第十六章
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第十六章. 抗生素类药物的分析. 第一节 概述. 一、抗生素药物的定义和特点. 定义：抗生素 是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。. 抗生素的来源：. 1. 生物合成（发酵）. 2. 化学合成或半合成. 特点：. 同系物多异构体多降解物多. 1. 化学纯度较低. 2. 活性组分易发生变异. 3. 稳定性差. 二、抗生素的分类. 分类 （按结构与性质）： β – 内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、多烯大环类、多肽类、苯烃胺类、蒽环类、其他抗生素类. 三、抗生素药物的细菌耐药性. 耐药性的种类；耐药的机制. - PowerPoint PPT Presentation
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第十六章
抗生素类药物的分析抗生素类药物的分析
第一节 概述一、抗生素药物的定义和特点
定义：抗生素是指在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。抗生素的来源：
1. 生物合成（发酵） 2. 化学合成或半合成
特点：1. 化学纯度较低
同系物多异构体多降解物多
2. 活性组分易发生变异
3. 稳定性差
分类（按结构与性质）：
β– 内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、多烯大环类、多肽类、苯烃胺类、蒽环类、其他抗生素类
二、抗生素的分类
三、抗生素药物的细菌耐药性
耐药性的种类；耐药的机制
抗生素质量的复杂性
产品稳定性差 分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用
发酵过程不易控制易受污染
生产工艺复杂
四、抗生素药物的质量分析
（二）检查：
（一）鉴别：官能团的呈色反应
光谱法、色谱法、生物学法
1. 影响产品稳定性的指标：水分
2. 控制有机和无机杂质的指标3. 与临床安全性密切相关的指标 : 异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌
4. 其他检查项目
( 三 ) 含量或效价测定（一）微生物检定法 : 管碟法和浊度法
测定抗生素抑菌或杀菌的能力，结果以效价表示
优点 1 、与临床效果一致2 、灵敏度高3 、干扰物质少
缺点 1 、操作繁琐2 、培养时间长2 、测定误差大
（二）理化方法以理化方法测定主药含量优点1.专属性强
2.准确度高3. 简单、快速
不一定代表生物效价缺点
（三）抗生素活性表示方法
N
SCH3
CH3
COOHO
HN 12
34
56
7
RCO
6-母核（ 氨基青霉烷酸）
第二节 β– 内酰胺类抗生素
青霉素类
CON
S
O
HN
COOH
CH3
CH3CH2
青霉素
（青霉素 G 、苄青霉素）
头孢菌素类
7 6
54
3
21
NO
NHS
CH2R1
COOH
7- �母核（ 氨基头孢菌烷酸）
RCO
N
S
O
HN
COOK
CH3
CH3OCCH2
酸性
结构与性质一、
Na
与碱金属 (Na+ 、 K+) 成盐
（一）羧基
易溶于水
与有机碱 ( 普鲁卡因 ) 成盐 难溶于水
普鲁卡因青霉素
C2H5 2NCH2CH2OOC
N
S
O
HN
COOH
CH3
CH3OCCH2
NH2
N
S
O
1 2
34
567
（二）旋光性
87 6
54
3
21
NO
S
头孢菌素类 C6 C7
青霉素类 C3 C5 C6
（三）紫外吸收特性
N
S
O
头孢菌素类 母核有共轭体系
青霉素类 母核无明显 UV
多数有苯环取代基
NO
S
（四） β– 内酰胺环
水溶液 不稳定 干燥纯净 稳定
不稳定性因素四元环张力大
酰胺键易水解
（某些金属离子）（温度）
失效降解
青霉素类 酸、碱、青霉素酶 某些氧化剂
例 青霉素的降解反应
青霉素
青霉噻唑酸H2O/OHˉ
青霉素酶
青霉酸H2O
pH2 100℃
α– 青霉噻唑酰基羟胺酸
NH2OH
青霉烯酸pH4
青霉胺
CO2
青霉醛HgCl2
失效降解
头孢菌素类 酸、碱、胺类 内酰胺酶
( 头孢噻吩钠水溶液 25 24h℃ 失活 8%)
色谱法（一）
1 、 TLC 法
对照品对照法
和斑点颜色比较供试品对照品 相同条件
fR
2 、 HPLC 法
Rt比较供试品对照品 相同条件
二、鉴别试验
1 、 IR 法117401815
cm~V OC116901710
cm~V OC
β- 内酰胺环
酰胺
（二）光谱法
2 、 UV 法
A,Emin,max,, %cm
光谱图
样品、分解产物
头孢氨苄 λmax = 262nm
青霉素 V 钠 A280nm/A264nm = 1.30～1.50
苯唑青霉烯酸苯唑青霉素 H
Cu2
+ nmA
NO
CONH
CH3N
O
S
CH3
CH3
COONa
NO
CH
CH3
OC O
CN
HN
CH HCCH3
CH3
SH
CH COOH
Cu2+ pH3.8△
（三）呈色反应1. 羟肟酸铁反应 β-内酰胺类
NaOH HClNOHH内酰胺类
呈色
羟肟酸衍生物
Fe3+/3H+
N
S
ON
S
CO H
NHOH
N
S
C H
NH
OFe3+3
O
NH2
CON
S
O
HN
COOH
CH3
CH3CH2
2. 茚三酮反应
蓝紫色氨基 茚三酮 △
α- 氨基、伯胺某些羟基胺类 酮式
烯醇式
茚三酮
茚三酮
缩合
蓝紫色
+
H2O
C NCH2R
C OH2
R
CHH2N COOH2
OHC
CO
CO
C
OH
NH2C
CO
CO
CO
C
OH
CNC
CO
CO
CO
C
OH
CHRNC
CO
CO
CO
3. 与重氮苯磺酸反应 : 酚羟基
S
N
OH
CONHCHCONHH5C2
O O
NN
OCOOH
CH2S N
NN
N
CH3
NClNNaO3SOH
（偶合）
N
NN
N
CH3
S
N
OH
CONHCHCONHH5C2
O O
NN
OCOOH
CH2S
NNNaO3S
（四）各种盐的反应
1.K+、 Na+ 反应
2.重氮化 - 偶合反应
青霉素普鲁卡因普鲁卡因青霉素 H
重氮化 -偶合反应
红
三、特殊杂质检查
1 、聚合物：分子排阻色谱法
凝胶色谱柱－分子筛机制，色谱柱采用亲水硅胶、凝胶或葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶；流动相为水或缓冲液
如：头孢他啶聚合物的测定
固定相：葡聚糖凝胶 G-10（ 40120µm ） 流动相 A ： 3.5%硫酸铵的 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 流动相 B ：水 检测波长： 254nm
对照品溶液：头孢他啶对照品 100µg/ml
系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用 1mg/ml
蓝色葡聚糖 2000、流动相 A 测定；重复性用对照品溶液、流动相 B 测定。 N 不低于 900，拖尾因子 <2，峰面积的 RSD应小于 5.0%。测定方法：进样供试液，用流动相 A ；进样对照液，用流动相 B 。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过 0.3%。
2 、有关物质和异构体 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查反相 HPLC
法 固定相： ODS；流动相： 0.2mol/L磷酸二氢铵 -
甲醇（ 62:38 ） 3 、吸光度 杂质吸光度、药物吸光度4 、有机溶剂 气相色谱法测定溶剂残留量5 、结晶性 偏光显微镜法和 X射线粉末衍射法
内标法＋校正因子外标法
特点
快速、高效、灵敏
专属性强、重现性好
一法多用（鉴别、检查、含测）
四、含量测定
反相高效液相色谱法
第三节 氨基糖苷类抗生素
氨基糖苷苷元氨基糖 缩合
链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、巴龙霉素等
NH C
NH
NH2
HO
OH
OHNHCH2N
NH
O
O
CH3
OH
CHO
O OCH2OH
OH
OHNH
CH3
链霉胍 链霉糖 N-甲基 -L-葡萄糖胺
链霉素
化学结构
R
O
C R1R2HN
NH2
O
OH
H2N
NH2
O
O
OH NHCH3
OH
CH3
绛红糖胺 2-脱氧链霉胺 加洛糖胺
N-甲基 -3-去氧 -4-甲基戊糖胺
庆大霉素
庆大霉素 C 复合物 庆大霉素 C1 R=H R1 、 R2=CH3
庆大霉素 C2 R=R2=H R1=CH3
庆大霉素 C1a R 、 R1 、 R2=H
庆大霉素 C2a R=CH3 R1= R2=H
性质：1. 碱性 多与硫酸成盐
2. 溶解性
3. 旋光性
4. 苷的水解和稳定性：酸性、碱性均易水解
链霉素 pH5～ 7.5 ；庆大霉素 pH2～ 12 稳定
5. UV ：链霉素 :230nm 、庆大霉素等无
二、
鉴别试验
茚三酮反应（一）
蓝紫色庆大霉素链霉素 茚三酮
△
羟基胺结构
（二） Molisch 试验
具有五碳糖或六碳糖结构
H+
糠醛或羟甲基糠醛
α-萘酚 蒽酮
红紫色 蓝紫色
N-甲基葡萄糖胺反应（三）
甲基葡萄糖胺庆大霉素链霉素 水解 N
乙酰丙酮 OH-
吡咯衍生物
对二甲氨基苯甲醛 H+
樱桃红色
（ Elson-Morgan 反应）
NH
CH3NH
NH
NH C NH2HO
OHOHNHCH2N
O
O
CH3
OHCHO
O OCH2OH
OH
OH
NCH3
COCH3
H
HOCH2 CHOH 3
( 缩合 )323 COCHCOCHCH OH
乙酰丙酮
吡咯衍生物
H
HH3C
H3CCHN
N
COCH3CH3
COCH3
CH3N
对二甲氨基苯甲醛
H+
樱桃红色
麦芽酚反应（四） 链霉糖特有反应
链霉糖链霉素 OH
麦芽酚紫红色 3Fe
H+
分子重排
NH C NH2HO
OHOHNHCH2N
O
O
CH3
OHCHO
O OCH2OH
OH
OH
NH
NHNH
CH3
H2O NaOH
O
O
OH
CH3 O
O
CH3
Fe3+
H+
O
Fe 33+/
紫红麦芽酚
链霉胍特有反应
橙红羟基喹啉
链霉胍链霉素 次溴酸钠
8
OH
（或 α-萘酚）
N
OH
8- 羟基喹啉
坂口反应（五）
O
N
Br
R NH CO NH
橙红色化合物
（六） 24SO 反应
白
BaSOSO Ba
H+
IR 法（八）
庆大霉素无 UV 吸收nmmax 链霉素
（七） 色谱法： TLC 法和 HPLC 法
UV 法
光谱法：
三、
特殊杂质检查及组分分析链霉素杂质（一）
链霉素 B （甘露糖链霉素）
2. 方法 TLC中的对照品法
1. 来源 反应中间体
对微生物的活性无明显差异
毒副作用和耐药性不同
发酵菌种不同工艺差别 C 组分比例
不一致
规定控制各组分的相对百分含量
ChP
USP
BP
JP
庆大霉素 C 组分的测定（二）
ChP（ 2010）采用蒸发光散射检测器测定庆大霉素C 组分，以 C18作固定相； 0.2mol/L三氟乙酸－甲醇作流动相，小诺霉素作内标，考察系统适用性
USP荧光衍生化后紫外测定
（三）硫酸盐测定：剩余 EDTA络合滴定法或 HPLC法ChP（ 2010）中硫酸依替米星中硫酸根离子的测定采用 HPLC法 - 蒸发光散射检测器
四、含量测定
微生物检定法 各国药典主要采用
HPLC 法 常用于体内药分
2CH3NR R3H
OH
CONH2O
OHOHOOH
R2R1
第四节 四环素类抗生素
ABCD
2CH3NR R3H
OH
CONH2O
OHOHOOH
R2R1
一、 结构与性质酸碱性与溶解度（一）
1. 与酸、碱均能成盐
2. 强酸或强碱中溶解度↑
3. 吸湿性 多含结晶水
酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性
二甲胺基 弱碱性
与金属离子生成有色配位化合物
Ca2+ Mg2+ Fe3+ Al3+
UV 和荧光（三）
与金属离子络合（四）
pH3 ~ 7.5 荧光
旋光性（二）
HO
HO
CaO
O
OOH
OH
O
O
稳定性（五）
1. 差向异构化
差向金霉素差向四环素
金霉素四环素 ～
pH
OH
CONH2O
OHOHOOH
CH3 HCH3 2N
HO
差向四环素
2CH3NHOH
CONH2O
OHOHOOH
CH3HO
2CH3NHOH
CONH2O
OHOHOOH
R2R1HO
（土霉素、多西环素不易差向异构化）
2. 降解反应
（ 1 ）酸性下降解
脱水金霉素脱水四环素
金霉素四环素 ＜ pH
λmax = 445nm
λmax = 435nm橙黄色
2CH3NHOH
CONH2O
OHOHOOH
CH3HO
N CH3 2HOH
CONH2O
OHOOH
CH3
OH脱水四环素
2CH3NHOH
CONH2O
OHOHOOH
CH3HO
pH 2 6～
pH 2 6～
TC
OH
CONH2O
OHOHOOH
CH3 HCH3 2N
HO
ETC
N CH3 2HOH
CONH2O
OHOOH
CH3
OH
ATC
N2CH3
OH
CONH2O
OHO
H
OH O
CH3
H
EATC
pH 2＜ pH 2＜
（ 2 ）碱性下降解
异四环素四环素 OH （荧光）
HOH
CONH2O
OHOHOOH
CH3
O
N CH3 2
2、 TLC 法
1、 HPLC 法
：加入 EDTA ，克服痕量金属造成的拖尾现象
二、鉴别试验
3 、 IR 光谱法4 、 UV 光谱法
5 、显色法，与 H2SO4 反应显色
黄色朱红色
绿蓝深紫色
盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素
SOH
6 、 FeCl3 反应：酚羟基的特征反应
褐色橙褐色深褐色红棕色
盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素
FeCl
三、
特殊杂质检查
4- 差向四环素（ ETC ）
脱水四环素（ ATC ）
差向脱水四环素（ EATC ）
盐酸金霉素（ CTC ）
有关物质（一）
HPLC 法（ 2010版）
标准品对照法
CTC).~.(A nm 控制
（二）杂质吸收度
EATCATC.A nm 、控制
异四环素控制 .A nm
注射用
（三）残留有机溶剂
四、 含量测定 HPLC法
盐酸四环素的测定
系统适用性试验：盐酸四环素、有关物质及 ATC
峰 间的分离度均应符合要求。 定量方法：外标法以峰面积计。
第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查
1.高分子杂质 分子量大于药物本身的杂质总称。如主要来自于发酵工艺可致敏的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽；来源于生产、贮存过程中的自身聚合物等。
如聚合物
高分子杂质的分析方法简单测定系统：葡聚糖凝胶 G-10（ 40～ 120μm）柱 .
HPLC系统 : 葡聚糖凝胶 G-10柱 .
