La coagulazione ed i test di

valutazione della funzione

coagulativa

Trombosi

Normale

Ipocoagulabilità

Emorragie

Ipercoagulabilità

Fattori coinvolti nell’emostasi

Vasi

Piastrine

Fibrinolisi / inibitori

Proteine della coagulazione

• Vasi (cellule endoteliali e subendotelio) → vasocostrizione dei vasi danneggiati

• Piastrine → formazione del tappo piastrinico

• Complemento

• Fattori della coagulazione → formazione del tappo di fibrina

• Fattori della fibrinolisi → risoluzione del coagulo• sistema macrofagico-monocitario, PMN → rimozione

dei residui del coagulo

• Inibitori della coagulazione

Fattori coinvolti nell’emostasi

Emostasi primaria

Emostasi secondaria

• 3 Fasi

• fase vascolare

• fase piastrinica

• fase plasmatica

• Si attivano pressoché contemporaneamente

• Sono seguite dalla fase di lisi del coagulo → fibrinolisi

La cascata coagulativa

La cascata coagulativa è costituita da un serie di reazioni enzimatiche. Per essere efficiente è necessario

che enzima e substrato vengano a contatto ad una concentrazione ottimale.

enzima (il fattore attivato) → agisce su un substrato (il fattore successivo nella forma non attiva) in presenza di un cofattore che accelera la reazione;

Queste tre componenti fondamentali sono assemblate sul complesso fosfolipidico (FP3) espresso sulla superficie delle piastrine e tenute

assieme dagli ioni calcio

1515

Factor MW Plasma Concentration Required for Hemostasis (µg/ml) (% of normal concentration)

Fibrinogen 330,000 3000 30

Prothrombin 72,000 100 40

Factor V 300,000 10 10-15

Factor VII 50,000 0.5 5-10

Factor VIII 300,000 0.1 10-40

Factor IX 56,000 5 10-40

Factor X 56,000 10 10-15

Factor XI 160,000 5 20-30

Factor XIII 320,000 30 1-5

Factor XII 76,000 30 0

Prekallikrein 82,000 40 0

HMWK 108,000 100 0

Fattori plasmatici della coagulazione:

I fattori vit K dipendenti

• II, VII, IX, X

Sintetizzati nel fegato

Υ-carbossiglutamato indispensabile per legare il Ca++ e ancorarsi ai fosfolipidi piastrinici carichi negativamente

Vit K necessaria per l’attività della carbossilasi epatica

TrombomodulinaGlicoproteina esposta sulla superficie delle

cellule endoteliali

Lega la trombina alla proteina C

Proteina CSerina proteasi contenente Gla

Degrada i fattori Va e VIIIa

Stabilizzata dalla proteina S

Proteina SCofattore che stabilizza la proteina C

attivata

Inibitore del fattore tissutale Inibisce l’attivazione dei fattori IX e X da

parte del fattore VIIa

Anticoagulanti endogeni

• Antitrombina III

• proteina prodotta dal fegato

• inibisce l’attività di IXa, Xa, XIa, XIIa e della trombina

• attivata dall’eparina

• Eparina

• Polisaccaride solforilato prodotto dai mastociti

• attiva l’antitrombina III mediante modifiche conformazionali

• Usato in terapia ➔ inibitore della coagulazione rapido e potente

Sostanze ad azione anticoagulante

Al di fuori del circolo il sangue può essere mantenuto liquido rimuovendo tutto il fibrinogeno oppure aggiungendo sostanze anticoagulanti

Si distinguono due gruppi di sostanze ad azione anticoagulante:1) sostanze chelanti il calcio ➔ sottraggono il calcio alla cascata coagulativa: -

citrato ossalato EDTA (acido etilendiaminico tetracetico)

2) inibitori della trombina:

eparina: esalta l’attività antitrombinica dell’antitrombina III (AT III)

Fase fibrinoliticaFase fibrinoliticaIl sistema fibrinoliticosistema fibrinolitico è fisiologicamente

preposto alla dissoluzione dei trombi e dei coaguli di fibrina

Tale compito è svolto dalla plasminaplasmina, un potente enzima (proteasi) che viene generata da un precursore ematico

inattivo, il plasminogeno, plasminogeno, attivato dal t-t-PAPA (attivatore tessutale del

plasminogeno), prodotto dalle cellule endoteliali

Test di laboratorioTest di laboratorio

•Attualmente è molto più facile caratterizzare laboratoristicamente i difetti che causano emorragia piuttosto che quelle situazioni, potenzialmente curabili, che predispongono alla trombosi

La raccolta della storia clinica va eseguita seguendo lo schema orientativo riportato nella tabella

2828

Alterazione dell’emostasi primaria: porpora

2929

Alterazione dell’emostasi primaria: ecchimosi

3030

Alterazione dell’emostasi secondaria: emorragie

3131

Alterazione dell’emostasi secondaria: emorragie

3232

Alterazione dell’emostasi secondaria acquisite

3333

Alterazione dell’emostasi secondaria acquisite

Test di uso comune per valutare la coagulazione

• Valutazione fase piastrinica

• Emocromo conta piastrinica

• tempo di stillicidio

• Tempo necessario per la formazione del tappo piastrinico in seguito a puntura standardizzata

• aggregazione piastrinica

• Ristocetina Antibiotico che induce l’aggregazione piastrinica in presenza di vWf

Valutazione fase fibrinicaValutazione fase fibrinica PT aPTT dosaggio fibrinogeno dosaggio At-III dosggio D-dimero dosaggio fattori:– Ratio attività:antigene Ratio attività:antigene

3838

Test di screening dell’emostasi

Test di primo filtro: tempo di emorragia e conta piastrinica (esplorano la fase vasopiastrinica), il tempo di protrombina, il tempo di tromboplastina parziale attivato (esplorano la fase della coagulazione)

Test di secondo filtro: dosaggio del fattore XIII, dell’α 2 antiplasmina, del tPA e del PAI, del fattore piastrinico 3, del tempo di trombina, il tempo di Reptilase e del wWF

3939

Incisione 1 mm x 5 mm

Pressione costante

Range 2 - 10 minuti

40 mm

Bleeding Time

4040

Test di primo filtro: fase vasopiastrinica

1.Tempo di emorragia: E’ il tempo necessario all’arresto del sanguinamento da un piccolo taglio, di dimensioni standardizzate, provocato sulla superficie cutanea (varia da 1 a 9 minuti)

Cosa valuta? L ’interazione delle piastrine con la parete vascolare, e la successiva formazione del tappo emostatico primario

Quando è prolungato? In tutti i casi di piastrinopenia e piastrinopatie, in caso di carenza di alcuni fattori plasmatici (quali il fibrinogeno e il vWF), essenziali per la normale funzione piastrinica ed in soggetti con alterazione della parete vascolare (sindrome di Ehelers-Danlos, telengectasia emorragica

Come si esegue? Esistono diversi metodi. Tutti sono modifiche di due tecniche: quella di Duke, che prevede l ’incisione del lobo di un orecchio, e quella di Ivy, in cui si esegue un’incisione della cute dell’avambraccio, mantenendo costante la pressione ematica (40 mm Hg) mediante un manicotto

4141

Condizioni che possono alterare il tempo di sanguinamento

•Il tipo, la lunghezza la profondità dell’incisione

•L ’assunzione di farmaci tra cui l’acido acetilsalicilico (è stata descritta una sindrome di disfunzione piastrinica caratterizzata da un tempo esageratamente allungato dopo assunzione di acido acetilsalicilico ed un tempo di emorragia basale normale) ed altri antinfiammatori

4242

Test di primo filtro: fase vasopiastrinica

2.Conta delle piastrine. Il conteggio delle piastrine

Non è strettamente indispensabile per una prima valutazione dell’emostasi purchè venga eseguito il tempo di emorragia.

Generalmente esiste una correlazione inversa fra il numero di piastrine al di sotto di 100.000/υl e il tempo di emorragia

Il conteggio delle piastrine diventa obbligatorio quando il tempo di emorragia è prolungato per stabilire se si tratta di piastrinopenia o di piastrinopatia.

E ’ importante ricordare che si possono avere piastrinopenie spurie (o pseudopiastrinopenie) causate dall’EDTA, l ’anticoagulante in cui vengono generalmente raccolti i campioni di sangue per la conta piastrinica. Ciò probabilmente è dovuto ad immunoglobuline che agglutinano le piastrine quando il Ca è chelato.

4343

indagini di laboratorio per la indagini di laboratorio per la valutazione della funzionalità valutazione della funzionalità piastrinica e relativi valori di piastrinica e relativi valori di

riferimentoriferimento- tempo di sanguinamento: - tempo di sanguinamento: ≤≤ 10 10 minuti (nei soggetti normali tra 3-6 minuti (nei soggetti normali tra 3-6 minuti)minuti)- conteggio delle piastrine: 150.000 - conteggio delle piastrine: 150.000 – 400.000 per – 400.000 per μμL L - test di adesività piastrinica: > 70%- test di adesività piastrinica: > 70%- test di aggregazione piastrinica: - test di aggregazione piastrinica: confronto dei tracciati di confronto dei tracciati di trasmittanza con quelli ottenuti su trasmittanza con quelli ottenuti su piastrine normalipiastrine normali

4444

tempo di sanguinamentotempo di sanguinamentoIl tempo di sanguinamento (o di emorragia) tempo di sanguinamento (o di emorragia) viene determinato effettuando una piccola incisione superficiale sulla rete capillare della faccia volare dell’avambraccio, in una zona pulita, esente da malattie della pelle e lontano dalle vene superficiali, mantenendo una pressione venosa costante di 40 mmHg 40 mmHg con uno sfigmomanometro e cronometrandocronometrando la durata durata della fuoriuscita del sangue dalla ferita

Il test viene eseguito in maniera accuratamente standardizzata provocando una incisione incisione di profondità profondità e lunghezza costante lunghezza costante con una lama calibrata o con un bisturi automatico: i pazienti con un tempo di tempo di sanguinamento superiore ai 10 minutisanguinamento superiore ai 10 minuti presentano un rischiorischio emorragico aumentatoaumentato

4545

150.000 - 400.000 / 150.000 - 400.000 / μμLL: valori normali

> 100.000 / > 100.000 / μμLL: i pazienti sono asintomatici e il tempo di sanguinamento rimane nella norma50.000 - 100.000 / 50.000 - 100.000 / μμLL: il tempo di sanguinamento è lievemente allungato, ma senza alcuna sintomatologia emorragica < 50.000 / < 50.000 / μμLL: si osservano porpore cutanee dopo traumi minimi e sanguinamenti a livello mucoso in seguito a piccoli interventi chirurgici < 20.000 / < 20.000 / μμLL: notevole rischio di sanguinamenti spontanei intracranici e in altri sede interne

conteggio delle piastrineconteggio delle piastrine

4646

Le piastrine

valori nel sangue: 150 - 450 x 10 /L.

circa 2/3 circolano, mentre 1/3 risiede nella milza o sedi extravascolari;

4747

Megacariocita

• ciascun megacariocita durante la sua vita genera circa 4,000 piastrine• le piastrine vivono mediamente da 9-12 giorni• ogni giorno sono prodotte 30.000-40.000 piastrine per mmc;• in caso di necessita’, la produzione di piastrine puo’ aumentare 8 volte;

4848

test di adesività piatrinicatest di adesività piatrinicaIl test di adesività piastrinica misura la capacità delle piastrine di aderireaderire ad una superficie estranea

Viene effettuato facendo passare, in condizioni controllate, il sangue attraverso un tubicino di plastica contenente microsfere di vetromicrosfere di vetro e determinando il numeronumero di piastrine trattenutedi piastrine trattenute rispetto a quelle presenti nel sangue dello stesso paziente non trattato

Il risultato viene espresso in percentuale di piastrine trattenute; percentuale di piastrine trattenute; i valori normali sono tra 70 e 98%70 e 98%

4949

Platelet Aggregation

Platelet Rich Plasma (PRP)

Aggregating Reagent

AggregateClumping

Baseline Light Transmission

Increased LightTransmission

+

5050

Pattern bifasico

100908070605040302010

0

Platelet RichPlasma

Platelet Poor Plasma

Secondary Response(Release)

Primary Response

Injection Point

Lag

5151

Test di primo filtro: Fase coagulativa

•Tutti i test di coagulazione dipendono in modo fondamentale dalla quantità di campione di plasma ottenuto•Si richiede una puntura venosa•Il citrato è l’anticoagulante utilizzato routinariamente•Il plasma citrato essenzialmente privo di piastrine viene preparato per centrifugazione standard

5252

PT e aPTT

PT tromboplastina (PL + TF), Ca++.Normale: 10-16 sec

aPTT fosfolipidi, Ca++ ,silice.Normale: 31-55 sec

5353

Tempo di protrombina (PT)

• Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori VII, X, V, protrombina (II)

• e fibrinogeno (I). • Monitoraggio della terapia

anticoagulante orale con dicumarolici (INR)

• inibiscono l’attivita’ dei fattori VII, IX, X e della protrombina

• PT corto privo di significato patologico

• PT lungo • epatopatia. • deficit vitamina K • CID • sindrome nefrosica• Farmaci dicumarolici

5454

tempo di protrombina (PT) tempo di protrombina (PT) o tempo di Quick o tempo di Quick

Questo test valuta l’efficacia della via estrinseca e estrinseca e comunecomune della coagulazione (fattori I, II, V, VII e X)

Si esegue aggiungendo al plasma-citrato del paziente tromboplastina tessutaletromboplastina tessutale e ioni calcioioni calcio, e cronometrandocronometrando il tempo necessario alla formazione del coagulo

I valori sono normalmente espressi in secondi (v.n. (v.n. tra 11 e 13 secondi)tra 11 e 13 secondi) o come rapporto (ratio)(ratio) tra il tempo del plasma in esame e quello di un campione di plasma normale di controllo

5555

PatientPatient’’s PT in Secondss PT in SecondsMean Normal PT in SecondsMean Normal PT in SecondsINR =INR =

ISIISI

INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index

INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index

INR = PT Standardisation

5656

MeanMeanNormalNormal(Seconds)(Seconds)

INRINR

1212

1212

1313

1111

14.514.5

1.31.3

1.51.5

1.61.6

2.22.2

2.62.6

3.23.2

2.42.4

2.02.0

1.21.2

1.01.0

2.62.6

2.62.6

2.62.6

2.62.6

2.62.6

AA

BB

CC

DD

EE

PatientPatient’’ssPTPT

(Seconds)(Seconds)

1616

1818

2121

2424

3838

ThromboplastinThromboplastinreagentreagent

How Different Thromboplastins Influence the PT Ratio and INR

5757

Tempo di tromboplastina parziale attivato

(aPTT)• Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori IX, VIII, e XI

• Monitoraggio della terapia con eparina

• Test di screening per LAC• Identifica con minor

sensibilita’ del PT deficit dei fattori X, V, protrombina (II)

• e fibrinogeno (I) • aPTT corto privo di

significato patologico• aPTT lungo • deficit di fattori • presenza di inibitori (anti-

fattore VIII, LAC)• terapia con eparina

5858

aPTT si allunga per livelli di fattore

• VIII < 50%

• XI < 50%

• IX < 30%

• XII < 30%

• Fibrinogeno < 100 mg/dL

• Livelli di eparina 0.15-0.2 U/mL

5959

aPTT si allunga per livelli di fattore

Cause di errore

Policitemia

Prelievo difficile

Provetta non riempita correttamente

Contaminazione eparina

Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore

6060

Terapia con eparina: esalta l’attività anticoagulante dell’AT III, inibisce II, X e delle proteasi in genere

Malattie epatiche: quadro complesso spesso si osserva un aumento del fattore VIII (è sintetizzato dal sistema reticoloendoteliale epatico) e del vWF

6161

tempo di tromboplastina tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT)parziale attivata (aPTT)

Questo test valuta l’efficacia della via intrinseca e comuneintrinseca e comune della coagulazione (fattori I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII)

Si esegue aggiungendo al plasma-citrato del paziente agenti attivantiagenti attivanti (caolino), una emulsione di fosfolipidifosfolipidi (sostituti piastrinici) e ioni calcioioni calcio, e cronometrandocronometrando il tempo necessario alla formazione del coagulo

I valori sono normalmente espressi in secondi (v.n. tra tra 28 e 40 secondi28 e 40 secondi) o come rapporto (ratio)(ratio) tra il tempo del plasma in esame e quello di un campione di plasma normale di controllo