槽。4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手对角

线的方式旋紧螺丝帽。5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙加入

已融化的 1%琼脂。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡。

11 ）分离胶的制备）分离胶的制备（（按表按表 3-23-2 配制配制 10%10% 的分离的分离胶胶））

将制备的分离胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约 1cm 。用 1

mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水 , 用于隔绝空气，使胶面平整。约 30-60 min凝胶完全聚合 . 将贮槽的蒸馏水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液。

22 、、凝胶的制备凝胶的制备

将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，距短玻璃上缘 0.5cm，然后插入样品槽模板 .在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置 30 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，放出蒸馏水，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约 0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。

22 ）浓缩胶的制备（）浓缩胶的制备（按表按表 3-23-2配制配制 3%3% 的浓缩胶）的浓缩胶）

33 、蛋白质样品的处理、蛋白质样品的处理

11 ）标准蛋白质样品的处理）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒: 兔磷酸化酶 B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于 200µl 样品溶解液样品溶解液中，沸水浴中加热 3-

5min后上样。

b)称制备样品制备样品 1mg1mg，按 1mg/mL溶液比例加样品溶解 液，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子在沸水浴中加热 3min，取出冷却后加样。

22 ）待测样品处理）待测样品处理

a)称 11 、、 22 、、 33 号待测样品号待测样品各 1mg，按 1mg/mL

溶液比例加样品溶解液，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子，在沸水浴中加热 3min，取出冷却后加样。

将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为 10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至 20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框 1cm时，停止电泳，关闭电源。

55 、、电泳电泳

44 、加样、加样

用移液器分别取 10 l 样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。并做好标记。做好标记。

Staking gel

Separating gel

77 、 结果处理、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离 (cm)以及各蛋白质样

品区带中心与加样端的距离 (cm)，按下式计算相对迁移率mR：

相对迁移率 mR=

蛋白质样品迁移距离 (cm)溴酚蓝区带距加样端距离 (cm)

66 、染色与脱色、染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色 1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。

撬开短玻璃板

【【注意事项注意事项】】

1 ）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。

2 ）用琼脂封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。

3 ）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。

【【思考题思考题】】

1 、在样品溶解液中 SDS、巯基乙醇、甘油及溴酚兰的作用分别是什么？

2 、电极缓冲液中甘氨酸的作用 ?

3 、在 SDS-PAGE中 , 分离胶与浓缩胶中均含有 TEMED

和 AP,试述其作用 ?

4 、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟 ?