(51) Int. Cl. P E E- (12)EESTIS KEHTIVA EUROOPA PATENDI ... · 20...

EESTI VABARIIK U PATENDIAMET

(10) Registreeringu number: E012605

(11) Patendikirjelduse tõlke number: EE-EP 2 590 676 B1

(30) Prioriteediandmed: 06.07.2010 US 361828 P

(96) Euroopa patenditaotluse esitam ise kuupäev: 06.07.2011

(96) Euroopa patenditaotluse number: 11741348.4

(73) Patendiomanik:

GlaxoSmithKline Biologicals S.A. rue de r Institut, 89, 1330 Rixensart, BE

(72) L,eiutise autorid:

GEALL, Andrew Novartis Vaccines And Diagnostics Inc., PO Box 8097, Emeryville, CA 94662-8097, US

MANDL, Christian Novartis Vaccines And Diagnostics Inc., PO Box 8097, Emeryville, CA 94662-8097, US

O'HAGAN, Derek Novartis Vaccines And Diagnosties Inc., PO Box 8097, Emeryville, CA 94662-8097, US

SINGH, Manmohan Novartis Vaccines And Diagnostics Inc., PO Box 8097, Emeryville, CA 94662-8097, US

(97) Euroopa patendi väljaand- misest teatamise kuupäev: 17.08.2016

(97) Euroopa patendi number: EP 2 590 676

Patendikirjelduse tõlke esitamise kuupäev: 01.11.2016

'Patendikirjelduse tõlke avalikustamise kuupäev: 15.12.2016

(74) Patendivolinik:

Leevi Markus Patendibüroo ICkOSAAR 0Ü Tähe 94, 50107 Tartu, EE

EE

-EP

2 59

0 67

6 B

1

00EE-EP 2 590 676 B1

(51) Int. Cl. A6IK 39/155 (2006.01)

(12)EESTIS KEHTIVA EUROOPA PATENDI PATENDIKIRJELDUSE TÕLGE

(54) Viriooni-sarnased manustatavad osakesed isereplitseeruvate RNA-molekulide jaoks

EE-EP 2 590 676 B1

EE – EP2590676 B1

Viriooni-sarnased manustatavad osakesed isereplitseeruvate RNA-molekulide jaoks

TEHNIKAVALDKOND

Käesolev patent on immuniseerimiseks kasutatava isereplitseeruvate RNA-de

mitteviirusliku sisestamise valdkonnast.5

TEHNIKA TASE

Nukleiinhapete manustamine loomade immuniseerimiseks on olnud juba mitmeid

aastaid vastava valdkonna üheks eesmärgiks. Testitud on mitmeid meetodeid, k.a

DNA või RNA kasutamine, viiruslike või muude sisestusvahendite (või „paljaste“

vaktsiinide korral sisestusvahenditeta) kasutamine, replitseeruvate või10

mittereplitseeruvate vektorite kasutamine või viiruslike või muude vektorite

kasutamine. Zhou et al. (Human Gene Therapy, 1999, aastakäik 10, nr 16, lk 2719-

2724) ja Saeki et al. (Human Gene Therapy, 1997, aastakäik 8, nr 17, lk 2133-2141)

kasutasid HVJ-liposoome, mis sisaldasid proteiini kapsiidi. Levine et al. (Nature

Immunology, 2004, aastakäik 5, nr 5, lk 460-464) on avaldanud replikoni RNA15

pakkimise virioonidesse. Mockey et al. (Human Gene Therapy, 2007, aastakäik 14,

nr 9, lk 802-814) ja Martinon et al. (European Journal of Immunology, 1993,

aastakäik 23, nr 7, lk 1719-1722) manustavad mRNA, kuid ei kirjelda

isereplitseeruva RNA manustamist. Cannon et al. (DNA and Cell Biology, 2002,

aastakäik 21, nr 12, lk 953-961) on kirjeldanud RNA pakkimist virioonidesse,20

kasutamist paljas vormis või adsorbeerimist kulla osakestele.

Seega eksisteerib vajadus täiendavate ja täiustatud nukleiinhappe vaktsiinide järele

ning eriti uute täiustatud meetodite järele nukleiinhappe vaktsiinide manustamiseks.

LEIUTISE KOKKUVÕTE

Käesolevas patendis avaldatu põhjal saavutatakse nukleiinhappega25

immuniseerimine läbi väikesesse osakesse kapseldatud isereplitseeruva RNA

sisestamise. Nimetatud RNA kodeerib huvi pakkuvat immunogeeni ja selline osake

võibs isestada nimetatud RNA soovitud sihtkohta läbi loomuliku viiruse

liikumisfunktsiooni jäljendamise.

2 EE – EP2590676 B1

Seega avaldatakse käesolevas patendis virioonist erinev osake, mis ei sisalda

proteiini kapsiidi ja mida kasutatakse RNA in vivo sisestamiseks selgroogse rakku;

nimetatud osakeseks on liposoom ja see sisaldab immunogeeni kodeerivat

isereplitseeruvat RNA molekuli kapseldavat sisestusmaterjali; immunogeeniks on

pinna polüpeptiid ja see võib tekitada in vivo bakteri, viiruse, seenorganismi või5

parasiidi vastase immuunvastuse; ja RNA ei sisalda modifitseeritud nukleotiide ning

sisaldab valikuliselt 5' otsa katet. Sellised osakesed on kasulikeks komponentideks

ravimkoostistes, mida kasutatakse patsientide vaktsineerimiseks erinevate haiguste

vastu. Virioonist erineva osakese kasutamise kombinatsioon isereplitseeruva RNA

manustamisega võimaldab tugeva ja spetsiifilise immuunvastuse tekitamist10

immunogeeni vastu ja seda isegi väikese RNA koguse manustamisel. Lisaks on

selliseid osakesi tööstuslikus mastaabis lihtne toota.

Osake

Käesoleva patendi osakesteks on virioonist erinevad osakesed ehk tegemist ei ole

virioonidega. Seega ei sisalda sellised osakesed proteiini kapsiidi. Kapsiidosakese15

loomisvajaduse vältimise tõttu ei vaja käesoleva patendi lahendus pakkivat rakuliini,

võimaldades seeläbi lihtsamat tootmismastaabi suurendamist tööstuslikuks

tootmiseks ning minimeerides samas ohu, et tootmisprotsessi käigus võidaks

kogemata luua ohtlikud nakkavad viirused.

RNA viriooni kapseldamise asemel valmistatakse käesoleva leiutise osakesed20

sisestusmaterjalist. Osakeste, mis suudavad RNA in vivo selgroogsete rakku

sisestada, valmistamiseks sobivad erinevad materjalid. Erilist huvi pakkuvateks

sisestusmaterjalideks on amfifiilsed lipiidid, mis võivad moodustada liposoome.

Samas kui sisestus toimub liposoomiga, tuleks RNA kapseldada.

Seega üks käesoleva patendi osakese teostus kujutab endast nõudluspunktides25

defineeritud liposoomi, mis kapseldab immunogeeni kodeeriva isereplitseeruva

RNA molekuli. Osakesed on eelistatult põhimõtteliselt sfäärilised.

RNA kapseldatakse osakestesse (osakeseks on liposoom). See tähendab, et RNA

asub osakeste sees (analoogselt loomuliku viirusega) ning sisestusmaterjal eraldab

selle mistahes väliskeskkonnast; samuti on leitud, et kapseldamine kaitseb RNA-d30

3 EE – EP2590676 B1

RNaasi seedimise eest. Kapseldamine võib toimuda erinevates vormides. Näiteks

mõningates teostustes (näiteks unilamellaarses liposoomis) moodustab

sisestusmaterjal veepõhist RNA-d sisaldavat tuuma ümbritseva väliskihi. Osakesed

võivad sisaldada mõningal määral välist RNA-d (näiteks osakeste pinnal), kuid

vähemalt pool RNA-st (ja ideaalis kogu RNA) on kapseldatud. Kapseldamine5

liposoomidesse erineb näiteks viiteallikas 1 kirjeldatud lipiidi/RNA kompleksidest.

Liposoomid

Erinevad amfifiilsed liposoomid võivad moodustada RNA-d sisaldava veepõhise

tuuma kapseldamiseks veepõhises keskkonnas topeltkihte. Sellised lipiidid võivad

omada anioonset, katioonset või tsvitterioonset hüdrofiilset pearühma. Liposoomide10

moodustamine anioonsetest fosfolipiididest avastati 1960ndatel ning katioonseid

liposoome moodustavaid lipiide on uuritud alates 1990ndatest. Mõned fosfolipiidid

on anioonsed, samas kui mõned on tsvitterioonsed ja mõned hoopis katioonsed.

Fosfolipiidide sobivate klasside näideteks on fosfatidüületanoolamiinid,

fosfatidüülkoliinid, fosfatidüülseriinid ja fosfatidüülglütseroolid; mõned kasulikest15

fosfolipiididest on avaldatud tabelis 1. Kasulike katioonsete lipiidide näideteks on

dioleoüültrimetüülammooniumpropaan (DOTAP), 1,2-distearüüloksü-N,N-dimetüül-

3-aminopropaan (DSDMA), 1,2-dioleüüloksü-N,N-dimetüül-3-aminopropaan

(DODMA), 1,2-dilinoleüüloksü-N,N-dimetüül-3-aminopropaan (DLinDMA) ja 1,2-

dilinolenüüloksü-N,N-dimetüül-3-aminopropaan (DLenDMA). Tsvitterioonsete20

lipiidide näideteks on atsüültsvitterioonsed lipiidid ja eetertsvitterioonsed lipiidid.

Kasulike tsvitterioonsete lipiidide näideteks on samuti DPPC, DOPC ja

dodetsüülfosfokoliin. Lipiidid võivad olla küllastunud või küllastumata. Eelistatud on

vähemalt ühe küllastumata lipiidi kasutamine liposoomide valmistamiseks. Kui

küllastumata lipiidil on kaks saba, võivad mõlemad sabad olla küllastumata või võib25

üks sabadest olla küllastunud ja teine küllastumata.

Käesoleva patendi liposoomsed osakesed võib valmistada ühest lipiidist või lipiidide

segust. Selline segu võib sisaldada: (i) anioonsete lipiidide segu; (ii) katioonsete

lipiidide segu; (iii) tsvitterioonsete lipiidide segu; (iv) anioonsete lipiidide ja

katioonsete lipiidide segu; (v) anioonsete lipiidide ja tsvitterioonsete lipiidide segu;30

(vi) tsvitterioonsete lipiidide ja katioonsete lipiidide segu; või (vii) anioonsete lipiidide,

katioonsete lipiidide ja tsvitterioonsete lipiidide segu. Analoogselt võib segu

4 EE – EP2590676 B1

sisaldada nii küllastunud kui küllastumata lipiide. Segu võib sisaldada näiteks DSPC

(tsvitterioonne, küllastunud), DlinDMA (katioonne, küllastumata) ja/või DMG

(anioonne, küllastunud). Lipiidide segu kasutamisel ei pea kõik segu moodustavad

lipiidikomponendid olema amfifiilsed ehk ühe või mitu amfifiilset lipiidi saab segada

kolesterooliga.5

Lipiidi hüdrofiilse osa saab PEGüülida (s.t läbi polüetüleenglükooli kovalentse

kinnitamise modifitseerida). See modifikatsioon võib suurendada stabiilsust ning

vähendada liposoomide mittespetsiifilist adsorptsiooni. Lipiidid saab konjugeerida

näiteks PEG-iga, kasutades viiteallikates 2 ja 3 avaldatud tehnikaid. Kasutada saab

erineva pikkusega PEG-i, näiteks 0,5-8 kDa.10

Näidetena kasutatakse DSPC, DlinDMA, PEG-DMG ja kolesterooli segu.

Liposoomsed osakesed jagatakse tavaliselt kolme rühma: multilamellaarsed

vesiikulid (MLV), väikesed unilamellaarsed vesiikulid (SUV) ja suured

unilamellaarsed vesiikulid (LUV). MLV-d omavad igas vesiikulis mitut topeltkihti, mis

moodustavad mitu iseseisvat vett sisaldavat kambrit. SUV-del ja LUV-del on üks15

veepõhist tuuma kapseldav topeltkiht; SUV-de läbimõõduks on tavaliselt ≤ 50 nm ja

LUV-de läbimõõduks on >50 nm. Leiutise liposoomseteks osakesteks on ideaalis

LUV-d, mille läbimõõt jääb vahemikku 50-220 nm. Erinevate läbimõõtudega LUV-

sid sisaldavas koostises: (i) peaks vähemalt 80% osakestest omama läbimõõtu

vahemikus 20-220 nm; (ii) jääb koostise osakeste keskmine läbimõõt (Zav,20

intensiivsuse põhjal) jääb vahemikku 40-200 nm; ja/või (iii) peaks läbimõõtude

polüdisperssuse indeks olema <0,2. Viiteallikas 1 avaldatud liposoomide/RNA

komplekside läbimõõt eeldatakse jäävat vahemikku 600-800 nm ning eeldatavatsi

on sellistel kompleksidel suur polüdisperssus.

Tehnikad sobivate liposoomide valmistamiseks on teada; vaadake näiteks25

viiteallikaid 4 kuni 6. Ühte kasulikku meetodit on kirjeldatud viiteallikas 7 ja see

hõlmab (i) lipiidide etanoolipõhise lahuse; (ii) nukleiinhappe vesilahuse; ja (iii) puhvri

segamist ja sellele järgnevat moodustunud segu segamist, tasakaalustamist,

lahjendamist ning puhastamist. Käesoleva patendi eelistatud liposoomid on võimalik

valmistada selle segamisprotsessiga.30

5 EE – EP2590676 B1

RNA

Käesolevale patendile vastavad osakesed sisaldavad immunogeeni kodeerivat

(erinevalt siRNA-st) isereplitseeruvat RNA molekuli. Pärast osakeste in vivo

manustamist vabaneb RNA osakestest ning transleeritakse rakku, võimaldades

immunogeeni in situ.5

Erinevalt viiteallikas 13 kirjeldatust on leiutise osakestes leiduv RNA isereplitseeruv.

Isereplitseeruv RNA molekul (replikon) võib selgroogse rakku viiduna isegi ilma

proteiine kasutamata põhjustada läbi transkriptsiooni iseendast mitme tütar-RNA

tootmise (läbi antisenss-koopia, mille see endast loob). Isereplitseeruv RNA molekul

on seega tavaliselt +-ahela molekul, mille saab pärast rakku viimist otse transleerida10

ja see translatsioon annab RNA-sõltuva RNA polümeraasi, mis loob seejärel

omakorda sisestatud RNA-st antisenss- ja senss-transkriptid. Seega põhjustab

manustatud RNA mitme tütar-RNA tootmise. Need tütar-RNA-d, nagu ka

kolineaarsed subgenoomsed transkriptid saab transleerida kodeeritud

immunogeeni in situ ekspressiooniks või võib need transkribeerida täiendavate15

transkriptide saamiseks, mis omavad manustatud RNA-ga sama senssi ja

transleeritakse immunogeeni in situ ekspressiooniks. Selle transkriptsioonide

järjestuse üldisteks tulemuseks on sisestatud replikon RNA-de arvu tohutu

suurenemine ja seega muutub kodeeritud immunogeen rakkude üheks peamiseks

polüpeptiidproduktiks.20

Üheks sobivaks sellise isereplikatsiooni saavutamise süsteemiks on alfaviiruse

põhise replikoni kasutamine. Sellised replikonid on +-ahelalised RNA-d, mis

põhjustavad pärast rakku manustamist replikaasi translatsiooni (või replikaasi

transkriptaasi). Replikaas transleeritakse polüproteiinina, mis autolõhustub

replikatsioonikompleksi saamiseks, mis omakorda loob sisestatud +-ahelalise RNA25

genoomsed --ahelalised koopiad. Sellised --ahelalised transkriptid saab

transkribeerida täiendavate +-ahelaliste lähte-RNA koopiate ning samuti

immunogeeni kodeeriva subgenoomse transkripti saamiseks. Subgenoomse

transkripti translatsioon põhjustab seega immunogeeni in situ ekspressiooni

nakatunud raku poolt. Sobivad alfa-viiruse replikonid võivad kasutada replikaasi,30

mis pärineb Sindbisi viirusest, Semliki metsa viirusest, Ida hobuste

entsefaliitviirusest, Venetsueela hobuste entsefaliitviirusest jne. Replikonides saab

6 EE – EP2590676 B1

kasutada mutantidest või metsiktüüp viirusjärjestusi, näiteks VEEV nõrgendatud

TC83 mutanti (14).

Eelistatud isereplitseeruv RNA molekul kodeerib seega (i) RNA-sõltuvat RNA

polümeraasi, mis võib transkribeerida RNA isereplitseeruvat RNA molekulist; ja (ii)

immunogeeni. Polümeraasiks võib olla alfaviiruse replikaas, mis sisaldab näiteks5

ühte või mitut alfaviiruse proteiinidest nsP1, nsP2, nsP3 ja nsP4.

Kuigi loomulikud alfaviiruse genoomid kodeerivad lisaks mittestruktuursele

replikaasi polüproteiinile struktuurseid viriooni proteiine, on eelistatud, et leiutise

isereplitseeruvad RNA molekulid alfaviiruse struktuurseid proteiine ei kodeeriks.

Seega võib eelistatud isereplitseeruv RNA põhjustada enda genoomsete RNA10

koopiate tootmise rakus, kuid ei põhjusta RNA-d sisaldavate virioonide tootmist.

Võimetus neid virioone toota tähendab, et isereplitseeruv RNA molekul ei saa

erinevalt metsiktüüp alfaviirusest ennast nakkavasse vormi ümber lülitada. Leiutise

isereplitseeruvatest RNA-dest puuduvad alfaviiruse struktuursed proteiinid, mis on

vajalikud metsiktüüp viiruste põlistamiseks ning nende koha on hõivanud huvi15

pakkuvat immunogeeni kodeerivad geenid; seega kodeerib subgenoomne

transkript pigem immunogeeni kui struktuurseid alfaviiruse virooni proteiine.

Seega võib käesoleva patendi eesmärkidel kasulik isereplitseeruv RNA molekul

omada kahte avatud lugemisraami. Esimene (5') avatud lugemisraam kodeerib

replikaasi; ja teine (3') avatud lugemisraam kodeerib immunogeeni. Mõningates20

teostustes võib RNA omada täiendavaid (s.t allavoolu asuvaid) avatud

lugemisraame, mis võimaldavad kodeerida näiteks täiendavaid immunogeene

(vaadake allpool) või lisandpolüpeptiide.

Eelistatud isereplitseeruv RNA molekul omab 5' otsmist katet (näiteks 7-

metüülguanosiini). See kate võib parandada RNA in vivo translatsiooni. Mõningates25

teostustes tuleb isereplitseeruva RNA molekuli 5’ järjestus valida viisil, mis

võimaldab kindlustada ühilduvuse kodeeritud replikaasiga.

Isereplitseeruv RNA molekul võib omada 3' polü-A saba. See võib samuti sisaldada

3’ otsa lähedal polü-A-polümeraasi äratundvat järjestust (näiteks AAUAAA).

7 EE – EP2590676 B1

Isereplitseeruvad RNA molekulid võivad olla erineva pikkusega, kuid tavaliselt on

nende pikkuseks 5000-25 000 nukleotiidi, näiteks 8000-15 000 nukleotiidi või 9000-

12 000 nukleotiidi. Seega on RNA pikem kui siRNA manustamisel.

Isereplitseeruvad RNA molekulid on tavaliselt üheahelalised. Üheahelalised RNA-d

võivad tekitada läbi TLR7, TLR8, RNA helikaaside ja/või PKR-iga seondumise5

abiaine toime. Kaheahelalises vormis sisestatud RNA (dsRNA) võib seonduda

TLR3-ga ja selle retseptori saab aktiveerida samuti dsRNA-ga, mis moodustub

üheahelalise RNA replikatsiooni käigus või üheahelalise RNA sekundaarses

struktuuris.

Isereplitseeruva RNA saab valmistada in vitro transkriptsiooniga (IVT). IVT võib10

rakendada (cDNA) matriitsi, mis on valmistatud ja paljundatud plasmiidi vormis

bakterites või valmistatud sünteetiliselt (näiteks geeni sünteesi ja/või polümeraasi

ahelreaktsiooni (PCR) geneetilise muundamise meetoditega). Näiteks saab

isereplitseeruva RNA transkribeerimiseks DNA matriitsist kasutada DNA-st sõltuvat

RNA polümeraasi (näiteks bakteriofaagi T7, T3 või SP6 RNA polümeraase).15

Vajadusel võib kasutada sobivaid otsa katmise ja polü-A lisamisreaktsioone (kuigi

replikoni polü-A kodeeritakse tavaliselt DNA matriitsis). Need RNA polümeraasid

võivad omada transkribeeritud 5’ nukleotiidi(de) jaoks rangemaid nõudeid ning

mõningates teostustes peavad need nõuded sobima kindlustamiseks, et IVT-

transkribeeritud RNA saab funktsioneerida selle isekodeeritava replikaasi jaoks20

efektiivselt substraadina, kodeeritud replikaasi nõuetega.

RNA ei sisalda modifitseeritud nukleotiide ehk kõik RNA-s leiduvad nukleotiidid on

standardsed A, C, G ja U ribonukleotiidid (v.a mistahes 5’ otsa katte struktuur, mis

võib sisaldada 7’-metüülguanosiini). Mõningates teostustes võib RNA sisaldada 5’

otsmist katet, mis sisaldab 7’-metüülguanosiini ning esimesed 1, 2 või 3 5’25

ribonukleotiidi võivad olla riboosi 2’ positsioonil metüülitud.

Käesoleva patendi eesmärkidel kasutatav RNA sisaldab ideaalis nukleosiidide

vahel ainult fosfodiestri aheldusi, samas mõningates teostustes võib see sisaldada

fosforamidaadi, fosforotioaadi ja/või metüülfosfonaadi ühendusi.

8 EE – EP2590676 B1

RNA kogus osakese kohta võib varieeruda ja individuaalsete isereplitseeruvate

RNA molekulide arv osakese kohta võib sõltuda kasutatava osakese omadustest.

Üldiselt võib osake sisaldada 1-500 RNA molekuli. Liposoomi jaoks on RNA

molekulide arvuks tavaliselt ≤50 molekuli liposoomi kohta, näiteks <20, <10, <5 või

1-4. Polümeerse mikroosakese korral sõltub RNA molekulide arv osakese5

läbimõõdust, kuid tavaliselt on see ≤50 molekuli osakeste kohta (näiteks <20, <10,

<5 või 1-4) või 50-200 molekuli osakese kohta. Ideaalis sisaldab osake vähem kui

10 erinevat RNA tüüpi, näiteks 5, 4, 3 või 2 erinevat tüüpi; kõige eelistatumalt

sisaldab osake ühte RNA tüübi, s.t kõik osakeses leiduvad RNA molekulid omavad

sama järjestust ja sama pikkust.10

Immunogeen

Käesoleva patendi eesmärkidel kasutatavad isereplitseeruvad RNA molekulid

kodeerivad polüpeptiidi immunogeeni. Pärast osakeste manustamist toimub

immunogeeni in vivo transleerimine ja see immunogeen võib tekitada patsiendis

bakteri, viiruse, seenorganismi või parasiidi (ja mõningates teostustes allergeeni ja15

täiendavates teostustes tuumori antigeeni) vastase immuunvastuse. Immuunvastus

võib hõlmata antikeha vastust (hõlmab tavaliselt IgG-d) ja/või raku vahendatud

immuunvastust. Polüpeptiidi immunogeen tekitab tavaliselt immuunvastuse, mis

tunneb ära vastava bakteri, viiruse, seenorganismi või parasiidi (või allergeeni või

tuumori antigeeni) polüpeptiidi, kuid mõningates teostustes võib polüpeptiid toimida20

mimotoobina bakteri, viiruse, seenorganismi või parasiidi sahhariidi äratundva

immuunvastuse esilekutsumiseks. Immunogeeniks on pinna polüpeptiid nagu

adhesiin, hemaglutiniin, ümbriku glükoproteiin, oga glükoproteiin jne.

Isereplitseeruvad RNA molekulid võivad kodeerida ühte polüpeptiidi immunogeeni

või mitut polüpeptiidi. Mitu immunogeeni võivad esineda üksiku polüpeptiidi25

immunogeenina (fusioonpolüpeptiidina) või eraldi polüpeptiididena. Kui

immunogeenid avaldatakse eraldi polüpeptiididena, võivad üks või mitu neist

sisaldada ülesvoolu IRES-t või täiendavat viirusliku promootori elementi.

Alternatiivina võib mitu immunogeeni avaldada polüproteiinist, mis kodeerib

lühikese autokatalüütilise proteaasiga (näiteks suu- ja sõrataudi viiruse 2A30

proteiiniga) sulatatud individuaalseid immunogeene, või inteiinidena.

9 EE – EP2590676 B1

Erinevalt viiteallikates 1 ja 16 mainitust kodeerib RNA immunogeeni. Kahtluste

vältimiseks ei hõlma käesolev patent RNA-d, mis kodeerib jaanimardika lutsiferaasi

või E.coli β-galaktosidaasi fusioonproteiini või rohelise fluorestsentsi proteiini (GFP).

Lisaks ei ole RNA täielik hiire harknäärme RNA.

Mõningates teostustes tekitab immunogeen immuunvastuse ühe alljärgnevate5

hulgast valitud bakteri vastu:

Neisseria meningitidis: kasulike immunogeenide näideteks on membraani proteiinid

nagu adhesiinid, autotransporterid, toksiinid, rauaomastamisvalgud ja faktorit H

siduv proteiin. Ühte kolme kasuliku polüpeptiidi kombinatsiooni on kirjeldatud

kirjandusallikas 17.10

Streptococcus pneumoniae: kasulikud polüpeptiidi immunogeenid on avaldatud

viiteallikas 18. Nende hulka kuuluvad RrgB piluse allüksus, beeta-N-atsetüül-

heksoosaminidaasi eellane (spr0057), spr0096, üldine stressiproteiin GSP-781

(spr2021, SP2216), seriin-/treoniinkinaas StkP (SP 1732) ja pneumokokkide pinna

adhesiin PsaA.15

Streptococcus pyogenes: kasulike immunogeenide näideteks on viiteallikates 19 ja

20 avaldatud polüpeptiidid.

Moraxella catarrhalis

Bordetella pertussis: kasulike läkaköha immunogeenide hulka kuuluvad läkaköha

toksiin või toksoid (PT), filamentne hemaglutiniin (FHA), pertaktiin ja aglutinogeenid20

2 ja 3.

Staphylococcus aureus: kasulike immunogeenide hulka kuuluvad viiteallikas 21

avaldatud polüpeptiidid, näiteks hemolüsiin, esxA, esxB, ferrikroomi siduv proteiin

(sta006) ja/või sta011 lipoproteiin.

Clostridium tetani: tüüpiliseks immunogeeniks on teetanuse toksoid.25

Cornynebacterium diphtheriae: tüüpiliseks immunogeeniks on difteeria toksoid.

Haemophilus influenzae: kasulike immunogeenide näideteks on viiteallikates 22 ja

23 avaldatud polüpeptiidid.

10 EE – EP2590676 B1

Pseudomonas aeruginosa

Streptococcus agalactiae: kasulike immunogeenide näideteks on viiteallikas 19

avaldatud polüpeptiidid.

Chlamydia trachomatis: kasulike immunogeenide näideteks on PepA, LcrE, ArtJ,

DnaK, CT398, OmpHlike, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA ja MurG, mis on5

avaldatud näiteks viiteallikas 24. Kaks eelistatud immunogeeni on LcrE (25) ja HtrA

(26).

Chlamydia pneumoniae: kasulike immunogeenide näideteks on viiteallikas 27

avaldatud polüpeptiidid.

Helicobacter pylori: kasulike immunogeenide näideteks on CagA, VacA, NAP ja/või10

ureaas (28).

Escherichia coli: kasulike immunogeenide näideteks on immunogeenid, mis

pärinevad enterotoksigeensest E. colist (ETEC), enteroagregatiivsest E. colist

(EAggEC), diffuusselt adhesiivsest E. colist (DAEC), enteropatogeensest E. colist

(EPEC), ekstraintestinaalsest patogeensest E. colist (ExPEC) ja/või15

enterohemorraagsest E. colist (EHEC). ExPEC tüvede hulka kuuluvad

uropatogeenne E. coli (UPEC) ja meningiidi/sepsisega seostuv E. coli (MNEC).

Kasulikud UPEC polüpeptiidi immunogeenid on avaldatud kirjandusallikates 29 ja

30. Kasulikud MNEC immunogeenid on avaldatud kirjandusallikas 31. Üheks

kasulikuks immunogeeniks mitme E. coli tüve jaoks on AcfD (32).20

Bacillus anthracis

Yersinia pestis: kasulike immunogeenide näideteks on viiteallikates 33 ja 34

avaldatud immunogeenid.

Staphylococcus epidermis

Clostridium perfringens või Clostridium botulinums25

Legionella pneumophila

Coxiella burnetii

11 EE – EP2590676 B1

Brucella, näiteks B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis ja

B. pinnipediae.

Francisella, näiteks F. novicida, F. philomiragia ja F. tularensis.

Neisseria gonorrhoeae

Treponema pallidum5

Haemophilus ducreyi

Enterococcus faecalis või Enterococcus faecium

Staphylococcus saprophyticus

Yersinia enterocolitica

Mycobacterium tuberculosis10

Ricketsia

Listeria monocytogenes

Vibrio cholerae

Salmonella typhi

Borrelia burgdorferi15

Porphyromonas gingivalis

Klebsiella

Mõningates teostustes tekitab immunogeen immuunvastuse ühe alljärgnevate

hulgast valitud viiruse vastu:

Ortomüksoviirus: kasulikud immunogeenid võivad pärineda gripi A, B või C20

viirustest, näiteks hemaglutiniini, neuraminidaasi või maatriksi M2 proteiinid. Kui

immunogeeniks on gripiviiruse A hemaglutiniin, võib see pärineda mistahes

alamtüübist, näiteks H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14,

H15 või H16.

12 EE – EP2590676 B1

Paramyxoviridae viirused: viiruse immunogeenide näideteks on immunogeenid, mis

pärinevad pneumoviirustest (näiteks RSV), rubulaviirustest (näiteks mumpsi viirus),

paramüksoviirustest (näiteks paragripi viirus), metapneumoviirustest ja

morbilliviirustest (näiteks leetrid).

Poxviridae: viiruse immunogeenide näideteks on immunogeenid, mis pärinevad5

ortopoksviirustest, näiteks Variola vera, k.a Variola major ja Variola minor.

Pikornaviirus: viiruse immunogeenide näideteks on pikornaviirustest, näiteks

enteroviiruste, rinoviiruste, heparnaviiruste, kardioviiruste ja aftoviiruste hulgast

pärinevad immunogeenid. Ühes teostuses on enteroviiruseks polioviirus, näiteks I

tüübi, II tüübi ja/või III tüübi polioviirus. Ühes muus teostuses on enteroviiruseks10

EV71 enteroviirus. Ühes muus teostuses on enteroviiruseks coxsackie A või B

viirus.

Bunyaviirus: viiruse immunogeenide näideteks on antigeenid, mis pärinevad

ortobunyaviirusest nagu Kalifornia entsefaliidi viirusest, phleboviirusest nagu Rifti

oru palaviku viirusest või neuroviirusest nagu Krimmi-Kongo verejooksuga palaviku15

viirusest.

Heparnaviirus: viiruse immunogeenide näideteks on heparnaviirustest nagu A-

hepatiidi viirusest (HAV) pärinevad immunogeenid.

Filoviirus: viiruse immunogeenide näideteks on immunogeenid, mis pärinevad

filoviirusest nagu Ebola viirusest (k.a Zaire, Elevandiluuranniku, Restoni või Sudaani20

ebolaviiruse tüvedest) või Marburgi viirusest pärinevad immunogeenid.

Togaviirus: viiruse immunogeenide näideteks on togaviirusest nagu rubiviirusest,

alfaviirusest või arteriviirusest pärinevad immunogeenid. Üheks näiteks on punetisi

põhjustav viirus.

Flaviviirus: viiruse immunogeenide näideteks on immunogeenid, mis pärinevad25

flaviviirusest, näiteks puukidega leviva entsefaliidi (TBE) viirusest, Dengue (tüüpide

1, 2, 3 või 4) viirusest, kollapalaviku viirusest, Jaapani entsefaliidi viirusest,

Kyasanuri metsaviirusest, lääne-niiluse entsefaliidi viirusest, St. Louisi entsefaliidi

13 EE – EP2590676 B1

viirusest, Venemaa kevadise-suvise entsefaliidi viirusest ja Powassani entsefaliidi

viirusest.

Pestiviirus: viiruse immunogeenide näideteks on immunogeenid, mis pärinevad

pestiviirusest, näiteks veiste viirusliku kõhulahtisuse viirusest (BVDV), klassikalise

sigade palaviku viirusest (CSFV) või Borderi haiguse viirusest (BDV).5

Hepadnaviirus: viiruse immunogeenide näideteks on hepadnaviirustest nagu B-

hepatiidi viirusest pärinevad immunogeenid. Koostis võib sisaldada B-hepatiidi

viiruse pinna antigeeni (HBsAg).

Muud hepatiidi viirused: käesolevale patendile vastav koostis võib sisaldada C-

hepatiidi viiruse, delta-hepatiidi viiruse, E-hepatiidi viiruse või G-hepatiidi viiruse10

immunogeeni.

Rabdoviirus: viiruse immunogeenide näideteks on rabdoviirusest nagu

lyssaviirusest (marutaudi põhjustav viirus) ja vesikuloviirusest (VSV) pärinevad

immunogeenid.

Caliciviridae: viiruse immunogeenid näideteks on Calciviridae nagu Norwalki viiruse15

(noroviiruse) ja Norwalki viiruse sarnaste viiruste nagu Hawaii viiruse ja Snow

Mountain mäestiku viiruse immunogeenid.

Koroonaviirus: viiruse immunogeenide näideteks immunogeenid, mis pärinevad

SARS-i koroonaviirusest, lindude nakkavast bronhiidist (IBV), hiire hepatiidi

viirusest (MHV) ja sigade edasikanduvast gastroenteriidi viirusest (TGEV).20

Koroonaviiruse immunogeen võib olla ogakujuline polüpeptiid.

Retroviirus: viiruse immunogeenide näideteks on onkoviirusest, lentiviirusest

(näiteks HIV-1 või HIV-2) või spumaviirusest pärinevad immunogeenid.

Reoviirus: viiruse immunogeenide näideteks on reoviirusest nagu orthoreoviirusest,

rotaviirusest, orbiviirusest või koltiviirusest pärinevad immunogeenid.25

Parvoviirus: viiruse immunogeenide näideteks on parvoviirusest B19 pärinevad

immunogeenid.

14 EE – EP2590676 B1

Herpesviirus: viiruse immunogeenide näideteks on inimese herpesviirusest

pärinevad immunogeenid, näiteks herpes simplex viiruste antigeenid (HSV) (näiteks

HSV tüübid 1 ja 2), Varicella-zosteri viiruse antigeenid (VZV), Epstein-Barri viiruse

antigeenid (EBV), tsütomegaloviiruse antigeenid (CMV), inimese herpesviiruse 6

antigeen (HHV6), inimese herpesviiruse 7 antigeen (HHV7) ja inimese5

herpesviiruse 8 antigeen (HCV8).

Papovaviirused: viiruse immunogeenide näideteks on papilloomviirustest ja

polüoomviirustest pärinevad immunogeenid. (Inimese) papilloomviiruse serotüübiks

võib olla 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 või

65, näiteks üks või rohkem serotüüpidest 6, 11, 16 ja/või 18.10

Adenoviirus: viiruse immunogeenideks on samuti immunogeenid, mis pärinevad

adenoviiruse serotüübist 36 (Ad-36).

Mõningates teostustes tekitab immunogeen immuunvastuse kalu nakkava viiruse

nagu mõne alljärgnevate hulgast valitud viiruse vastu: nakkav lõhede aneemia viirus

(ISAV), lõhe pankrease haiguse viirus (SPDV), nakkav pankrease nekroosi viirus15

(IPNV), kanalisäga viirus (CCV), kalade lümfotsüsti haiguse viirus (FLDV), nakkav

hematopoeetilise nekroosi viirus (IHNV), karpkala herpesviirus, lõhe pikornaviirus

(teada ka kui Atlandi lõhe pikornaviirus), sisemaalõhe viirus (LSV), Atlandi lõhe

rotaviirus (ASR), forelli „maasikahaiguse“ viirus (TSD), Coho lõhe tuumori viirus

(CSTV) või viiruslik verejooksuga septitseemia viirus (VHSV).20

Seenorganismide immunogeenid võivad pärineda perekonnast Dermatophytres,

k.a: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis,

Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum,

Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum,

Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton naegnini, Trichophyton25

mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton

schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var.

album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, ja/või Trichophyton

faviforme; või liikidest Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger,

Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus,30

Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida

15 EE – EP2590676 B1

enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida

parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida

lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii,

Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans,

Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae,5

Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis ja Enterocytozoon

bieneusi; harvem Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora

spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis,

Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces

cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium10

apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii,

Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix

spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp,

Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia

spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp,15

Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp ja

Cladosporium spp liikidest.

Mõningates teostustes tekitab immunogeen immuunvastuse parasiidi vastu, mis

pärineb perekonnast Plasmodium, näiteks P. falciparum, P. vivax, P. malariae või

P. ovale. Mõningates teostustes tekitab immunogeen immuunvastuse parasiidi20

vastu, mis pärineb perekonnast Caligidae ja täpsemalt perekondade

Lepeophtheirus ja Caligus liikide vastu, mille näideteks on “meritäid” nagu

Lepeophtheirus salmonis või Caligus rogercresseyi.

Mõningates teostustes tekitab immunogeen immuunvastuse alljärgneva vastu:

õietolmu antigeenid (puude, ravimtaimede, umbrohtude ja rohttaimede õietolmu25

antigeenid); putukate või ämblike allergeenid (sissehingatavad ja süljes ning mürgis

leiduvad allergeenid nagu lestade allergeenid, prussaka ja kihulaste allergeenid,

Hymenopthera mürgi allergeenid); loomade karvade ja kõõma allergeenid (näiteks

koertelt, kassidelt, hobustelt, rottidelt, hiirtelt jne pärinevad); ning toidus leiduvad

allergeenid (näiteks gliadiin). Olulised puude ja rohttaimede õietolmu allergeenid30

pärinevad taksonoomilistest seltsidest nagu Fagales, Oleales, Pinales ja

Platanaceae, k.a kask (Betula), lepp (Alnus), sarapuu (Corylus), valgepöök

16 EE – EP2590676 B1

(Carpinus) ja oliivipuu (Olea), seeder (Cryptomeria ja Juniperus), plaatan

(Platanus), selts Poales, k.a rohttaimed perekondadest Lolium, Phleum, Poa,

Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale ja Sorghum, seltsid Asterales ja

Urticales, k.a rohttaimed perekondadest Ambrosia, Artemisia ja Parietaria. Muudeks

olulisteks sissehingatavateks allergeenideks on allergeenid, mis pärinevad5

perekondade Dermatophagoides ja Euroglyphus tolmulestadelt, perekondade

Lepidoglyphys, Glycyphagus ja Tyrophagus lestadelt, prussakatelt, kihulastelt ja

kirpudelt (näiteks Blatella, Periplaneta, Chironomus ja Ctenocepphalides) ning

imetajatelt nagu koertelt, kassidelt ja hobustelt, mürgis leiduvad allergeenid nagu

allergeenid, mis pärinevad nõelavatelt või hammustavatelt putukatelt nagu10

taksonoomilise seltsi Hymenoptera liikidelt, k.a mesilastelt (Apidae), herilastelt

(Vespidae) ja sipelgatelt (Formicoidae).

Mõningates teostustes on immunogeeniks tuumori antigeen, mis on valitud

alljärgnevate hulgast: (a) munandites leiduvad kasvaja antigeenid nagu NYESO-1,

SSX2, SCP1 ning RAGE, BAGE, GAGE ja MAGE perekonna polüpeptiidid, näiteks15

GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 ja

MAGE-12 (mida saab kasutada näiteks melanoomi, pea ja kaela kasvajate,

mitteväikerakk-kopsuvähi, rinnavähi, soolestiku vähi ja põievähi ravimiseks); (b)

muteerunud antigeenid, näiteks p53 (seostub erinevate soliidtuumorite nagu

kolorektaalse vähi, kopsuvähi ja pea ning kaela vähiga), p21/Ras (seostub20

melanoomi, pankreasevähi ja kolorektaalse vähiga), CDK4 (seostub näiteks

melanoomiga), MUM1 (seostub näiteks melanoomiga), kaspaas-8 (seostub näiteks

pea ja kaela vähiga), CIA 0205 (seostub näiteks põievähiga), HLA-A2-R1701,

beeta-kateniin (seostub näiteks melanoomiga), TCR (seostub näiteks T-rakulise

mitte-Hodgkini lümfoomiga), BCR-abl (seostub näiteks kroonilise müelogeense25

leukeemiaga), triosefosfaadi isomeraas, KIA 0205, CDC-27 ja LDLR-FUT; (c) liigselt

avaldatud antigeenid nagu galektiin 4 (seostub näiteks kolorektaalse vähiga),

galektiin 9 (seostub näiteks Hodgkini lümfoomiga), proteinaas 3 (seostub näiteks

kroonilise müelogeense leukeemiaga), WT 1 (seostub näiteks erinevate

leukeemiatega), süsiniku anhüdraas (seostub näiteks neeruvähiga), aldolaas A30

(seostub näiteks kopsuvähiga), PRAME (seostub näiteks melanoomiga), HER-

2/neu (seostub näiteks rinna, käärsoole, kopsu ja munasarja vähiga),

mammaglobiin, alfa-fetoproteiin (seostub näiteks hepatoomiga), KSA (seostub

17 EE – EP2590676 B1

näiteks kolorektaalse vähiga), gastriin (seostub näiteks pankrease vähi ja

maovähiga), telomeraasi katalüütiline proteiin, MUC-1 (seostub näiteks rinna ja

munasarja vähiga), G-250 (seostub näiteks neerurakkude kartsinoomiga), p53

(seostub näiteks rinna ja käärsoole vähiga) ja kartsinoembrüoonne antigeen

(seostub näiteks rinnavähi, kopsuvähi ja soolestiku vähkide nagu kolorektaalse5

vähiga); (d) jagatavad antigeenid nagu melanoomi-melanotsüüdi diferentseerumise

antigeenid, näiteks MART-1/Melan A, gp100, MC1R, melanotsüüti stimuleeriva

hormooni retseptor, türosinaas, türosinaasiga seostuv proteiin-1/TRP1 ja türosiiniga

seostuv proteiin-2/TRP2 (seostub näiteks melanoomiga); (e) eesnäärmega

seostuvad antigeenid nagu PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, mis10

seostub näiteks eesnäärmevähiga; (f) immunoglobuliini idiotüübid (seostuvad

näiteks müeloomi ja B-rakkude lümfoomidega). Teatud teostustes on tuumori

immunogeenide näideteks p 15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK,

MYLRAR, Epstein Barri viiruse antigeenid, EBNA, inimese papilloomviiruse (HPV)

antigeenid, k.a E6 ja E7, B- ja C-hepatiidi viiruse antigeenid, inimese T-rakkude15

lümfotroopilise viiruse antigeenid, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-

23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA,

CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beeta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA

27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733

(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1,20

SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 siduv protein/tsüklofiliin C-ga seostuv proteiin), TAAL6,

TAG72, TLP, TPS jne.

Ravimkoostised

Käesoleva patendi osakesed on kasulikeks komponentideks ravimkoostistes, mida

kasutatakse patsientide vaktsineerimiseks erinevate haiguste vastu. Sellised25

koostised sisaldavad tavaliselt lisaks käesolevale patendile vastavatele osakestele

ka farmatseutiliselt sobivat tugiainet. Farmatseutiliselt sobivate tugiainete põhjalik

arutelu on avaldatud viiteallikas 35.

Käesolevale patendile vastav ravimkoostis võib sisaldada ühte või mitut väikese

molekuliga immuunsuse võimendajat. Koostis võib sisaldada näiteks TLR2 agonisti30

(näiteks Pam3CSK4), TLR4 agonisti (näiteks aminoalküülglükoosaminiid-fosfaati

nagu E6020), TLR7 agonisti (näiteks imikvimoodi), TLR8 agonisti (näiteks

18 EE – EP2590676 B1

resikvimoodi) ja/või TLR9 agonisti (näiteks IC31). Ideaalis on sellise agonisti

molekulmassiks < 2000 Da. RNA kapseldamise korral on sellised agonistid

mõningates teostustes kapseldatud koos RNA-ga, samas kui mõningates

teostustes on need kapseldamata.

Leiutise ravimkoostised võivad hõlmata osakesi puhtas vees (näiteks5

süstimiskõlblikus vees) või puhvris nagu fosfaatpuhvris, Tris-puhvris, boraatpuhvris,

suktsinaatpuhvris, histidiinpuhvris või tsitraatpuhvris. Puhversoolade sisaldus jääb

tavaliselt vahemikku 5-20 mM.

Käesolevale patendile vastavate ravimkoostiste pH võib jääda vahemikku 5,0 kuni

9,5, näiteks 6,0 kuni 8,0.10

Käesoleva leiutise koostised võivad sisaldada vajaliku toonuse saavutamiseks

naatriumsooli (näiteks naatriumkloriidi). Tavaliselt on NaCl-i kontsentratsiooniks 10

± 2 mg/ml, näiteks umbes 9 mg/ml.

Leiutise koostised võivad sisaldada metalliiooni kelaatijaid. Need kelaatijad võivad

pikendada RNA stabiilsust läbi ioonide, mis võivad fosfodiestri hüdrolüüsi15

kiirendada, eemaldamise. Seega võib koostis sisaldada ühte või mitut

alljärgnevatest: EDTA, EGTA, BAPTA, penteenhape jne. Selliste kelaatijate

sisalduseks on tavaliselt 10-500 μM, näiteks 0,1 mM. Kelaatijana võib toimida

samuti tsitraatsool nagu naatriumtsitraat, mis võimaldab eelistatult ka puhverdavat

aktiivsust.20

Käesoleva patendi ravimkoostiste osmolaarsus võib olla 200 mOsm/kg kuni 400

mOsm/kg, näiteks 240-360 mOsm/kg või 290-310 mOsm/kg.

Käesoleva patendi ravimkoostised võivad sisaldada ühte või mitut säilitusainet,

näiteks tiomersaali või 2-fenoksüetanooli. Eelistatud on elavhõbedavabad koostised

ning valmistada võib samuti säilitusainevabad vaktsiinid.25

Käesolevale patendile vastavad ravimkoostised on eelistatult steriilsed.

Käesolevale patendile vastavad ravimkoostised ei ole eelistatult pürogeensed ehk

sisaldavad <1 EU (endotoksiini ühik - standardmõõde) annuse kohta ja eelistatult

<0,1 EU annuse kohta.

19 EE – EP2590676 B1

Käesolevale patendile vastavad ravimkoostised on eelistatult gluteenivabad.

Käesolevale patendile vastavad ravimkoostised võib valmistada ravimvormis.

Mõningates teostustes on ravimvormi mahuks umbes 0,1-1,0 ml, näiteks umbes 0,5

ml.

Koostised võib valmistada süstitavate koostistena (lahuste või suspensioonidena).5

Koostise võib valmistada ka pulmonaalseks manustamiseks, näiteks

manustamiseks inhalaatoriga peent spreid kasutades. Koostise võib valmistada

nasaalseks, auraalseks või okulaarseks manustamiseks, näiteks sprei või tilkade

vormis. Tüüpilisteks ravimvormideks on intramuskulaarseks manustamiseks

mõeldud süstitavad ained.10

Koostised sisaldavad osakeste immunoloogiliselt efektiivset kogust ning vajadusel

ka muid ühendeid. Immunoloogiliselt efektiivse koguse all peetakse silmas, et selle

koguse manustamisel patsiendile iseseisva annuse või ravikuuri osana on see

kogus raviks või profülaktikaks efektiivne. See kogus sõltub ravitava isiku tervisest

ja füüsilisest seisundist, vanusest, ravitava liigi taksonoomilisest rühmast (näiteks15

primaat jne), patsiendi immuunsüsteemi võimest antikehasid sünteesida, soovitud

kaitse ulatusest, vaktsiini koostisest, raviarsti hinnangust meditsiinilisele seisundile

ja muudest olulistest faktoritest. On eeldatav, et see kogus jääb suhteliselt laia

vahemikku, mille saab määrata läbi rutiinse katsetamise. Käesolevale patendile

vastavate koostiste osakeste ja RNA sisaldus avaldatakse üldiselt RNA kogusena20

annuse kohta. Eelistatud annus sisaldab ≤100 μg RNA-d (näiteks 10-100 μg nagu

umbes 10 μg, 25 μg, 50 μg, 75 μg või 100 μg), kuid selle ekspressioon võib toimuda

palju madalamatel tasemetel, näiteks ≤1 μg/annuse kohta, ≤100 ng/annuse kohta,

≤10 ng/annuse kohta, ≤1 ng/annuse kohta jne.

Käesolevas patendis on avaldatud samuti manustamisvahend (näiteks süstal,25

pihusti, inhalaator, dermaalne plaaster jne), mis sisaldab käesoleva leiutise

ravimkoostist. Sellist vahendit saab kasutada koostise manustamiseks selgroogsele

patsiendile.

Käesolevale patendile vastavad osakesed ei sisalda ribosoome.

30

20 EE – EP2590676 B1

Ravimeetodid ja meditsiinilised kasutamisvõimalused

Vastupidiselt viiteallikas 16 avaldatud osakestele rakendatakse käesolevale

patendile vastavaid osakesi ja ravimkoostisi in vivo immuunvastuse

esilekutsumiseks huvi pakkuva immunogeeni vastu.

Käesolevas patendis on avaldatud käesolevale patendile vastava osakese või5

ravimkoostise kasutamine immuunvastuse tekitamismeetodis selgroogses

organismis ja nimetatud meetod sisaldab etappi, mille käigus manustatakse

käesoleva patendi osakese või ravimkoostise efektiivne kogus. Immuunvastus on

kaitsev ja hõlmab eelistatult antikehasid ja/või raku vahendatud immuunsust.

Meetod võib tekitada booster-reageeringu.10

Immuunvastuse tekitamisega selgroogsetes neid kasutamisvõimalusi ja meetodeid

rakendades saab selgroogset kaitsta erinevate haiguste ja/või infektsioonide eest,

näiteks eespool kirjeldatud bakteriaalsete ja/või viiruslike haiguste eest. Osakesed

ja koostised on immunogeensed ning eelistatumalt on tegemist vaktsiini

koostistega. Leiutisele vastavad vaktsiinid võivad olla profülaktilised (takistavad15

infektsiooni) või terapeutilised (ravivad infektsiooni) - tavaliselt on sellised vaktsiinid

profülaktilised.

Selgroogseks on eelistatult imetaja nagu inimene või suur selgroogne imetaja

(näiteks hobused, kariloomad, hirved, kitsed, sead jne). Kui vaktsiin on mõeldud

profülaktiliseks kasutamiseks, on inimeseks eelistatult laps (näiteks väikelaps või20

imik) või teismeline; kui vaktsiin on mõeldud terapeutiliseks kasutamiseks, on

inimeseks eelistatult teismeline või täiskasvanu. Lastele mõeldud vaktsiini võib

samuti manustada täiskasvanutele, näiteks ohutuse, annuse suuruse,

immunogeensuse jne hindamiseks.

Käesoleva leiutise alusel valmistatud vaktsiine võib kasutada nii laste kui25

täiskasvanute vaktsineerimiseks. Seega võib inimpatsient olla noorem kui 1 aasta,

noorem kui 5 aastat, 1-5 aasta vanune, 5-15 aasta vanune, 15-55 aasta vanune või

vähemalt 55 aasta vanune. Eelistatud patsientideks selliste vaktsiinide jaoks on

eakad (näiteks >50 aasta vanused, >60 aasta vanused ja eelistatult >65 vanused),

noored (näiteks <5 aasta vanused), hospitaliseeritud patsiendid, tervishoiutöötajad,30

21 EE – EP2590676 B1

relvajõudude esindajad, rasedad naised, krooniliselt haiged või

immuunpuudulikkusega patsiendid. Kuid vaktsiinid ei sobi ainult nendele rühmadele

ja neid võib kasutada populatsioonis üldisemalt.

Käesoleva leiutise koostised manustatakse üldiselt otse patsiendile. Otsene

manustamine võib toimuda parenteraalse süstiga (näiteks subkutaanse,5

intraperitoneaalse, intravenoosse, intramuskulaarse, intradermaalse või koe

interstitsiaalsesse ruumi tehtava süstiga; erinevalt viiteallikas 1 avaldatust ei

kasutata käesoleva patendi eesmärkidel tavaliselt intraglossaalset süsti).

Alternatiivseteks manustamisviisideks on rektaalne, suukaudne (näiteks tableti või

spreiga), bukaalne, sublinguaalne, vaginaalne, paikne, transdermaalne,10

transkutaanne, intranasaalne, okulaarne, auraalne, pulmonaalne või mõne muu

meetodiga toimuv mukosaalne manustamine. Kaks eelistatud manustamisviisi on

intradermaalne ja intramuskulaarne manustamine. Süstimine võib toimuda nõelaga

(näiteks hüpodermilise nõelaga), kuid alternatiivina võib kasutada ka nõelavaba

süstimist. Tüüpilise intramuskulaarse annuse suuruseks on 0,5 ml.15

Käesolevas patendis avaldatut võib kasutada süsteemse ja/või mukosaalse

immuunsuse tekitamiseks ja eelistatult paranenud süsteemse ja/või mukosaalse

immuunsuse tekitamiseks.

Raviks võib kasutada ühte annust või ravikuuri. Esmase immuniseerimise graafikus

ja/või booster-immuniseerimise graafikus võib kasutada ravikuuri. Mitme annusega20

režiimil võib erinevad annused manustada samal või erinevatel viisidel, näiteks

parenteraalne esmane annus ja mukosaalne booster-annus, mukosaalne esmane

annus ja parenteraalne booster-annus jne. Mitme annuse manustamisel toimub

manustamine tavalisel 1 nädalase vahega (näiteks umbes 2 nädala, umbes 3

nädala, umbes 4 nädala, umbes 6 nädala, umbes 8 nädala, umbes 10 nädala,25

umbes 12 nädala, umbes 16 nädala jne tagant). Ühes teostuses manustatakse mitu

annust umbes 6 nädalat, 10 nädalat ja 14 nädalat pärast sündi, näiteks kuue nädala,

10 nädala ja 14 nädala vanuselt (vastavalt Maailma Tervishoiuorganisatsiooni

laiendatud immuniseerimisprogrammile (EPI)). Ühes alternatiivses teostuses

manustatakse kaks põhiannust umbes kahe kuuse vahega, näiteks umbes 7, 8 või30

9 nädalase vahega ja sellele järgneb ühe või mitme booster-annuse manustamine

umbes 6 kuud kuni 1 aasta pärast teist põhiannust, näiteks umbes 6, 8, 10 või 12

22 EE – EP2590676 B1

kuud pärast teist põhiannust. Ühes täiendavas teostuses manustatakse kolm

põhiannust umbes kahe kuu pikkuse vahega, näiteks umbes 7, 8 või 9 nädalase

vahega ja sellele järgneb ühe või mitme booster-annuse manustamine umbes 6

kuud kuni 1 aasta pärast kolmanda põhiannuse manustamist, näiteks umbes 6, 8,

10 või 12 kuud pärast kolmanda põhiannuse manustamist.5

Üldist

Käesoleva leiutise meetodite praktiseerimisel kasutatakse juhul, kui ei ole teisiti

välja toodud, eriala spetsialistile teadaolevaid keemilisi, biokeemilisi,

molekulaarbioloogilisi, immunoloogilisi ja farmakoloogilisi meetodeid. Selliseid

tehnikaid on kirjeldatud põhjalikumalt erialakirjanduses. Vaadake näiteks10

viiteallikaid 36-42 jne.

Mõiste „hõlmab" haarab nii mõisteid "sisaldab" kui ka "koosneb"; näiteks koostis,

mis "hõlmab" X, võib koosneda ainult X-st või sisaldada midagi täiendavat, näiteks

X + Y.

Mõiste „umbes“ on numbrilise väärtuse x juures valikuline ning tähistab näiteks x ±15

10%.

Mõiste „põhimõtteliselt“ ei välista mõistet „täielikult“, näiteks koostis, mis on

"põhimõtteliselt vaba“ Y-st, võib olla täielikult Y vaba. Vajadusel võib mõiste

„põhimõtteliselt“ käesoleva leiutise definitsioonist ära jääda.

Laengutele, katioonidele, anioonidele, tsvitterioonidele jne tehtavad viited on pH =20

7 juures.

TLR3 on Toll-sarnane retseptor 3. Tegemist on ühe üle membraani ulatuva

retseptoriga, mis omab kaasasündinud immuunsüsteemis võtmetähtsusega rolli.

Üheks teadaolevaks TLR3 agonistiks on polü(I:C). TLR3 on seda retseptorit

kodeeriva geeni kinnitatud HGNC nimeks ja selle unikaalseks HGNC ID-ks on25

HGNC: 11849. Inimese TLR3 geeni RefSeq järjestuseks on GI:2459625.



Üheks teadaolevaks TLR7 agonistiks on imikvimood. TLR7 on seda retseptorit

23 EE – EP2590676 B1

kodeeriva geeni kinnitatud HGNC tähistuseks ja selle unikaalseks HGNC ID-ks on




Üheks teadaolevaks TLR8 agonistiks on resikvimood. TLR8 on seda retseptorit5

kodeeriva geeni kinnitatud HGNC tähistuseks ja selle unikaalseks HGNC ID-ks on


RIG-I-sarnase retseptori (RLR) perekonda kuuluvad erinevad RNA helikaasid, mis

omavad võtmerolli kaasasündinud immuunsüsteemis (43). RLR-1 (teada ka kui

RIG-I või retinoehapet indutseeriv geen I) omab N-terminuse läheduses kahte10

kaspaasi mobiliseerivat domeeni. RLR-1 helikaasi kodeeriva geeni kinnitatud

HGNC tähistuseks on DDX58 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) karbi polüpeptiidile 58) ja

selle unikaalseks HGNC ID-ks on HGNC: 19102. Inimese RLR-1 geeni RefSeq

järjestuseks on GI:77732514. RLR-2 (teada ka kui MDA5 või melanoomi

diferentseerumisega seostuv geen 5) omab N-terminuse läheduses kahte kaspaasi15

mobiliseerimisdomeeni. RLR-2 helikaasi kodeeriva geeni kinnitatud HGNC

nimetuseks on IFIH1 (interferooni jaoks, mis on indutseeritud helikaasi C domeeniga

1) ja selle unikaalseks HGNC ID-ks on HGNC: 18873. Inimese RLR-2 geeni RefSeq

järjestuseks on GI: 27886567. RLR-3 (teada ka kui LGP2 või geneetika ja

füsioloogia laboratoorium 2) ei oma kaspaasi mobiliseerimisdomeene. RLR-320

helikaasi kodeeriva geeni kinnitatud HGNC nimetuseks on DHX58 (DEXH (Asp-Glu-

X-His) karbi polüpeptiidi 58 jaoks) ning selle unikaalseks HGNC ID-ks on HGNC:

29517. Inimese RLR-3 geeni RefSeq järjestuseks on GI: 149408121.

PKR on kaheahelaline RNA-sõltuv proteiinkinaas. See omab kaasasündinud

immuunsüsteemis võtmerolli. Seda ensüümi kodeeriva geeni kinnitatud HGNC25

tähistuseks on EIF2AK2 (eukarüootse translatsiooni initsieerimisfaktori 2-alfakinaas

2) ja selle unikaalseks HGNC ID-ks on HGNC: 9437. Inimese TLR8 geeni RefSeq

järjestuseks on GI:208431825.

24 EE – EP2590676 B1

JOONISTE LÜHIKIRJELDUS

Joonisel fig 1 on kujutatud geeli värvitud RNA-ga. Jooned näitavad: (1) markereid;

(2) paljast replikoni; (3) replikoni pärast RNaasiga töötlemist; (4) liposoomi

kapseldatud replikoni; (5) liposoomi pärast RNaasiga töötlemist; ja (6) liposoomi,

mida on töödeldud RNaasiga ning millel on rakendatud seejärel fenooli/kloroformiga5

ekstraktsiooni.

Joonisel fig 2 on liposoomide elektromikroskoobi ülesvõte.

Joonisel fig 3 on kujutatud proteiini ekspressiooni (suhtelise valguse ühikutena

(RLU)) päevadel 1, 3 ja 6 pärast RNA manustamist viriooni pakitud replikonina

(ruudud), palja RNA-na (kolmnurgad) või mikroosakestena (ringid).10

Joonisel fig 4 on kujutatud geeli koos värvitud RNA-ga. Jooned näitavad: (1)

markereid; (2) paljast replikoni; (3) liposoomi kapseldatud replikoni; ja (6) liposoomi,

mida on töödeldud RNaasiga ning millel on rakendatud seejärel fenooli/kloroformiga

ekstraktsiooni.

Joonisel fig 5 on kujutatud proteiini ekspressiooni 1, 3 ja 6 päeva pärast RNA15

manustamist viriooni pakitud replikonina (ruudud), palja RNA-na (rombid) või

liposoomidena (+ = 0,1 μg, x = 1 μg).

Joonisel fig 6 on kujutatud proteiini ekspressiooni 1, 3 ja 6 päeva pärast liposoomi

kapseldatud RNA nelja erineva annuse manustamist.

Joonisel fig 7 on kujutatud loomade, kellele oli manustatud viriooni pakitud replikon20

(VRP või VSRP), 1 μg paljast RNA-d ja 1 μg liposoomi kapseldatud RNA-d, anti-F

IgG tiitreid.

Joonisel fig 8 on kujutatud loomade, kellele oli manustatud VRP, 1 μg paljast RNA-

d ja 0,1 või 1 μg liposoomi kapseldatud RNA-d, anti-F IgG tiitreid.

Joonisel fig 9 on kujutatud loomade, kellele oli manustatud VRP või 0,1 või 1 μg25

liposoomi kapseldatud RNA-d, neutraliseeriva antikeha tiitreid.

25 EE – EP2590676 B1

Joonisel fig 10 on kujutatud ekspressioonitasemeid pärast replikoni manustamist

palja RNA-na (ringid), liposoomi kapseldatud RNA-na (kolmnurgad ja ruudud) või

lipopleksina (ümberpööratud kolmnurk).

Joonisel fig 11 on kujutatud F-spetsiifilise IgG tiitreid (kaks nädalat pärast teist

annust) pärast replikoni manustamist palja RNA-na (0,01-1 μg), liposoomi5

kapseldatud RNA-na (0,01-10 μg) või virioonina pakendatuna (VRP, 106 nakkavat

ühikut või IU).

Joonisel fig 12 on kujutatud F-spetsiifilise IgG tiitreid (ringid) ja PRNT tiitreid

(ruudud) pärast replikoni manustamist palja RNA-na (1 μg), liposoomi kapseldatud

RNA-na (0,01 või 1 μg) või virioonina pakendatuna (VRP, 10 6 IU). Näidatud on ka10

naiivsete hiirte tiitreid. Pidevjooned näitavad geomeetrilisi keskmisi.

Joonisel fig 13 on kujutatud intratsellulaarset tsütokiini tootmist pärast sünteetiliste

peptiididega, mis kujutavad F-proteiinis leiduvaid peamisi epitoope, neli nädalat

pärast teise annuse manustamist toimunud uuesti stimuleerimisega. Y-teljel on

kujutatud CD8+CD4- % tsütokiini+.15

Joonisel fig 14 on kujutatud F-spetsiifilisi IgG tiitreid (keskmised log10 tiitrid ±

standardhälve) 63 päeva (joonis fig 14A) ja 210 päeva (joonis fig 14B) jooksul pärast

vasikate immuniseerimist. Kolm joont on päeval 63 kergesti eristatavad ning

kujutavad ülevalt alla: PBS negatiivset kontrolli, liposoomist pärinevat RNA-d ja

„Triangle 4“ produkti.20

Joonisel fig 15 on kujutatud anti-HIV seerumi IgG tiitreid vastusena paljale (RNA)

või liposoomi kapseldatud (LNP) RNA-le või elektroporeeritult lihasesse viidud DNA-

le.

Joonisel fig 16 on kujutatud 13 hiirte grupi IgG tiitreid. Iga ring kujutab ühte hiirt ning

pidevjooned näitavad geomeetrilisi keskmisi. Horisontaalne punktiirjoon on analüüsi25

tuvastuspiir. 13 gruppi on vasakult paremale (A kuni M) kirjeldatud allpool.

Joonisel fig 17 on kujutatud pDC poolt vabastatud (A) IL-6 ja (B) IFNα (pg/ml).

Kujutatud on nelja tulpade paari, milleks on vasakult paremale: kontroll; RNA +

DOTAP-iga immuniseeritud loomad; RNA + lipofektamiiniga immuniseeritud

26 EE – EP2590676 B1

loomad; ja liposoomides oleva RNA-ga immuniseeritud loomad. Igas paaris on must

tulp metsiktüüp hiir ja hall on rsq1 mutant.

MEETODID LEIUTISE RAKENDAMISEKS

RNA replikonid

Allpool kirjeldatud näidetes kasutatakse erinevaid replikone. Üldiselt põhinevad5

need hübriidist alfaviiruse genoomil, sisaldades mittestruktuurseid Venetsueela

hobuste entsefaliitviiruse (VEEV) proteiine, Sindbisi viiruse pakkimissignaali ja

Sindbisi viiruse või VEEV mutandi 3' UTR-i. Replikoni pikkuseks on umbes 10 000

aluspaari ning see sisaldab polü-A saba.

RNA in vitro sünteesimiseks kasutatakse matriitsina plasmiidi DNA-d kodeerivaid10

alfaviiruse replikone (nimelt: pT7-mVEEV-FL.RSVF või A317; pT7-mVEEV-SEAP

või A306; pSP6-VCR-GFP või A50). Replikonid sisaldavad alfaviiruse geneetilisi

elemente, mis on vajalikud RNA replikatsiooniks, kuid milles puuduvad kodeerivad

geeniproduktid, mis on vajalikud osakese kokkupanekuks; struktuursed proteiinid

asendatakse pigem huvi pakkuva proteiiniga (reporteri nagu SEAP või GFP või15

immunogeeni nagu täispika RSV F proteiiniga) ja seega ei suuda replikonid

nakkavate osakeste loomist indutseerida. Alfaviiruse cDNA-st ülesvoolu asuv

bakteriofaagi (T7 või SP6) promootor lihtsustab replikoni RNA in vitro sünteesi ja

vahetult polü(A)-sabast allavoolu asuv Delta-hepatiidi viiruse (HDV) ribosüüm loob

läbi oma iselõhustumisaktiivsuse õige 3’-otsa.20

Pärast plasmiidi DNA lineariseerimist HDV ribosüümist allavoolu sobiva

restriktsiooni endonukleaasiga sünteesiti in vitro eralduvad transkriptid, kasutades

sünteesiks T7 või SP6 bakteriofaagist pärinevat DNA-sõltuvat RNA polümeraasi.

Transkriptsioonid sooritati kahe tunni jooksul temperatuuril 37 oC 7,5 mM (T7 RNA

polümeraas) või 5 mM (SP6 RNA polümeraas) iga nukleosiidi trifosfaadi (ATP, CTP,25

GTP ja UTP) kasutamisega tootjapoolseid (Ambion) juhiseid järgides. Pärast

transkriptsiooni seediti matriitsi DNA TURBO DNaasiga (Ambion). Replikoni RNA

sadestati LiCl-iga ning taastati nukleaasivabas vees. Otsmise katteta RNA ots kaeti

transkriptsioonijärgselt gripiviiruse otsa katva ensüümiga (VCE), kasutades

ScriptCap m7G katmissüsteemi (Epicentre Biotechnologies) tootjapoolseid juhiseid30

27 EE – EP2590676 B1

järgides; sedasi otsmiselt sulgetud replikonidel on eesliide “v” - näiteks vA317 on

A317 replikon, mis on kaetud otsmiselt VCE-ga. Transkriptsioonijärgselt otsmiselt

kaetud RNA sadestati LiCl-iga ning taastati nukleaasivabas vees. RNA proovide

kontsentratsioon määrati OD260 mõõtmisega. In vivo transkriptide terviklikkus

kinnitati denatureeriva agaroosi geelelektroforeesiga.5

PLG absorptsioon (võrdlusnäide)

Mikroosakesed valmistati, kasutades 500 mg PLG RG503 (50:50 laktiidi/glükoliidi

molaarne suhe, molekulmass: ~30 kDa) ja 20 mg DOTAP ning rakendades Omni

Macro homogenisaatorit. Osakeste suspensiooni raputati öö läbi kiirusel 150 pööret

minutis ning filtreeriti seejärel hoiustamiseks temperatuuril 2-8 oC läbi 40 μm steriilse10

filtri. Isereplitseeruv RNA adsorbeeriti osakestele. 1 μl PLG/RNA suspensiooni

valmistamiseks lisati viaali vajalik kogus PLG osakeste suspensiooni ja seejärel

lisati mahu viimiseks 900 μl juurde nukleaasivaba vesi. PLG suspensioonile lisati

tilkhaaval pidevalt raputades 100 μl RNA-d (10 μg/ml). PLG/RNA inkubeeriti 30

minutit toatemperatuuril. 1 ml taastatud suspensiooni kohta lisati 45 mg mannitooli,15

15 mg sahharoosi ja 250-500 μg PVA-d. Viaalid külmutati temperatuuril -80 oC ning

lüofiliseeriti.

RNA adsorptsiooni hindamiseks tsentrifuugiti 100 μl osakeste suspensiooni 5

minutit kiirusel 10 000 pööret minutis ning supernatant koguti. PLG/RNA taastati 1

μl nukleaasivaba vett kasutades. 100 μl osakeste suspensioonile (1 μg RNA) lisati20

1 μg hepariinsulfaati. Segu tsentrifuugiti ja lasti RNA desorptsiooniks 30 minutit

toatemperatuuril seista. Osakeste suspensioon tsentrifuugiti ja supernatant koguti.

RNaasi stabiilsuse hindamiseks inkubeeriti 100 μl osakeste suspensiooni 30 minutit

toatemperatuuril 6,4 mAU RNaas A-ga. RNaas inaktiveeriti 10 minuti jooksul

temperatuuril 55 oC 0,126 mAU proteinaas K-ga. RNA desorbeerimiseks pärast25

tsentrifuugimist lisati 1 μg hepariinsulfaati. RNA-d sisaldavad supernatandi proovid

segati formaldehüüdi värvainega, kuumutati 10 minutit temperatuuril 65 oC ning

analüüsiti 1% denatureeriva geeliga (460 ng RNA-d rea kohta).

Ekspressiooni hindamiseks immuniseeriti Balb/c hiired 1 μg RNA-ga 100 μg

intramuskulaarses süstitavas annuses (50 μl/jala kohta) päeval 0. Seerum koguti30

28 EE – EP2590676 B1

päevadel 1, 3 ja 6. Proteiini ekspressioon määrati kemoluminestsentsi analüüsiga.

Nagu on näidatud joonisel fig 3, oli RNA manustamisel PLG-ga (kolmnurgad)

ekspressioon kõrgem kui sisestusosakesteta manustamisel (ringid).

Liposoomi kapseldamine

RNA kapseldati liposoomidesse, mille valmistamiseks kasutati viiteallikates 7 ja 445

kirjeldatud meetodit. Liposoomid valmistati 10% DSPC-st (tsvitterioonne), 40%

DlinDMA-st (katioonne), 48% kolesteroolist ja 2% PEG-konjugeeritud DMG-st (2

kDa PEG). Need proportsioonid viitavad moolide % kogu liposoomis.

DlinDMA (1,2-dilinoleüüloksü-N,N-dimetüül-3-aminopropaan) sünteesiti viiteallikas

2 kirjeldatud protseduuriga. DSPC (1,2-diastearoüül-sn-glütsero-3-fosfokoliin) osteti10

ettevõttest Genzyme. Kolesterool pärines Sigma-Aldrichist. PEG-konjugeeritud

DMG (1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfoetanoolamiin-N-metoksü(polüetüleen-

glükool), ammooniumsool), DOTAP (1,2-dioleoüül-3-trimetüülammooniumpropaan,

kloriidsool) ja DC-chol (3β-[N-(N’,N’-dimetüülaminoetaan)-karbamoüül]kolesterooli

vesinikkloriid) pärinesid ettevõttest Avanti Polar Lipids.15

Lühidalt, lipiidid lahustati etanoolis (2 ml), RNA replikon lahustati puhvris (2 ml, 100

mM naatriumtsitraat, pH 6) ja need kaks lahust segati 2 ml puhvriga, millele järgnes

1 tund kestev tasakaalustamine. Segu lahjendati 6 ml puhvriga ning filtreeriti

seejärel. Moodustunud produkt sisaldas liposoome ja omas ~95%

kapseldusefektiivsust.20

Näiteks ühes konkreetses meetodis valmistati värsked lipiidi emalahused etanoolis.

37 mg DlinDMA-d, 11,8 mg DSPC-d, 28,8 mg kolesterooli ja 8,07 mg PEG-DMG-d

kaaluti ning lahustati 7,55 ml etanoolis. Värskelt valmistatud lipiidi emalahust

raputati homogeense segu moodustamiseks õrnalt umbes 15 minutit temperatuuril

37 oC. Seejärel lisati 755 μl emalahust 1,245 ml etanoolile, saades kasutatava lipiidi25

emalahuse koguseks 2 ml. Seda lipiidide kogust kasutati liposoomide

valmistamiseks 250 μg RNA-ga. ~1 μg/μl emalahusest valmistati 100 mM

tsitraatpuhvris (pH = 6) samuti 2 ml RNA lahus. Kolm 20 ml klaasviaali

(segamisvarrastega) loputati Rnase Away lahusega (Molecular BioProducts) ning

pesti enne RNaaside viaalide saastamiseks kasutamist ohtra MilliQ veega. Ühte30

29 EE – EP2590676 B1

viaalidest kasutati RNA töölahuse jaoks ning ülejäänuid rakendati lipiidi ja RNA

segude kogumiseks (kirjeldatud allpool). Lipiidi ja RNa töölahuseid kuumutati 10

minutit temperatuuril 37 oC ning viidi seejärel 3 cm3 luer-lok süstaldesse. 2 ml

tsitraatpuhvrit (pH 6) viidi erinevasse 3 cm3 süstlasse. RNA-d ja lipiide sisaldavad

süstlad ühendati T-mikseriga (PEEK™ 500 μm sisemise läbimõõduga ühendus,5

Idex Health Sciences), kasutades ühendusteks FEP tuube (fluoritud

etüleenpropüleen; kõikide kasutatud FEP tuubide sisemiseks läbimõõduks oli 2 mm

ja välimiseks läbimõõduks oli 3 mm; tuubid pärinesid ettevõttest Idex Health

Science). T-mikseri väljavooluks oli samuti FEP tuub. Kolmas tsitraatpuhvrit

sisaldav süstal ühendati eraldi tuubiga. Kõik süstlad tühjendati seejärel süstla10

pumpa kasutades voolu kiirusel 7 ml/minutis. Tuubi väljavooluavade paigutus

võimaldas segu kogumist 20 ml klaasviaali (segamisega). Segamisvarras võeti välja

ning etanoolil/vesilahusel lasti toatemperatuuril 1 tund tasakaalustuda. 4 ml segu

viidi 5 cm3 süstlasse, mis ühendati FEP tuubi osaga ning veel üks 5 cm3 süstal, mis

oli ühendatud samapika FEP tuubiga, täideti samaväärse koguse 100 mM15

tsitraatpuhvriga (pH 6). Kaks süstalt tühjendati süstla pumpa kasutades kiirusel 7

ml/minutis ning lõplik segu koguti 20 ml klaasviaali (segamisega). Seejärel juhiti

teises segamisetapis kogutud segu (liposoomid) läbi Mustang Q membraani

(aniooni vahetuse tugi, mis seob ja eemaldab anioonsed molekulid, Pall

Corporation). Enne selle membraani kasutamist liposoomide jaoks juhiti läbi selle20

üksteise järel 4 ml 1 M NaOH-d, 4 ml 1 M NaCl-i ja 10 ml 100 mM tsitraatpuhvrit (pH

6). Liposoome soojendati enne läbi membraani juhtimist 10 minutit temperatuuril 37oC. Seejärel kontsentreeriti liposoomid 2 ml juurde ning dialüüsiti enne lõpp-produkti

eraldamist tangentsiaalse voolu filtreerimist kasutades 10-15 mahu 1x PBS-i vastu.

TFF süsteem ja õõnsa kiuga filtreerimismembraanid osteti asutusest Spectrum25

Labs (Rancho Dominguez) ning neid kasutati tootjapoolseid juhiseid järgides.

Kasutati polüsulfoonist õõnsa kiuga filtreerimismembraane, mille poori suuruse

piirväärtuseks oli 100 kD ning pindalaks 8 cm2. In vitro ja in vivo katsete jaoks

lahjendati koostised 1x PBS-i kasutades vajaliku RNA kontsentratsioonini.

Täiendavaid liposoomide valmistamismeetodeid on kirjeldatud allpool.30

Joonisel fig 2 on kujutatud nende meetoditega valmistatud liposoomide

elektronmikroskoopkujutist. Need liposoomid sisaldavad täispikka RSV F antigeeni

kodeeritavat kapseldatud RNA-d. Ühe partii dünaamilise valguse hajumise

30 EE – EP2590676 B1

mõõtmine andis keskmiseks läbimõõduks 141 nm (intensiivsuse põhjal) või 78 nm

(arvu põhjal).

Kapseldatud RNA protsent ja RNA kontsentratsioon määrati Quant-iT RiboGreen

RNA reaktiivi komplektiga (Invitrogen) tootjapoolseid juhiseid järgides.

Standardkõvera loomiseks kasutati komplektis leiduvat ribosoomse RNA standardit.5

Liposoomid lahjendati enne värvaine lisamist 1x TE puhvris (komplektist) 10x või

100x. Liposoomid lahjendati eraldiseisvalt enne värvaine lisamist samuti 0,5%

Triton X sisaldavas 1X TE puhvris 10x või 100x (liposoomide lõhkumiseks ja seeläbi

kogu RNA analüüsimiseks). Seejärel lisati igasse lahusesse võrdne kogus värvainet

ning ~180 μl iga lahust kanti kahes korduses 96 reservuaariga koekultuuri plaadile.10

Fluorestsents (ergastus: 485 nm, emissioon: 528 nm) loeti mikroplaadi lugejaga.

Kõik liposoomi koostised manustati in vivo kapseldatud RNA koguse põhjal.

Demonstreeriti, et liposoomides kapseldamine kaitses RNA-d RNaasi seedimise

eest. Katsetes kasutati 3,8 mAU RNaas A mikrogrammi RNA kohta (30 minutit

toatemperatuuril inkubeeritult). RNaas inaktiveeriti 10 minuti jooksul proteinaas K-15

ga temperatuuril 55 oC. Seejärel lisati RNA ekstraktimiseks lipiididest veefaasi 1:1

segu, mis koosnes proovist ja 25:24:1 fenooli:kloroformi:isoamüülalkoholi segust.

Proovid segati mõne sekundi jooksul vorteksiga ja tsentrifuugiti seejärel 15 minutit

kiirusel 12 000 pööret minutis. Veefaas (sisaldas RNA-d) eemaldati ja kasutati RNA

analüüsimiseks. Enne sisestamist (400 ng RNA-d reservuaari kohta) inkubeeriti20

kõiki proove formaldehüüdi värvainega, denatureeriti 10 minutit temperatuuril 65 oC

ning jahutati toatemperatuuril. RNA konstruktsiooni molekulmassi umbkaudseks

hindamiseks kasutati Ambion Millenium markereid. Geeli kasutati 90 V juures. Geel

värviti 0,1% SYBR kullaga tootjapoolseid juhiseid järgides vees 1 tund kestva

toatemperatuuril raputamisega. Joonisel fig 1 on näidatud, et RNaas seedib RNA25

kapseldamise puudumisel täielikult (joon 3). RNA on pärast kapseldamist

tuvastamatu (joon 4) ning nende liposoomide töötlemisel RNaasiga (joon 4) muutusi

ei täheldata. Pärast RNaasiga töödeldud liposoomide ekstraktsiooni fenooliga on

näha seedimata RNA-d (joon 6). Isegi pärast 1 nädalat temperatuuril 4 oC on näha

ilma mingisuguse fragmentatsioonita RNA-d (joonis fig 4, nool). In vivo proteiini30

ekspressioon oli pärast kuut nädalat temperatuuril 4 oC ning ühte külmutamise-

sulatamise tsüklit muutumatu. Seega on liposoomi kapseldatud RNA stabiilne.

31 EE – EP2590676 B1

RNA in vivo ekspressiooni hindamiseks kodeeriti replikonis immunogeeni asemel

pigem reporterensüüm (SEAP, eritatud aluseline fosfataas). Ekspressioonitasemed

mõõdeti seerumis, mis oli lahjendatud 1x Phospha-Light lahjenduspuhvris 1:4,

kasutades kemoluminestsentsi aluselise fosfataasi substraati. 8-10 nädala

vanustele BALB/c hiirtele (5 looma grupis) süstiti intramuskulaarselt päeval 0 igasse5

jalga 50 μl 0,1 μg või 1 μg RNA annus. Sama vektor manustati samuti liposoomideta

(RNaasi vabas 1x PBS-is) (1 μg). Analüüsiti ka viriooni pakitud replikone. Siin

kasutatud viriooni pakitud replikonid (VRP-d) valmistati viiteallikas 45 kirjeldatud

meetodiga, kus on kirjeldatud alfaviiruse replikoni, mis pärineb muteerunud VEEV-

ist, või kimääri, mis pärineb VEEV-genoomist, mida on muudetud geneetiliselt10

Sindbisi viiruse 3’ UTR-i ja Sindbisi viiruse pakkimissignaali (PS) sisaldamiseks ja

pakitud läbi koelektroporatsiooni BHK rakkudesse, mis omakorda sisaldavad

Sindbisi viiruse kapsiidi ja glükoproteiini geene kodeerivaid defektiga abistaja RNA-

sid.

Nagu on näidatud joonisel fig 5, suurendas kapseldamine SEAP tasemeid 1 μg15

annuse juures umbes ½ log võrra ning päeval 6 ühtis ekspressioon 0,1 μg

kapseldatud annusest 1 μg kapseldamata annuse korral täheldatuga. Kolmandaks

päevaks ületasid ekspressioonitasemed VRP-dega saavutatu (ruudud). Seega

suurenesid ekspressioonitasemed RNA formuleerimisel liposoomidesse võrreldes

palja RNA kontrolliga ja seda isegi 10x madalamal annusel. Ekspressioon oli samuti20

kõrgem võrreldes VRP kontrolliga, kuid ekspressiooni kineetika oli erinev (vaadake

joonist fig 5). RNA sisestamine elektroporatsiooniga põhjustas ekspressiooni

suurenemise võrreldes palja RNA kontrolliga, kuid need tasemed olid madalamad

kui liposoomide kasutamisel.

Täiendavad SEAP eksperimendid näitasid selget annusele reageerimist in vivo ja25

ekspressiooni täheldati isegi 1 ng RNA manustamisel (joonis fig 6). Täiendavad

eksperimendid, mis võrdlesid ekspressiooni kapseldatud ja paljastest replikonidest

näitasid, et 0,01 μg kapseldatud RNA-d oli samaväärne 1 μg palja RNA-ga. 0,5 μg

RNA annuse korral andis kapseldatud materjal 6. päeval 12 korda suurema

ekspressiooni; 0,1 μg annuse korral olid tasemed 6. päeval 24 korda kõrgemad.30

32 EE – EP2590676 B1

Grupi keskmiste tasemete uurimise asemel vaadeldi samuti individuaalseid

loomasid. Mitmed loomad ei reageerinud paljastele replikonidele, kuid

kapseldamine kõrvaldas selle probleemi.

Täiendavates katsetes asendati DlinDMA DOTAP-iga. Kuigi DOTAP liposoomid

andsid paljast replikonist parema ekspressiooni, olid need nõrgemad kui DlinDMA5

liposoomid (2-3 kordne erinevus päeval 1).

In vivo immunogeensuse hindamiseks valmistati RSV viiruse täispika F proteiini

ekspressiooniks replikon. See manustati päevadel 0 ja 21 paljalt (1 μg),

liposoomidesse kapseldatult (0,1 või 1 μg) või virioonidesse pakitult (106 IU, VRP).

Joonisel fig 7 on kujutatud anti-F IgG tiitreid kaks nädalat pärast teist annust ning10

on näha, et liposoomid parandasid selgelt immunogeensust. Joonisel fig 8 on

kujutatud tiitreid kaks nädalat hiljem ja selleks ajaks puudusid 0,1 μg kapseldatud

RNA, 1 μg kapseldatud RNA ja VRP rühma vahel statistiliselt olulised erinevused.

Neutraliseerimistiitrid (mõõdetud 60% plaagi vähenemisena „PRNT60“) ei olnud

kaks nädalat pärast teise annuse manustamist nendes kolmes grupis statistiliselt15

oluliselt erinevad (joonis fig 9). Joonisel fig 12 on kujutatud nii IgG kui PRNT tiitreid

neli nädalat pärast teise annuse manustamist.

Joonisel fig 13 kujutatu kinnitab, et RNA tekitab robustse T-rakkude vastuse.

Täiendavates katsetes võrreldi hiirte, kellele manustati VRP, 0,1 μg liposoomi

kapseldatud RNA või 1 μg liposoomi kapseldatud RNA, IgG tiitreid. Tiitri suhted20

(VRP:liposoom) erinevatel aegadel pärast teise annuse manustamist olid

alljärgnevad.

2 nädalat 4 nädalat 8 nädalat

0,1 μg 2,9 1,0 1,1

1 μg 2,3 0,9 0,9

Seega indutseerib liposoomi kapseldatud RNA sama ulatusega immuunvastuse kui

viriooni manustamine.

Täiendavad katsed näitasid paremaid F-spetsiifilisi IgG vastuseid 10 μg annuse25

korral, samaväärseid vastuseid 1 μg ja 0,1 μg annuste korral ning madalamaid

vastuseid 0,01 μg annuse korral. Joonisel fig 11 on kujutatud hiirte, kellele oli

33 EE – EP2590676 B1

manustatud paljas vormis replikoni kolm erinevat annust, liposoomi neli erinevat

annust või VRP (106 IU), IgG tiitreid. 1 μg liposoomi kapseldatud RNA kasutamisel

täheldatud vastus oli võrreldes VRP-ga statistiliselt ebaoluline (ANOVA), kuid 10 μg

liposoomi kapseldatud RNA kasutamisel täheldatud kõrgem vastus oli mõlema

rühmaga võrreldes statistiliselt oluline (p < 0,05).5

Täiendav uuring kinnitas, et 0,1 μg liposoomi kapseldatud RNA andis palju suurema

anti-F IgG vastuse (15 päeva pärast teist annust) kui 0,1 μg manustatud DNA ning

oli isegi immunogeensem kui 20 μg F-antigeeni kodeeriv plasmiidi DNA, mis

manustati elektroporatsiooniga (Elgen™ DNA sisestamissüsteem, Innovio).

Hiired ilmutasid pärast liposoomi kapseldatud RNA replikoni manustamist10

mõningaid visuaalseid häiresignaale (kaalukadu jne); samas pärast 10 μg RNA

teise annuse manustamist täheldati põgusat 3-4% kaalu alanemist. Samas 10 μg

liposoomi kapseldatud DNA manustamine põhjustas 8-10% kaalukao.

Toimemehhanism

Luuüdist pärinevad dendriitrakud (pDC) saadi metsiktüüp hiirtest või Resq (rsq1)15

mutantliinist. Mutantliin omas TLR7 retseptori amino-terminuses punktmutatsiooni,

mis kaotas TLR7 signalisatsiooni ilma ligandi sidumist mõjutamata (46). Rakke

stimuleeriti DOTAP-is, lipofektamiinis 2000 või liposoomis valmistatud replikoni

RNA-ga. Nagu on näidatud jooniselt fig 17, indutseeriti IL-6 ja INFα metsiktüüp

rakkudes, kuid see vastus oli mutanthiirtes peaaegu kadunud. Need tulemused20

näitavad, et TLR7 on vajalik RNA äratundmiseks immuunrakkudes ja liposoomi

kapseldatud replikonid võivad põhjustada nii interferoonide kui proinflammatoorsete

tsütokiinide kõrgete tasemete ekskretsiooni immuunrakkudest.

Üldiselt demonstreeriti, et liposoomi sisestatud RNA replikonid indutseerisid 24

tunni jooksul pärast intramuskulaarset süsti mitmeid seerumi tsütokiine (IFN-α, IP-25

10 (CXCL-10), IL-6, KC, IL-5, IL-13, MCP-1 ja MIP-a), samas kui paljas RNA

indutseeris ainult MIP-1 ja ainult liposoom indutseeris ainult IL-6.

Demonstreeriti, et liposoomi kapseldatud RSV-F-kodeeriva replikoni vastases

immuunvastuses osalev IFN-α (anti-IFNα retseptori (IFNAR1) antikeha vähendas

pärast kahte vaktsineerimist F-spetsiifilist seerumi IgG-d kümme korda).30

34 EE – EP2590676 B1

Üldiselt on demonstreeritud, et liposoomist pärinevad RNA replikonid tekitavad

hiirtes tasakaalustatud IgG1:IgG2a alamtüübi profiili ja seda mõnikord kõrgema

IgG2a/IgG1 suhtega kui elektroporeeritud DNA või proteiini/MF59 immuniseerimiste

korral (s.t Th1-tüübi immuunvastus).

Liposoomi tootmismeetodid5

Käesolevale patendile vastavate liposoomide valmistamiseks on kasutatud

kaheksat erinevat meetodit. Need meetodid on tähistatud tekstis kui meetodid (A)

kuni (H) ja erinevad peamiselt filtreerimise ja TFF etappide põhjal. Meetodeid on

kirjeldatud alljärgnevalt.

(A) Valmistati värsked lipiidi emalahused metanoolis. 37 mg DlinDMA-d, 11,8 mg10

DSPC-d, 28,8 mg kolesterooli ja 8,07 mg PEG-DMG-d kaaluti ning lahustati 7,55 ml

etanoolis. Värskelt valmistatud lipiidi emalahust raputati homogeense segu

moodustamiseks õrnalt umbes 15 minutit temperatuuril 37 oC. Seejärel lisati 755 μl

emalahust 1,245 ml etanoolile, saades kasutatava lipiidi emalahuse koguseks 2 ml.

Seda lipiidide kogust kasutati liposoomide valmistamiseks 250 μg RNA-ga. ~1 μg/μl15

emalahusest valmistati 100 mM tsitraatpuhvris (pH = 6) samuti 2 ml RNA lahus.

Kolm 20 ml klaasviaali (segamisvarrastega) loputati Rnase Away lahusega

(Molecular BioProducts, San Diego, CA, USA) ning pesti enne RNaaside viaalide

saastamiseks kasutamist ohtra MilliQ veega. Ühte viaalidest kasutati RNA

töölahuse jaoks ning ülejäänuid rakendati lipiidi ja RNA segude kogumiseks20

(kirjeldatud allpool). Lipiidi ja RNA töölahuseid kuumutati 10 minutit temperatuuril 37oC ning viidi seejärel 3 cm3 luer-lok süstaldesse. 2 ml tsitraatpuhvrit (pH 6) viidi

erinevasse 3 cm3 süstlasse. RNA-d ja lipiide sisaldavad süstlad ühendati T-

mikseriga (PEEK™ 500 μm sisemise läbimõõduga ühendus, Idex Health Sciences,

Oaks Harbor, WA, USA), kasutades ühendusteks FEP tuube (fluoritud25

etüleenpropüleen; kõikide kasutatud FEP tuubide sisemiseks läbimõõduks oli 2 mm

ja välimiseks läbimõõduks oli 3 mm; tuubid pärinesid ettevõttest Idex Health

Science). T-mikseri väljavooluks oli samuti FEP tuub. Kolmas tsitraatpuhvrit

sisaldav süstal ühendati eraldi FEP tuubiga. Kõik süstlad tühjendati seejärel süstla

pumpa kasutades voolu kiirusel 7 ml/minutis. Tuubi väljavooluavade paigutus30

võimaldas segu kogumist 20 ml klaasviaali (segamisega). Segamisvarras võeti välja

ning etanooli/vesilahusel lasti toatemperatuuril 1 tund tasakaalustuda. 4 ml segu

35 EE – EP2590676 B1

viidi 5 cm3 süstlasse, mis ühendati FEP tuubi osaga ning veel üks 5 cm3 süstal, mis

oli ühendatud samapika FEP tuubiga, täideti samaväärse koguse 100 mM

tsitraatpuhvriga (pH 6). Kaks süstalt tühjendati süstla pumpa kasutades kiirusel 7

ml/minutis ning lõplik segu koguti 20 ml klaasviaali (segamisega). Seejärel juhiti

teises segamisetapis kogutud segu (liposoomid) läbi Mustang Q membraani5

(aniooni vahetuse tugi, mis seob ja eemaldab anioonsed molekulid, Pall

Corporation, AnnArbor, MI, USA). Enne Mustang membraani kasutamist

liposoomide jaoks juhiti läbi selle üksteise järel 4 ml 1 M NaOH-d, 4 ml 1 M NaCl-i

ja 10 ml 100 mM tsitraatpuhvrit (pH 6). Liposoome soojendati enne läbi membraani

juhtimist 10 minutit temperatuuril 37 oC. Seejärel kontsentreeriti liposoomid 2 ml10

juurde ning dialüüsiti enne lõpp-produkti eraldamist TFF kasutades 10-15 mahu 1x

PBS-i vastu. TFF süsteem ja õõnsa kiuga filtreerimismembraanid osteti asutusest

Spectrum Labs ning neid kasutati tootjapoolseid juhiseid järgides. Kasutati

polüsulfoonist õõnsa kiuga filtreerimismembraane (toote number: P/N Z1Ab-100-

20P), mille poori suuruse piirväärtuseks oli 100 kD ning pindalaks 8 cm2. In vitro ja15

in vivo katsete jaoks lahjendati koostised 1x PBS-i kasutades vajaliku RNA

kontsentratsioonini.

(B) Analoogne meetodiga (A), v.a segamisjärgne 226,7 μl emalahuse lisamine

1,773 ml etanoolile 2 ml lipiidi emalahuse valmistamiseks, muutes seeläbi

lipiidi:RNA suhet.20

(C) Analoogne meetodiga (B), v.a Mustangi filtreerimise vahele jätmine ning seega

liikusid liposoomid 20 ml klaasviaalist TFF dialüüsi.

(D) Analoogne meetodiga (C), v.a polüeetersulfoonist (PES) õõnsast kiust

membraanide (toote number PC1-100E-100-01N), mille poori suuruse

piirväärtuseks oli 100 kD ning pindalaks 20 cm2, rakendamine TFF-is.25

(E) Analoogne meetodiga (D), v.a Mustangi membraani kasutamine analoogselt

meetodiga (A).

(F) Analoogne meetodiga (A), v.a Mustangi filtreerimise vahele jätmine ning seega

liikusid liposoomid 20 ml klaasviaalist TFF dialüüsi.

36 EE – EP2590676 B1

(G) Analoogne meetodiga (D), v.a see, et ~1 μg/μl emalahusest valmistati 100 mM

tsitraatpuhvris (pH = 6) samuti 4 ml RNA lahus. Seejärel valmistati neli 20 ml

klaasviaali analoogselt ette. Kahte nendest kasutati RNA töölahuse jaoks (2 ml

kumbagi viaali) ning ülejäänuid rakendati lipiidi ja RNA segude kogumiseks

(analoogselt meetodiga (C)). T-mikseri kasutamise asemel ühendati RNA-d ja lipiide5

sisaldavad süstlad Mitos Droplet junction kiibiga (klaasist mikrovoolavuse vahend,

Syrris, toote number 30000158), kasutades PTFE tuube (sisemine läbimõõt: 0,03

tolli; välimine läbimõõt 1/16 tolli) ning neljasuunalist servkonnektorit (Syrris). Kaks

RNA voolu ja üks lipiidi vool loodi süstla pumpadega ning etanooli ja veefaasi

segamine toimus kiibi X ühinemiskohas (100 μm x 105 μm). Kõigi kolme voolu kiirust10

hoiti 1,5 ml/minutis juures ja seega oli kogu veefaasi suhe etanooli voolu 2:1. Tuubi

väljavooluava paigutus võimaldas segude kogumist 20 ml klaasviaali (segamise

ajal). Segamisvarras võeti välja ning etanoolil/vesilahusel lasti 1 tund

toatemperatuuril tasakaalustuda. Seejärel viidi segu 5 cm3 süstlasse, mis ühendati

erineva PTFE tuubi osaga ning veel üks 5 cm3 süstal, mis oli ühendatud samapika15

FEP tuubiga, täideti samaväärse koguse 100 mM tsitraatpuhvriga (pH 6). Kaks

süstalt tühjendati süstla pumpa kasutades kiirusel 3 ml/minutis ning lõplik segu

koguti 20 ml klaasviaali (segamisega). Seejärel kontsentreeriti liposoomid 2 ml

juurde ning dialüüsiti enne lõpp-produkti eraldamist TFF kasutades analoogselt

meetodiga (D).20

(H) Analoogne meetodiga (A), v.a 2 ml lipiidi emalahuse valmistamine läbi 120,9 μl

lipiidi emalahuse segamise 1,879 ml etanooliga. Pärast T-mikseris segamist viidi 20

ml viaalis olevad liposoomid Pierce Slide-A-Lyzer dialüüsi kassetti (Thermo

Scientific, eritugevusega, 0,5-3 ml mahutavus) ja dialüüsiti enne lõpp-produkti

eemaldamist öö jooksul temperatuuril 4 oC autoklaavitud plastkonteineris 400-50025

ml 1X PBS-i vastu.

BHK ekspressioon

Erinevate lipiididega liposoome inkubeeriti öö läbi BHK rakkudega ning seejärel

hinnati nende proteiini ekspressiooni potentsiaali. RV05 saavutatud algväärtusega

võrreldes saab lipiidi ekspressiooni suurendada 18 korda läbi 10% 1,2-difütanoüül-30

sn-glütserol-3-fosfoetanoolamiini (DPyPE) lisamise liposoomile, 10 korda läbi 10%

18:2 (cis) fosfatidüülkoliini lisamise ja 900 korda läbi RV01 kasutamise.

37 EE – EP2590676 B1

In vivo uuringud näitasid, et küllastumata lipiidi sabad võimendasid kodeeritud

antigeenide vastaseid IgG tiitreid.

RSV immunogeensus

RSV F proteiini kodeeriv vA317 iserepliteeruv replikon manustati BALB/c hiirtele (4

või 8 looma grupis) bilateraalsete intramuskulaarsete vaktsineerimistega (50 μl jala5

kohta) päevadel 0 ja 21, kasutades manustamiseks iseseisvat replikoni (1 μl) või

replikoni, mis on formuleeritud liposoomidega DlinDMA (RV01) või DOTAP (RV13).

RV01 liposoomid sisaldasid 40% DlinDMA-d, 10% DSPC-d, 48% kolesterooli ja 2%

PEG-DMG-d ning erinevaid RNA koguseid. RV13 liposoomid sisaldasid 40%

DOTAP-i, 10% DPE-d, 48% kolesterooli ja 2% PEG-DMG-d. Võrdluseks manustati10

elektroporatsiooni või RV01(10) liposoome (0,1 μg DNA) kasutades sama RSVG

antigeeni avaldav paljas plasmiidi DNA (20 μg). Nelja hiirt kasutati naiivse

kontrollgrupina.

Liposoomid valmistati meetodiga (D) või (B). Mõningate meetodiga (D) valmistatud

liposoomide jaoks kasutati topelt või poolt RNA kogust. Liposoomide Z keskmine15

osakese läbimõõt, polüdisperssuse indeks ja kapseldusefektiivsus olid alljärgnevad.

RV Zav (nm) Pdl % kapseldus Valmistamisviis

RV01 (10) 158,6 0,088 90,7 (A)

RV01 (08) 156,8 0,144 88,6 (A)

RV01 (05) 136,5 0,136 99 (B)

RV01 (09) 153,2 0,067 76,7 (A)

RV01 (10) 134,7 0,147 87,8* (A)

RV13 (02) 128,3 0,179 97 (A)

*Selle RV01(10) koostise jaoks oli nukleiinhappeks DNA, mitte RNA

Antikeha analüüsideks kasutatavad seerumiproovid võeti päevadel 14, 36 ja 49.

Hiirte põrnad koguti päeval 49 T-rakkude analüüsiks.

F-spetsiifilised seerumi IgG tiitrid (GMT) olid järgnevad.

20

38 EE – EP2590676 B1

RV Päev 14 Päev 36Paljas DNA plasmiid 439 6712

Paljas A317 RNA 78 2291

RV01 (10) 3020 26 170

RV01 (08) 2326 9720

RV01 (05) 5352 54 907

RV01 (09) 4428 51 316

RV01 (10) DNA 5 13

RV13 (02) 644 3616

Tsütokiin-positiivsete ja RSV F51-66 peptiidi spetsiifiliste T-rakkude proportsioon on

alljärgnev; näidatud on ainult nullist erinevad statistiliselt olulised näitajad.

RV CD4+CD8- CD4-CD8+

IFNγ IL2 IL5 TFNα IFNγ IL2 IL5 TFNα

Paljas DNA plasmiid 0,04 0,07 0,10 0,57 0,29 0,66

Paljas A317 RNA 0,04 0,05 0,08 0,57 0,23 0,67

RV01 (10) 0,07 0,10 0,13 1,30 0,59 1,32

RV01 (08) 0,02 0,04 0,06 0,46 0,30 0,51

RV01 (05) 0,08 0,12 0,15 1,90 0,68 1,94

RV01 (09) 0,06 0,08 0,09 1,62 0,67 1,71

RV01 (10) DNA 0,03 0,08

RV13 (02) 0,03 0,04 0,06 1,15 0,41 1,18

Seega parandasid liposoomi koostised võrreldes paljaste RNA kontrollidega

märkimisväärselt immunogeensust (määratuna läbi suurenenud F-spetsiifiliste IgG

tiitrite ja T-rakkude sageduste). Liposoomidega formuleeritult või paljana5

elektroporatsiooni kasutades manustatuna plasmiidi DNA oli märkimisväärselt

madalama immunogeensusega kui liposoomi formuleeritud isereplitseeruv RNA.

RV01 RNA vaktsiinid olid immunogeensemad kui RV13 vaktsiin. RV01 omas

pearühmas tertsiaarset amiini, mille pKa oli umbes 5,8, ning samuti küllastumata

alküüli sabasid. RV13 omas küllastumata alküüli sabasid, kuid selle pearühm10

sisaldas kvaternaarset amiini ning oli väga tugevalt katioonne.

39 EE – EP2590676 B1

Liposoomid - kapseldamisnõue

Hindamiseks, kas liposoomide rühmades täheldatud mõju oli tingitud pelgalt

liposoomi komponentidest või seotud kapseldamisega, manustati replikon

kapseldatud vormis (kahe erineva puhastusprotokolliga, 0,1 μg RNA) või segatult

liposoomidega pärast nende moodustumist (kapseldamata „lipoplex“, 0,1 μg RNA)5

või palja RNA-na (1 μg). Joonisel fig 10 on näidatud, et lipoplex andis madalaimad

ekspressioonitasemed, mis demonstreerib kapseldatuse olulisust potentsiaalseks

ekspressiooniks.

Täiendavates katsetes rakendati kolme erinevat RNA-d: (i) vA317 replikon, mis

avaldab RSV-F, s.t RSV pinna fusioonglükoproteiin; (ii) vA17 replikon, mis avaldab10

GFP-d; ja (iii) vA336, mis on replikoni defektiga ja kodeerib GFP-d.

RNA-d manustati paljalt või meetodiga (D) valmistatud liposoomidega. Tühjad

liposoomid valmistati meetodiga (D), kuid RNA-d kasutamata. Neljal liposoomi

koostisel olid alljärgnevad omadused:

RNA Osakese suurus Zav (nm) Polüdisperssus RNA kapseldus

vA317 155,7 0,113 86,6%

vA17 148,4 0,139 92%

vA336 145,1 0,143 92,9%

Tühi 147,9 0,147 -

BALB/c hiirtele (5 looma grupis) manustati päevadel 0 ja 21 bilateraalse15

intramuskulaarse vaktsineerimisega (50 μl jala kohta) alljärgnevad koostised:

Grupp 1: paljas isereplitseeruv RSV-F RNA (vA317, 0,1 μg)

Grupp 2: paljas isereplitseeruv RSV-F RNA (vA317, 0,1 μg), mis on kapseldatud

liposoomidesse

Grupp 3: paljas isereplitseeruv RSV-F RNA (vA317, 0,1 μg), mis on lisatud20

tühjadesse liposoomidesse

Grupp 4: F-allüksuse proteiin (5 μg)

40 EE – EP2590676 B1

Seerum koguti antikeha analüüsiks päevadel 14, 35 ja 51. Mõõdeti F-spetsiifilised

seerumi IgG tiitrid (GMT); kui individuaalse looma tiiter oli <25 (tuvastuspiir), määrati

selle tiitriks 5. Lisaks koguti hiirte põrnad päeval 51 T-rakkude analüüsiks, mis

võimaldas määrata rakud, mis olid tsütokiinpositiivsed ja RSV F51-66 peptiidi

(CD4+) või TSV F peptiidide F85-93 ja F249-258 (CD8+) spetsiifilised.5

Alljärgnevalt on avaldatud kümneste gruppide ja immuniseerimata kontrollhiirte IgG

tiitrid.

Päev 1 2 3 4 -14 22 1819 5 5 5

35 290 32 533 9 19 877 5

51 463 30 511 18 20 853 5

Alljärgnevas tabelis on avaldatud RSV seerumi neutraliseerimistiitrid päeval 51.

Päev 1 2 3 451 35 50 24 38

Alljärgnevalt on avaldatud päeval 51 mõõdetud RSV F-spetsiifilisi CD4+ põrna T-

rakkude andmed; arv (positiivsete rakkude %) on avaldatud ainult juhul, kui10

stimuleeritud vastus oli nullist suurem ja statistiliselt oluline.

Tsütokiin 1 2 3 4IFN-γ 0,04

IL2 0,02 0,06 0,02

IL5TFNα 0,03 0,05

Alljärgnevalt on avaldatud päeval 51 mõõdetud RSV F-spetsiifilisi CD8+ põrna T-

rakkude andmed; arv on avaldatud ainult juhul, kui stimuleeritud vastus oli nullist

suurem ja statistiliselt oluline.

Tsütokiin 1 2 3 4IFN-γ 0,37 0,87

IL2 0,11 0,40 0,04

IL5TFNα 0,29 0,79 0,06

41 EE – EP2590676 B1

Seega on kõrge immunogeensuse jaoks vajalik RNA kapseldamine

liposoomidesse, kuna RNA ja liposoomide lihtne segu (grupp 3) ei olnud

immunogeenne (olles isegi vähem immunogeenne kui paljas RNA).

Muudes uuringutes manustati hiirtele erinevad alljärgnevad kombinatsioonid: (i)

isereplitseeruv RNA replikon, mis kodeerib täispikka RSV F proteiini; (ii)5

isereplitseeruv GFP-kodeeriv RNA replikon; (iii) GFP-kodeeriv RNA replikon, mis

omab nsP4-s nokauti, mis omakorda kõrvaldab isereplikatsiooni; ja (iv) täispikk RSV

F-proteiin. 13 grupile manustati alljärgnevad kombinatsioonid.

A - -

B 0,1 μg (i), paljas -

C 0,1 μg (i), liposoomi kapseldatud -

D 0,1 μg (i), eraldi liposoomidega -

E 0,1 μg (i), paljas 10 μg (ii), paljas

F 0,1 μg (i), paljas 10 μg (iii), paljas

G 0,1 μg (i), liposoomi kapseldatud 10 μg (ii), paljas

H 0,1 μg (i), liposoomi kapseldatud 10 μg (iii), paljas

I 0,1 μg (i), liposoomi kapseldatud 1 μg (ii), liposoomi kapseldatud

J 0,1 μg (i), liposoomi kapseldatud 1 μg (iii), liposoomi kapseldatud

K 5 μg F proteiini -

L 5 μg F proteiini 1 μg (ii), liposoomi kapseldatud

M 5 μg F proteiini 1 μg (iii), liposoomi kapseldatud

Joonisel fig 16 avaldatud tulemused näitavad, et F-spetsiifilised IgG vastused

nõudsid pigem liposoomi kapseldamist kui pelgalt koos manustamist (võrrelge10

gruppe C ja D). Gruppide K, L ja M võrdlus näitab, et RNA tekitas koos manustatud

proteiini vastu abiaine toime ja seda toimet täheldati nii replitseeruva kui

mittereplitseeruva RNA kasutamisel.

RSV immunogeensus erinevates hiire tüvedes

Replikon vA142 kodeerib RSV täispikka metsiktüüp pinna fusioon (F) glükoproteiini,15

kuid samas on selle fusioonpeptiid kustutatud ning 3’ ots on moodustunud läbi

ribosüümi vahendatud lõhustamise. Seda analüüsiti kolmes erinevas hiire tüves.

42 EE – EP2590676 B1

BALB/c hiired (5 looma grupis) vaktsineeriti päevadel 0 ja 22 bilateraalse

intramuskulaarse süstiga (50 μl jala kohta). Loomad jagati kaheksasse

analüüsigruppi (viis looma grupi kohta) ja naiivseks kontrolliks (2 looma).

Grupi loomadele 1 manustati paljas replikon (1 μg).

Grupi loomadele 2 manustati 1 μg replikoni liposoomides (RV01(37)) koos 40%5

DlinDMA, 10% DSPC, 48% kolesterooli ja 2% PEG-konjugeeritud DMG-ga.

Grupi loomadele 3 manustati sama koostis kui grupile 2, kuid 0,1 μg RNA-ga.

Grupi loomadele 4 manustati 1 μg replikoni RV17(10) liposoomides (40% RV17

(vaadake eespool), 10% DSPC, 49,5% kolesterooli ja 0,5% PEG-DMG-d).

Grupi loomadele 5 manustati 1 μg replikoni RV05(11) liposoomides (40% RV0710

lipiidi, 30% PE (DLoPE, 28% kolesterooli ja 2% PEG-DMG).

Grupi 6 loomadele manustati 0,1 μg replikoni RV17(10) liposoomides.

Grupi 7 loomadele manustati 5 μg RSV-F allüksuse proteiini, millele oli lisatud

abiainena alumiiniumhüdroksiid.

Gruppi 8 kuulusid naiivsed kontrollid (kaks looma).15

Antikeha analüüsiks võeti päevadel 14, 35 ja 49 seerumi analüüsid. F-spetsiifilise

seerumi IgG GMT-d olid:

Päev 1 2 3 4 5 6 7 814 82 2463 1783 2496 1171 1295 1293 5

35 1538 34 181 25 605 23 579 13 718 8886 73 809 5

F-spetsiifilised IgG1 ja IgG2a tiitrid (GMT) päeval 35 olid alljärgnevad.

IgG 1 2 3 4 5 6 7IgG1 94 6238 4836 7425 8288 1817 78 604

IgG2a 5386 77 064 59 084 33 749 14 437 17 624 24

43 EE – EP2590676 B1

Alljärgnevalt on avaldatud RSV seerumi neutraliseeriva antikeha tiitrid päevadel 35

ja 49 (andmed on 2-5 liidetud hiire 60% plaaki vähendamise neutraliseerimistiitrid,

1 liitproov grupi kohta).

Päev 1 2 3 4 5 6 7 835 <20 143 20 101 32 30 111 <20

49 <20 139 <20 83 41 32 1009 <20

Põrnad koguti päeval 49 T-rakkude analüüsiks. Alljärgnevalt on avaldatud

keskmised reaalsed F-spetsiifiliste tsütokiin-positiivsete T-rakkude sagedused5

(CD4+ või CD8+) (näidatud on ainult nullist suuremad statistiliselt olulised

tulemused (RSV peptiidide F51-66, F164-178 ja F309-323 (CD4+ jaoks) või

peptiidide F85-93 ja F249-258 (CD8+ jaoks) spetsiifilised)).

Rühm CD4+CD8- CD4-CD8+

IFNγ IL2 IL5 TFNα IFNγ IL2 IL5 TFNα

1 0,03 0,06 0,08 0,47 0,29 0,48

2 0,05 0,10 0,08 1,35 0,52 1,11

3 0,03 0,07 0,06 0,64 0,31 0,61

4 0,05 0,09 0,07 1,17 0,65 1,09

5 0,03 0,08 0,07 0,65 0,28 0,57

6 0,05 0,07 0,07 0,74 0,36 0,66

7 0,02 0,04 0,04

8

C57BL/6 hiired immuniseeriti analoogsete meetoditega, kuid 9. grupile manustati

VRP-d (1x106 IU), mis avaldavad RSV täispikka metsiktüüp pinna10

fusioonglükoproteiini (fusioonpeptiidi deletsioon).


seerumi IgG tiitrid (GMT) olid alljärgnevad.

Päev 1 2 3 4 5 6 7 8 914 1140 2133 1026 2792 3045 1330 2975 5 1101

35 1721 5532 3184 3882 9525 2409 39 251 5 12 139

44 EE – EP2590676 B1


IgG 1 2 3 4 5 6 7 8IgG1 66 247 14 328 468 92 56 258 79

IgG2a 2170 7685 5055 6161 1573 2944 35 14 229

Alljärgnevalt on avaldatud RSV seerumi neutraliseeriva antikeha tiitrid päevadel 35

ja 49 (andmed on 2-5 liidetud hiire 60% plaaki vähendamise neutraliseerimistiitrid,

1 liitproov grupi kohta).

Päev 1 2 3 4 5 6 7 8 935 <20 27 29 22 36 <20 28 <20 <20

49 <20 44 30 23 36 <20 33 <20 37

Põrnad koguti päeval 49 T-rakkude analüüsiks. Alljärgnevalt on avaldatud5

keskmised reaalsed F-spetsiifiliste tsütokiin-positiivsete T-rakkude sagedused

(CD8+) (näidatud on ainult nullist suuremad statistiliselt olulised tulemused (RSV

peptiidide F85-93 ja F249-258 spetsiifilised)).

Grupp CD4-CD8+

IFNγ IL2 IL5 TFNα

1 0,42 0,13 0,37

2 1,21 0,37 1,02

3 1,01 0,26 0,77

4 1,26 0,23 0,93

5 2,13 0,70 1,77

6 0,59 0,19 0,49

7 0,10 0,05

8

9 2,83 0,72 2,26

Üheksa C3H/HeN hiirte gruppi immuniseeriti analoogse meetodiga. F-spetsiifilised

IgG tiitrid (GMT) olid järgnevad.10

Päev 1 2 3 4 5 6 7 8 914 5 2049 1666 1102 298 984 3519 5 806

35 152 27 754 19 008 17 693 3424 6100 62 297 5 17 249

45 EE – EP2590676 B1


IgG 1 2 3 4 5 6 7 8IgG1 5 1323 170 211 136 34 83 114 189

IgG2a 302 136 941 78 424 67 385 15 667 27 085 3800 72 727

Alljärgnevas tabelis on avaldatud RSV seerumi neutraliseeriva antikeha tiitrid

päevadel 35 ja 49.

Päev 1 2 3 4 5 6 7 8 935 <20 539 260 65 101 95 443 <20 595

49 <20 456 296 35 82 125 1148 <20 387

Kolme erinevat lipiidi (RV01, RV05 ja RV17; pKa 5,8, 5,85 ja 6,1) analüüsiti kolmes

erinevas sisearetatud hiireliinis. Kõigis kolmes liinis oli RV01 efektiivsem kui RV17;5

BALB/c ja C3H liinides oli RV05 madalama efektiivsusega kui RV01 või RV17,

osutudes samas efektiivsemaks B6 tüves. Kuid kõikide juhtudel olid liposoomid

efektiivsemad kui kaks paralleelselt analüüsitud katioonset nanoemulsiooni.

CMV immunogeensus

Tsütomegaloviiruse (CMV) glükoproteiine kodeerivate RNA replikonide10

sisestamiseks kasutati RV01 liposoome koos DLinDMA kui katioonse lipiidiga.

vA160 replikon kodeerib täispikkasid glükoproteiine H ja L (gH/gL), samas kui vA322

replikon kodeerib lahustuvat vormi (gHsol/gL). Need kaks proteiini on ühes

replikonis asuvate eraldi subgenoomsete promootorite kontrolli all; kahe eraldi

vektori, millest üks kodeerib gH ja teine kodeerib gL, koos manustamine häid15

tulemusi ei andnud.

BALB/c hiirtele (10 hiirt grupi kohta) manustati päevadel 0, 21 ja 42 bilateraalse

intramuskulaarse vaktsineerimisega (50 μl jala kohta) VRP-d, mis avaldasid gH/gL

(1x106 IU), VRP-d, mis avaldasid gHsol/gl (1x106 IU) ja PBS (kontroll). Kahele

analüüsitavale grupile manustati 1 μg vA160 või vA322 replikoni, mis oli20

formuleeritud liposoomides (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% kolesterooli ja 2%

PEG-DMG; valmistatud meetodiga (D), kuid 150 μg RNA partiiga).

46 EE – EP2590676 B1

vA160 liposoomide Zav läbimõõt oli 168 nm, pdl oli 0,144 ja kapseldusprotsendiks

oli 87,4. vA322 liposoomide Zav läbimõõt oli 162 nm, pdl oli 0,131 ja

kapseldusprotsendiks oli 90.

Replikonid suutsid avaldada ühest vektorist kahte proteiini.

Seerum koguti immunoloogiliseks analüüsiks päeval 63 (3wp3). CMV5

neutraliseerimistiitrid (kontrolliga võrreldes positiivsete viiruse fookuste arvu 50%

vähenemise (reservuaari kohta) põhjustava seerumi lahjenduse pöördväärtus) olid

järgnevad.

gH/gL VRP gHsol/gL VRP gH/gL liposoom gHsol/gL liposoom4576 2393 4240 10 062

CMV gH/gL kompleksi täispikka või lahustuvat vormi avaldav RNA põhjustas seega

epiteelrakkudel analüüsides kõrgeid neutraliseeriva antikeha tiitreid. Liposoomi10

kapseldatud RNA-de poolt tekitatud keskmised tiitrid olid vähemalt sama kõrged kui

vastavate VRP-de jaoks.

Korduskatsed kinnitasid, et replikon suutis avaldada ühest vektorist kahte proteiini.

RNA replikon andis 3wp3 tiitriks 11 457 (võrreldes VRP-dega saadud 5516).

Täiendavates katsetes rakendati lisaks vA160-le erinevaid replikone. vA52615

replikon avaldab kolme subgenoomse promootori kontrolli all CMV pentameerset

kompleksi (gH-gL-UL128-UL130-UL-131): esimene promootor juhib gH

ekspressiooni; teine promootor juhib gL ekspressiooni; kolmas promootor juhib

UL128-2A-UL130-2AUL131 polüproteiini ekspressiooni, mis sisaldab kolme UL

geeni vahel kahte 2A lõhustumissaiti. vA527 replikon avaldab läbi kolme20

subgenoomse promootori ja kahe IRES-e CMV pentameerset kompleksi: esimene

subgenoomne promootor juhib gH ekspressiooni; teine subgenoomne promootor

juhib gL ekspressiooni; kolmas subgenoomne promootor juhib UL128

ekspressiooni; UL130 on EMCV IRES-e kontrolli all; ja UL131 on EV71 IRES-e

kontrolli all. Need kolm replikoni manustati liposoomiga (meetod (H)) (150 μg partii25

suurus) või VRP-dega.

47 EE – EP2590676 B1

BALB/c hiirtele (kümme gruppi, igas grupis kümme looma) manustati päevadel 0,

21 ja 42 bilateraalse intramuskulaarse vaktsineerimisega (50 μl jala kohta)

alljärgnevad koostised:

Grupp 1: VRP-d, mis avaldavad gH FL/gL (1x106 IU)

Grupp 2: pentameerne, 2A VRP (1x105 IU)5

Grupp 3: pentameerne, 2A VRP (1x106 IU)

Grupp 4: pentameerne, IRES VRP (1x105 IU)

Grupp 5: isereplitseeruv RNA, vA160 (1 μg), formuleeritud liposoomides

Grupp 6: isereplitseeruv RNA, vA526 (1 μg), formuleeritud liposoomides

Grupp 7: isereplitseeruv RNA, vA527 (1 μg), formuleeritud liposoomides10

Grupp 8: isereplitseeruv RNA, vA160 (1 μg), formuleeritud katioonses

nanoemulsioonis

Grupp 9: isereplitseeruv RNA, vA526 (1 μg), formuleeritud katioonses

nanoemulsioonis

Grupp 10: isereplitseeruv RNA, vA527 (1 μg), formuleeritud katioonses15

nanoemulsioonis

Seerum koguti immunoloogiliseks analüüsiks päevadel 21 (3wp1), 42 (3wp2) ja 63

(3wp3).

CMV seerumi neutraliseerimistiitriteks päevadel 21, 42 ja 63 olid:

Vaktsiini grupp 3wP1 3wp2 3wp31 126 6296 26 525

2 P/S P/S 6769

3 P/S 3442 7348

4 P/S P/S 2265

5 347 9848 42 319

6 179 12 210 80 000

48 EE – EP2590676 B1

Vaktsiini grupp 3wP1 3wp2 3wp37 1510 51 200 130 000

8 P/S P/S 845

9 P/S P/S 228

10 P/S P/S 413

Seega saab isereplitseeruvat RNA-d kasutada mitme antigeeni ekspressiooniks

ühest vektorist ning potentse ning spetsiifilise immuunvastuse tekitamiseks.

Replikon võib avaldada viit antigeeni (CMV pentameerne kompleks (gH-gL-UL128-

UL130-UL131) ning tekitada potentsiaalse immuunvastuse. Liposoomides

sisestatud isereplitseeruv RNA oli võimeline vastavalt epiteelrakkudel analüüsitule5

tekitama igas analüüsi kontrollpunktis (3wp1, 3wp2 ja 3wp3) neutraliseeriva

antikeha kõrgeid tiitreid. Need vastused oli vastavatest VRP-dest ning katioonsetest

nanoemulsioonidest paremad.

Manustatav kogus

Hüdrodünaamiline manustamine rakendab jõudu, mis tekitatakse läbi suure koguse10

lahuse kiire injektsiooni rakumembraanide, mis takistavad suurte ja membraani

läbimatute ühendite rakku sisenemist, füüsilise barjääri ületamiseks. Varasemast on

teada, et see fenomen on kasulik DNA vaktsiinide intratsellulaarseks sisestamiseks.

Tüüpiliseks intramuskulaarse süstiga hiirde sisestatavaks koguseks on 50 μl

tagumisse jalga, mis on hiire jalalihase jaoks suhteliselt suureks koguseks. Samas15

inimesele manustatav ~0,5 ml intramuskulaarne annus on suhteliselt väike. Kui

hiirtes avalduv immunogeensus sõltuks mahust, oleks replikoni vaktsiini efektiivsus

tingitud vähemalt osaliselt hüdrodünaamilistest jõududest, mis omakorda ei

soodustaks samade vaktsiinide kasutamist inimestes ja suurtes imetajates.

vA317 replikon manustati 10 BALB/c hiire suurustele gruppidele päevadel 0 ja 2120

bilateraalse intramuskulaarse vaktsineerimisega (5 või μg jala kohta).

Grupi 1 loomadele manustati paljas replikon, 0,2 μg/50 μl jala kohta

Grupi 2 loomadele manustati paljas replikon, 0,2 μg/5 μl jala kohta

49 EE – EP2590676 B1

Grupi 3 loomadele manustati liposoomi formuleeritud replikon, 0,2 μg/50 μl jala

kohta

Grupi 4 loomadele manustati liposoomi formuleeritud replikon, 0,2 μg/5 μl jala kohta


seerumi IgG GMT-d olid:5

Päev 1 2 3 414 42 21 2669 2610

35 241 154 17 655 18 516

Seega ei varieerunud moodustunud replikon immunogeensus vastavalt

manustatavale kogusele, näidates, et nende RNA vaktsiinide efektiivsus ei põhine

hüdrodünaamilisel sisestamisel.

Ekspressiooni kineetika

Sisestamisjärgse proteiini ekspressiooni kineetika uurimiseks kasutati10

isereplitseeruvat RNA replikoni (vA311), mis avaldab lutsiferaasi reportergeeni (luc).

BALB/c hiirtele (5 looma grupis) manustati päeval 0 bilateraalse intramuskulaarse

vaktsineerimisega (50 μl jala kohta) alljärgnevad koostised:

Grupp 1: lutsiferaasi avaldav DNA, mille sisestamiseks kasutati elektroporatsiooni

(10 μg)15

Grupp 2: isereplitseeruv RNA (1 μg), formuleeritud liposoomides

Grupp 3: isereplitseeruv RNA (1 μg), formuleeritud katioonses nanoemulsioonis

Grupp 4: isereplitseeruv RNA (1 μg), formuleeritud katioonses nanoemulsioonis

Grupp 5: VRP (1x106 IU) avaldav lutsiferaas

Hiired epileeriti enne vaktsineerimist. Hiired uinutati (2% isofluraan hapnikus) ning20

karvad eemaldati esmalt elektrilise pardliga ja seejärel keemiliselt Nair abil.

Bioluminestsentsi andmed mõõdeti seejärel päevadel 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49,

63 ja 70 Xenogen IVIS 200 tomograafiasüsteemiga (Caliper Life Sciences). Viis

minutit enne tomograafiat süstiti hiirtele intraperitoneaalselt 8 mg/kg lutsiferiini

50 EE – EP2590676 B1

lahust. Loomad uinutati seejärel ning viidi tomograafia süsteemi. Kujutise

registreerimise aegasid hoiti konstantsena, kuna bioluminestsentssignaal mõõdeti

jahutatud CCD kaameraga.

Visuaalselt täheldati, et lutsiferaasi avaldavad rakud jäid peamiselt RNA

sisestamiskohta ning loomad, kelle kujutised võeti pärast kvadraatide eemaldamist,5

signaali ei demonstreerinud.

Kvantitatiivsuse mõistes mõõdeti lutsiferaasi ekspressiooni keskmise kiirgusena 70

päeva jooksul (p/s/cm2/sr) ning viie grupi tulemused on avaldatud alljärgnevalt.

Päev 1 2 3 4 53 8,69E+07 3,33E+06 2,11E+06 9,71E+06 1,46E+07

7 1,04E+08 8,14E+06 1,83E+07 5,94E+07 1,64E+07

14 8,16E+07 2,91E+06 9,22E+06 3,48E+07 8,49E+05

21 1,27E+07 3,13E+05 6,79E+04 5,07E+05 6,79E+05

28 1,42E+07 6,37E+05 2,36E+04 4,06E+03 2,00E+03

35 1,21E+07 6,12E+05 2,08E+03

42 1,43E+07 8,70E+05

49 1,17E+07 2,04E+05

63 9,69E+06 1,72E+03

70 9,29E+06

Katioonsete nanoemulsioonidega formuleeritud isereplitseeruv RNA demonstreeris

mõõdetavat bioluminestsentsi päeval 3, mis saavutas oma tipu päeval 7 ja alanes10

seejärel päevadeks 28 kuni 35 taustväärtusele tagasi. Liposoomidega formuleeritult

demonstreeris RNA mõõdetavat bioluminestsentsi päeval 3, mis saavutas oma tipu

päeval 7 ja naasis päevaks 63 taustväärtusele. VRP-sid kasutades manustatud

RNA demonstreeris formuleeritud RNA-ga võrreldes võimendatud bioluminestsentsi

päeval 21, kuid ekspressioon oli alanenud päevaks 28 taustväärtuse juurde.15

Elektroporeeritud DNA demonstreeris kõrgeimat bioluminestsentsi taset kõikidel

mõõtmisaegadel ning bioluminestsentsi tase ei alanenud 70 katsepäeva jooksul

tausta tasemele.

51 EE – EP2590676 B1

Manustamisviis

HIV gp140 kodeeriv liposoomi kapseldatud RNA manustati hiirtele

intramuskulaarselt, intradermaalselt või subkutaanselt. Kõik kolm manustamisviisid

tekitasid kõrged seerumi HIV spetsiifiliste antikehade IgG tasemed (joonis fig 15),

mis ületasid tiitreid, mida täheldati vastusena elektroporeeritud intramuskulaarse5

DNA manustamisele.

Puuvillarotid

Uuring sooritati hiirte asemel puuvillarottides (Sigmodon hispidis). 1 mg annuse

juures suurendas liposoomi kapseldamine F-spetsiifilisi IgG tiitreid võrreldes palja

RNA-ga 8,3 korda ja PRNT tiitreid 9,5 korda. Antikeha vastuse magnituud oli10

võrdväärne 5x106 IU VRP poolt tekitatuga. Nii paljas kui liposoomi kapseldatud RNA

suutsid puuvillarotte RSV (1x105 plaake moodustavat ühikut) nakatumise eest

kaitsta, vähendades kopsu viirusesisaldust vähemalt 3,5 log. Kapseldamine

suurendas seda alanemist umbes kaks korda.

Täiendavad puuvillarottidega sooritatud analüüsid rakendasid nelja erinevat15

replikoni: vA317 avaldab täispikka RSV-F; vA318 avaldab lühendatud

(transmembraan ja tsütoplasmiline saba eemaldatud) RSV-F; vA142 avaldab RSV-

F koos kustutatud fusioonpeptiidiga; ja vA140 avaldab lühendatud RSV-F ilma selle

peptiidita. Puuvillarotid (4 kuni 8 looma grupis) vaktsineeriti intramuskulaarselt (100

μl ühte jalga) päevadel 0 ja 21 nelja erineva replikoni kahe annusega (1,0 ja 0,1 μg),20

mis oli formuleeritud meetodiga (D) valmistatud liposoomides, kuid 150 μg RNA

partii suurusega. Kontrollgrupile manustati RSVF allüksuse proteiini vaktsiin (5 μg),

millele oli lisatud abiainena maarjajää (8 looma/grupis), täispikka RSV-F avaldavad

VRP-d (1x106 IU, 8 looma grupis) või kasutati neid naiivsete kontrollidena (4 looma

grupis). Seerum koguti antikeha analüüsiks päevadel 0, 21 ja 34.25

F-spetsiifilisteks seerumi IgG tiitriteks ja RSV seerumi neutraliseeriva antikeha

tiitriteks päevadel 21 ja 34 olid:

Rühm IgG, päev21

IgG, päev34

NT, päev21

NT, päev34

52 EE – EP2590676 B1

1 μg vA317 915 2249 115 459

0,1 μg vA317 343 734 87 95

1 μg vA318 335 1861 50 277

0,1 μg vA318 129 926 66 239

1 μg vA142 778 4819 92 211

0,1 μg vA142 554 2549 78 141

1 μg vA140 182 919 96 194

0,1 μg vA140 61 332 29 772

5 μg F trimeeri

allüksus/maarjajää

13 765 86 506 930 4744

1x106 IU VRP-F täielik 1877 19 179 104 4528

Naiivne 5 5 5 5

Kõik selles katses uuritud neli replikoni (vA317, vA318, vA142 ja vA140) olid

liposoomis manustatuna puuvillarottides immunogeensed, samas seerumi

neutraliseerimistiitrid olid vähemalt kümme korda madalamad näitajatest, mis

tekitati abiainega proteiini vaktsiinide või VRP-dega. Liposoomi/RNA vaktsiinid

tekitasid pärast esimest vaktsineerimist seerumi F-spetsiifilise ja IgG5

neutraliseerivad antikehad ning teine vaktsineerimine täiendas vastust efektiivselt.

Teise vaktsineerimise järgsed (1 μg replikoniga) F-spetsiifilised IgG tiitrid olid 2 kuni

3 korda kõrgemad kui pärast teist vaktsineerimist 0,1 μg replikoniga. Need neli

replikoni tekitasid võrreldavad antikeha tiitrid, mis võimaldab eeldada, et täispikk ja

lühendatud RSV-F, mis kõik on fusioonpeptiidiga või ilma selleta, on puuvillarottides10

samuti immunogeensed.

Täiendavates puuvillarottide uuringutes kasutati vA317, vA318 ja vA142 replikone.

Puuvillarotid (2 kuni 8 looma grupis) vaktsineeriti intramuskulaarselt (100 μl ühte

jalga) päevadel 0 ja 21 replikonidega (0,1 ja 0,1 μg), mis olid kapseldatud meetodiga

(D) valmistatud RV01 liposoomides, kuid 150 μg RNA partii suurusega.15

Kontrollgrupi loomadele manustati RSV-F allüksuse proteiini vaktsiin (5 μg), millele

oli lisatud abiainena maarjajääd, või VRP-dega, mis avaldasid täispikka RSV-F

(1x106 IU, 8 looma grupis). Kõik need loomad vaktsineeriti kolmandat korda (päev

56) RSV-F allüksuse proteiini vaktsiiniga (5 μg), millele oli lisatud abiainena

maarjajääd. Lisaks sellele kasutati naiivset kontrolli (4 looma grupis). Lisaks20

53 EE – EP2590676 B1

vaktsineeriti ühe grupi loomad päevadel 0 ja 56 bilateraalsete intramuskulaarsete

vaktsineerimistega (50 μl jala kohta), kasutades 1 μg vA317 RNA-ga liposoomides;

samas jäeti kolmas vaktsineerimine allüksuse proteiini vaktsiiniga sooritamata.

Antikeha analüüsiks võeti päevadel 0, 21, 35, 56 ja 70 ning lisagrupis ka päevadel

14, 28 ja 42 seerumi proovid. F-spetsiifilised seerumi IgG tiitrid (GMT) olid5

järgnevad.

Päev 21 Päev 35 Päev 56 Päev 701 μg vA318 260 1027 332 14 263

0,1 μg vA318 95 274 144 2017

1 μg vA142 483 1847 1124 11 168

0,1 μg vA142 314 871 418 11 023

1 μg vA317 841 4032 1452 13 852

1x106 VRP (F-täielik) 2075 3938 1596 14 574

5 μg F trimeeri allüksus/maarjajää 12 685 54 526 25 846 48 864

Naiivne 5 5 5 5

Alljärgnevalt on avaldatud seerumi neutraliseerimistiitrid (60% RSV

neutraliseerimistiitrid kahe liidetud proovi jaoks (3-4 looma grupis) - kahe liidetud

proovi (grupi kohta) GMT):

Päev 21 Päev 35 Päev 56 Päev 701 μg vA318 58 134 111 6344

0,1 μg vA318 41 102 63 6647

1 μg vA142 77 340 202 5427

0,1 μg vA142 35 65 56 2223

1 μg vA317 19 290 200 4189

1x106 VRP (F-täielik) 104 1539 558 2876

5 μg F trimeeri allüksus/maarjajää 448 4457 1630 3631

Lisarühma seerumi tiitrid ja neutraliseerivad tiitrid olid alljärgnevad.10

54 EE – EP2590676 B1

Päev 14 21 28 35 42 56 70IgG 397 561 535 501 405 295 3589

NT 52 82 90 106 80 101 1348

See kinnitab replikonide immunogeensust puuvillarottides, tekitades pärast esimest

vaktsineerimist seerumi F-spetsiifilised IgG ja RSV neutraliseerivad antikehad.

Teine vaktsineerimine võimendas neid vastuseid efektiivselt. Teise vaktsineerimise

järgsed (1,0 μg replikoniga) F-spetsiifilised IgG tiitrid olid 1,5 kuni 4 korda kõrgemad5

kui pärast teist vaktsineerimist 0,1 μg replikoniga.

Kolmas vaktsineerimine (proteiin päeval 56) ei võimendanud eelnevalt F-trimeeri

allüksuse + maarjajääga vaktsineeritud puuvillarottide tiitreid, kuid suurendas

eelnevalt replikoniga vaktsineeritud puuvillarottide tiitreid ulatuslikult. Enamustel

juhtudel olid RSV seerumi neutraliseerimistiitrid pärast kahte replikoniga10

vaktsineerimist ning sellele järgnevat proteiini booster-annust samaväärsed või

paremad tiitritest, mis saadi kahe või kolme järjestikkuse proteiiniga

vaktsineerimisega.

Selles uuringus hinnati samuti antikeha vastuse kineetikat 1,0 μg vA317-le. Ühe

vaktsineerimisega indutseeritud F-spetsiifilised IgG ja RSV neutralisatsiooni tiitrid15

saavutasid oma tipu umbes päevaks 21 ning säilisid vähemalt päevani 56 (50-70%

F-spetsiifilise IgG tiitri langus, vähene muutus RSV neutralisatsiooni tiitris).

Loomadel sooritati päeval 56 homoloogne teine vaktsineerimine ning täheldati

võimendunud antikeha tiitreid, mis ulatusid tasemeni, mis oli vähemalt võrdne

tasemega, mis saavutati teise vaktsineerimise sooritamisel päeval 21.20

Täiendavad katsed hõlmasid viirusega nakatamist. vA368 replikon kodeerib RSV

täispikka metsiktüüp pinna fusioon glükoproteiini (kustutatud fusioonpeptiidiga),

mille ekspressiooni omakorda juhib EV71 IRES. Puuvillarottidele (7 looma grupis)

manustati intramuskulaarselt päevadel 0 ja 21 (100 μl jala kohta) vA368

liposoomides, mis valmistati meetodiga (H), 175 μg RNA partii suurus, või sama25

replikoniga VRP-dega. Kontrollgrupi loomadele manustati 5 μg maarjajääst

abiainega proteiini ning katsesse kaasati ka naiivne kontrollgrupp.

55 EE – EP2590676 B1

Kõik grupid nakatati neli nädalat pärast viimast immuniseerimist intranasaalselt (i.n)

1x106 PFU RSV-ga. Antikeha analüüsideks võeti päevadel 0, 21 ja 35 seerumi

proovid. Viiruse tiitreid kopsus mõõdeti viis päeva pärast nakatamist. Tulemused

olid alljärgnevad:

Liposoom VRP Proteiin Naiivne

F-spetsiifilise seerumi IgG tiitrid (GMT)

Päev 21 370 1017 28 988 5

Päev 35 2636 2002 113 843 5

Neutraliseerivad tiitrid (GMT)

Päev 21 47 65 336 10

Päev 35 308 271 5188 10

Kopsu viirussisaldus (pfu grammi kopsu kohta)

Päev 54 422 225 124 694 110

Seega vähendas RNA vaktsiin kopsu viirussisaldust üle kolme log - umbes 1065

PFU/g juurest (vaktsineerimata kontroll-puuvillarotid) vähem kui 103 PFU/g juurde

(vaktsineeritud puuvillarotid).

Suurte imetajatega sooritatud katse

Suurte imetajate katses kasutati kariloomi. Vasikad (4-6 nädala vanused, ~60-80

kg, viis looma grupis) immuniseeriti päevadel 0, 21, 86 ja 146 66 μg replikoniga10

vA317, mis kodeerib täispikka RSV F proteiini. Replikonid formuleeriti liposoomides.

Negatiivse kontrollina kasutati ainult PBS-i ning positiivse kontrollina kasutati

litsentseeritud vaktsiini (Triangle 4 asutusest Fort Dodge, sisaldab tapetud viirust).

Kõikidele vasikatele manustati päeval 146 15 μg F-proteiini, millele oli lisatud

abiainena MF59 emulsioon. Üks lehm vaktsineeriti päeval 86 kogemata vale15

vaktsiiniga (mitte Triangle 4) ning selle andmed alates päevast 100 on katsest välja

jäetud.

RNA vaktsiinid sisaldasid inimese RSV F, samas kui Triangle 4 vaktsiin sisaldas

veise RSV F (RSV F proteiin on BRSV ja HRSV vahel tugevalt konserveerunud).

Liposoomid valmistati meetodiga (E), v.a 1,5 μg RNA partii kasutamine.20

56 EE – EP2590676 B1

Vasikatele manustati 2 ml iga eksperimentaalset vaktsiini, mis manustati

intramuskulaarselt 2 x 1 ml kumbagi kaela poolde. Samas Triangle 4 vaktsiin

manustati ühe 2 ml annusena kaela.

Antikeha analüüsiks võeti päevadel 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121,

128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195 ja 202 seerumiproovid. Kui5

individuaalse looma tiitrid jäid tuvastuspiirist madalamale, määrati nende tiitri

väärtuseks 5.

Joonisel fig 14A on kujutatud F-spetsiifilisi IgG tiitreid esimese 63 päeva jooksul.

RNA replikon oli lehmades läbi liposoomide manustatuna immunogeenne, kuid

samas olid tiitrid madalamad kui litsentseeritud vaktsiini korral. Kõikides10

vaktsineeritud lehmades esines pärast teist annust F-spetsiifilisi antikehasid ning

tiitrid olid 2 kuni 6 nädala jooksul pärast teise annuse manustamist väga stabiilsed

(ning eriti stabiilsed RNA vaktsiinide kasutamisel).

Joonisel fig 14B on kujutatud F-spetsiifilisi seerumi IgG tiitreid (GMT) 210 päeva

jooksul ning mõõdetud väärtused päevani 202 olid alljärgnevad.15Päev

0

3wp1

P21

2wp2

P35

5wp2

P56

~9wp2

P86

2wp3

P100

5wp3

P121

8wp3

P146

2wp4

P160

5wp4

P181

8wp4

P202

PBS 5 5 5 5 5 5 5 5 46 98 150

Lipo-

soom

5 5 12 11 20 768 428 74 20 774 7022 2353

Triangle

4

5 5 1784 721 514 3406 2786 336 13 376 4775 2133

RSV seerumi neutraliseeriva antikeha tiitrid olid järgnevad.Päev 0 2wp2

P35

5wp2

P56

2wp3

P100

3wp3

P107

4wp3

P114

8wp3

P146

2wp4

P160

3wp4

P167

4wp4

P174

PBS 12 10 10 14 18 20 14 10 10 10

Liposoom 13 10 10 20 13 17 13 47 26 21

Triangle 4 12 15 13 39 38 41 13 24 26 15

Teiseks liposoomi annuseks kasutatud materjal ei olnud värskelt valmistatud ning

sama RNA partii demonstreeris hiire immunogeensuse uuringus potentsuse

vähenemist. Seega on võimalik, et vaktsiin võinuks osutuda juhul, kui kõikideks

vaktsineerimisteks rakendati värsket materjali, veelgi immunogeensemaks.20

57 EE – EP2590676 B1

Komplemendiga analüüsimisel tuvastati kõikides vaktsineeritud lehmades

neutraliseerivad antikehad. Selles analüüsis omasid kõik vaktsineeritud vasikad

pärast teist RNA-ga vaktsineerimist häid neutraliseeriva antikeha tiitreid. Lisaks

tekitas RNA vaktsiin F-spetsiifilise seerumi IgG tiitrid, mis tuvastati pärast teist

vaktsineerimist vähestes vasikates, kuid pärast kolmandat vaktsineerimist kõikides5

vasikates.

MF59-abiainega RSV-F oli võimeline võimendama IgG vastust kõikides varem

vaktsineeritud vasikates ning võimendama komplemendist sõltumatuid

neutralisatsiooni tiitreid vasikatel, kes olid eelnevalt RNA-ga vaktsineeritud.

RNA vaktsiinide toimimise kinnitus suurtes imetajates on ülimalt oluline, kuna10

varasemate DNA põhiste vaktsiinide kasutamisel täheldati väikelooma mudelitest

suurte imetajate ja inimeste mudelitele liikudes potentsuse kadu. Üheks tüüpiliseks

veise DNA vaktsiini annuseks oleks 0,5-1 mg (47 ja 48) ning seega on asjaolu, et

immuunvastused saavutati ainult 66 μg RNA-ga, väga paljutõotav.

Tabel 1: kasulikud fosfolipiidid15

DDPC: 1,2-didekanoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DEPA: 1,2-dierukoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DEPC: 1,2-erukoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DEPE: 1,2-dierukoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DEPG: 1,2-dierukoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rats-(1-glütserool…)20

DLOPC: 1,2-linoleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DLPA: 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DLPC: 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DLPE: 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DLPG: 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rats-(1-glütserool…)25

DLPS: 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

DMG: 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfoetanoolamiin

DMPA: 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DMPC: 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DMPE: 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin30

DMPG: 1,2-müristoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rats-(1-glütserool…)

58 EE – EP2590676 B1

DMPS: 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

DOPA: 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DOPC: 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DOPE: 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DOPG: 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rats-(1-glütserool…)5

DOPS: 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

DPPA: 1,2-dipamitoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DPPC: 1,2-dipamitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DPPE: 1,2-dipamitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DPPG: 1,2-dipalmitoüül-sn-glütserol-3[fosfatidüül-rats-(1-glütserool…)10

DPPS: 1,2-dipamitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

DPyPE: 1,2-difütanoüül-sn-glütsero-3-fosfoetanoolamiin

DSPA: 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DSPC: 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DSPE: 1,2-diosterüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin15

DSPG: 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rats-(1-glütserool…)

DSPS: 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

EPC: muna-PC

HEPC: hüdrogeenitud muna PC

HSPC: suure puhtusega hüdrogeenitud soja PC20

HSPC: hüdrogeenitud soja PC

LYSOPC MYRISTIC: 1-müristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

LYSOPC PALMITIC: 1-palmitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

LYSOPC STEARIC: 1-stearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

Piima sfingomüeliini MPPC: 1-müristoüül-2-palmitoüül-sn-glütsero-3-25

fosfatidüülkoliin

MSPC: 1-müristoüül,2-stearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

PMPC: 1-palmitoüül,2-müristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

POPC: 1-palmitoüül,2-oleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

POPE: 1-palmitoüül-2-oleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin30

POPG: 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rats-(1-glütserool…)

PSPC: 1-palmitoüül,2-stearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

SMPC: 1-stearoüül,2-müristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

59 EE – EP2590676 B1

SOPC: 1-stearoüül,2-oleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

SPPC: 1-stearoüül,2-palmitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

KIRJANDUSALLIKAD

(1) Johanning et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:1495-1501

(2) Heyes et al. (2005) J. Controlled Release 107:276-875

(3) WO 2005/121348

(4) Liposomes: Methods and Protocols, köide 1: Pharmaceutical Nanocarriers:

Methods and Protocols (toimetaja: Weissig). Humana Press, 2009. ISBN

160327359X

(5) Liposome Technology, köited I, II ja III. (toimetaja: Gregoriadis). Informa10

Healthcare, 2006

(6) Functional Polymer Colloids and Microparticles, köide 4 (Microspheres,

microcapsules & liposomes). (toimetajad: Arshady ja Guyot). Citus Books, 2002

(7) Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362-372

(8) Polymers in Drug Delivery (toimetajad: Uchegbu ja Schatzlein); CRC Press,15

2006

(9) Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines. (toimetajad:

Cohen ja Bernstein). CRC Press, 1996

(10) O’Hagan et al. (2001) J. Virology 75:9037-9043

(11) Singh et al. (2003) Pharmaceutical Research 20: 247-25120

(12) WO 2009/132206

(13) Martinon et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 1719-22

(14) WO 2005/113782

(15) WO 2011/005799

60 EE – EP2590676 B1

(16) El Ouahabi et al. (1996) FEBS Letts. 380:108-12

(17) Giuliani et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(29):10834-9

(18) WO 2009/016515

(19) WO 02/34771

(20) WO 2005/0325825

(22) WO 2006/110413

(23) WO 2005/111066

(24) WO 2005/002619

(25) WO 2006/138004

(26) WO 2009/10986010

(27) WO 02/02606

(28) WO 03/018054

(29) WO 2006/091517

(30) WO 2008/020330

(31) WO 2006/08926415

(32) WO 2009/104092

(33) WO 12/031043

(34) WO 2007/049155

(35) Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20. trükk,

ISBN: 068330647220

(36) Methods In Enzymology (toimetajad: S. Colowick ja N. Kaplan, Academic

Press, Inc.)

61 EE – EP2590676 B1

(37) Handbook of Experimental Immunology, köited I-IV (D.M. Weir ja C.C.

Blackwell, toimetajad, 1986, Blackwell Scientific Publications)

(38) Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. trükk (Cold

Spring Harbor Laboratory Press)

(39) Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (toimetaja: Birdi, K.S., CRC5

Press, 1997)

(40) Ausubel et al. (toimetajad) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th

edition (Current Protocols)

(41) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (toimetajad:

Ream et al., 1998, Academic Press)10

(42) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2. trükk (toimetajad: Newton ja

Graham, 1997, Springer Verlag)

(43) Yoneyama ja Fujita (2007), Cytokine & Growth Factor Reviews 18:545-51

(44) Maurer et al. (2001) Biophysical Journal, 80: 2310-2326

(45) Perri et al. (2003) J. Virol. 77:10394-1040315

(46) Iavarone et al. (2011) J. Immunol. 186;4213-22

(47) Boxus et al. (2007) J. Virol. 81:6879-89

(48) Taylor et al. (2005) Vaccine 23: 1242-50

62 EE – EP2590676 B1

Patendinõudlus

1. Virioonist erinev osake, mis ei sisalda proteiini kapsiidi, RNA in vivo sisestamiseks

selgroogse rakku, milles:

(a) osakeseks on liposoom ja see sisaldab sisestusmaterjali, mis kapseldab

immunogeeni kodeeriva isereplitseeruva RNA molekuli, milles immunogeeniks on5

pinna polüpeptiid ning see suudab tekitada in vivo immuunvastuse bakteri, viiruse,

seenorganismi või parasiidi vastu; ja (b) RNA sisaldab mittemodifitseeritud

nukleotiide ning sisaldab valikuliselt 5’ otsmist katet.

2. Osake vastavalt nõudluspunktile 1, milles liposoom sisaldab katioonse

pearühmaga lipiidi.10

3. Osake vastavalt nõudluspunktile 1, milles liposoom sisaldab tsvitterioonse

pearühmaga lipiidi.

4. Osake vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-3, milles liposoomi läbimõõt

on 50-220 nm.

5. Osake vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles15

isereplitseeruv RNA molekul kodeerib: (i) RNA-sõltuvat RNA polümeraasi, mis võib

transkribeerida RNA isereplitseeruvast RNA molekulist; ja (ii) immunogeeni.

6. Osake vastavalt nõudluspunktile 5, milles polümeraasiks on alfaviiruse replikaas.

7. Osake vastavalt nõudluspunktile 5 või 6, milles RNA molekulil on kaks avatud

lugemisraami, millest esimene kodeerib alfaviiruse replikaasi ja teine kodeerib20

immunogeeni.

8. Osake vastavalt nõudluspunktile 7, milles RNA molekulil on täiendavad avatud

lugemisraamid, mis kodeerivad näiteks täiendavaid immunogeene või

lisapolüpeptiide.

9. Osake vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles RNA molekuli25

pikkuseks on 5000-25 000 nukleotiidi.

63 EE – EP2590676 B1

10. Osake vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles

immunogeen saab tekitada in vivo immuunvastuse alljärgneva vastu:

(a) respiratoorse süntsüdiaalse viiruse glükoproteiin F; (b) kalasid nakkav viirus

nagu nakkav lõhede aneemia viirus (ISAV), lõhe pankrease haiguse viirus (SPDV),

nakkav pankrease nekroosi viirus (IPNV), kanalisäga viirus (CCV), kalade5

lümfotsüsti haiguse viirus (FLDV), nakkav hematopoeetilise nekroosi viirus (IHNV),

karpkala herpesviirus, lõhe pikornaviirus (teada ka kui Atlandi lõhe pikornaviirus),

sisemaalõhe viirus (LSV), Atlandi lõhe rotaviirus (ASR), forelli „maasikahaiguse“

viirus (TSD), Coho lõhe tuumori viirus (CSTV) ja viiruslik verejooksuga septitseemia

viirus (VHSV); (c) ortomüksoviirus nagu A, B ja C gripiviirused; või (d) herpesviirus10

nagu herpes simplex viirused (HSV), Varicella-Zosteri viirus (VZV), Epstein-Barri

viirus (EBV), tsütomegaloviirus (CMV), inimese herpesviirus 6 (HHV6), inimese

hepresviirus 7 (HHV7) ja inimese herpesviirus 8 (HHV8).

11. Ravimkoostis, mis sisaldab ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile vastavat

osakest.15

12. Manustamisvahend, mis sisaldab nõudluspunktile 11 vastavat ravimkoostist.

13. Osake vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1-10 või ravimkoostis

vastavalt nõudluspunktile 11 või manustamisvahend vastavalt nõudluspunktile 12

kasutamiseks selgroogses kaitsva immuunvastuse tekitamise meetodis, mis

hõlmab etappi, mille käigus manustatakse nimetatud selgroogsele nimetatud20

osakese või nimetatud ravimkoostise efektiivne kogus.

EP 2 590 676 B1

36

1/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 1

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 2

leewi

Rectangle

EP 2 590 676 B1

37

2/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 3

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 4

leewi

Rectangle

EP 2 590 676 B1

38

3/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 5

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 6

leewi

Rectangle

EP 2 590 676 B1

39

4/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 7

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 8

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

paljas

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

paljas

EP 2 590 676 B1

40

5/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 9

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 10

leewi

Rectangle

EP 2 590 676 B1

41

6/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 11

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 12

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

paljas

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

paljas

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

liposoom

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

liposoom

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

naiivne

EP 2 590 676 B1

42

7/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 13

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 14

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 14A

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

naiivne

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

paljas

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

kolmnurk

EP 2 590 676 B1

43

8/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 14B

leewi

Typewritten text

FIG 14B

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

EP 2 590 676 B1

44

9/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 15

leewi

Rectangle

EP 2 590 676 B1

45

10/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 16

leewi

Typewritten text

FIG 16

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

EP 2 590 676 B1

46

11/11EE - EP2590676 B1

leewi

Rectangle

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 17

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 17A

leewi

Rectangle

leewi

Typewritten text

FIG 17B

leewi

Rectangle

(51) Int. Cl. P E E- (12)EESTIS KEHTIVA EUROOPA PATENDI ... · 20...

Documents

Transcript of (51) Int. Cl. P E E- (12)EESTIS KEHTIVA EUROOPA PATENDI ... · 20...