34.1 DNA 复制是半保留式的 34.2 DNA 复制是双向进行的 34.3 DNA 聚合酶 III...
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34.1 DNA 复制是半保留式的34.2 DNA 复制是双向进行的 34.3 DNA 聚合酶 III 催化复制叉处的聚合反应34.4 DNA 聚合酶 III 同时催化两条链的合成34.5 复制叉移动需要多蛋白复合物34.6 DNA 复制起始于细菌染色体上的唯一的一个部位34.7 DNA 复制终止于 ter 区34.8 DNA 复制的其它方式34.9 损伤的 DNA 可以修复
第 34 章、 DNA 复制
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遗传中心法则
DNA复制
RNA复制
转录
逆转录
翻译
蛋白质
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Meselson- Stahl 实验:
1 、使 E.coli 在含有唯一氮源 1515NN (( 1515NHNH44ClCl ))的培
养基中培养,合成的所有核苷酸都含有 15N ,具有较高的密度,都整合到亲代 DNA 中。
2 、将生长在 15NH4Cl 培养基的 E.coli 转移到含有唯
一氮源,但密度较低的 1414NN (( 1414NHNH44ClCl ))培养基中培
养。培养两代,并分别取每一代的 DNA 进行密度梯度离心。
34.1 DNA 复制方式是半保留式
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首先在 1515NHNH44ClCl 培养基中培养
然后转到 1414NHNH44ClCl 培养基中培养
只在 1515NNHH44Cl Cl 中培养
只在 1414
NHNH44Cl Cl
中培养
1414NN 对照系统对照系统 1515NN 对照系统对照系统第一代 第二代
提取 DNA ,进行密度梯度超离心
E.coli 细胞
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用 1515NN 标记的亲本 DNA
1414NN 中第一次复制
1414NN 中第二次复制
实验结果表明 DNA
复制是半保留复制
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( a )密度梯度离心的 DNA 带 ( b )对应于左侧 DNA 带的解释
Meselson-stahl 实验
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从前面图可以看出,在含有 14N 氮源介质中培养一代的 DNA 经密度梯度离心后, DNA 带位于在 1515NN
培养基中的培养基中的 DNADNA 带的上面。带的上面。
在含有 14N 氮源介质中培养两代后的 DNA 经密度梯度离心后,出现两条带,第一条带位置与培养一带的 DNA 带相同,另一条 DNA 带位于第一条带上面,说明第二条带密度更轻。
实验结果充分说明 DNA 复制是半保留复制。
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两种复制模式
( a )单向复制模式 ( b )双向复制模式
34.2 DNA 复制是双向进行的
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大肠杆菌染色体 D
NA 双向复制模式
复制起点
复制叉 复制叉
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真核生物 DNA 复制有多个复制起点,同时双向复制
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34.3 DNA 聚合酶 III 催化复制叉处的聚合反应
DNA 合成时,核苷酸是通过酶催化加到一个正在延伸的DNA 链上,这种酶要求一条完整的 DNA 链作为模板,去合成一条互补链,所以这样的酶叫做 DNA 指导的 DNADNA 聚合酶聚合酶。
Arthur Kornberg (斯坦福大学医学院教授)等人从 195
5 年开始寻找合成 DNA 的酶。于 1956 年在大肠杆菌的提取液中发现了 DNA 聚合酶。
Kornberg 发现的 DNA 聚合酶就是现在的 DNA 聚合酶 I ,是分子量为 109,000 的一条多肽链,具有聚合活性及 3ˊ-5ˊ 外切酶活性,还有 5ˊ-3ˊ 核酸酶活性。以后又陆续发现了功能不同的另外几种 DNA 聚合酶,下表归纳了到目前为止从大肠杆菌和哺乳动物中发现的 DNA 聚合酶的基本特征。
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表 17.1大肠杆菌和哺乳动物 DNA聚合酶特征
DNA聚合酶 主要功能 分子量 3ˊ -5ˊ 外切酶活性 其它功能
E.coli 酶
聚合酶 I 切去滞后链上的 RNA
引物,并填充核苷酸
109,000 有 还有 5ˊ -3ˊ
外切酶活性
聚合酶 II DNA修复 90,000 有
聚合酶 III DNA合成中链的延伸 900,000 有
哺乳动物酶(I) 滞后链的合成 300,000 没有(III) 前导链的合成 200,000 有(II) DNA修复 250,000 有
DNA修复 40,000 没有 线粒体 DNA复制 250,000 有
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聚合反应的基本过程都是通过新合成的链的 3ˊ-OH 对进入的新的核苷三磷酸(用 d NT
P )的磷进行亲核攻击磷进行亲核攻击,导致磷酯键断裂,结果在链的 3ˊ 末端加上了一个新的核苷酸,即延长了一个核苷酸。
释放出的焦磷酸经焦磷酸酶水解有利于聚合反应的进行
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DNA 聚合酶的 校正反应
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34.4 DNA 聚合酶 III 同时催化两条链的合成
由于 DNA 的两条模板链是反平行的,又因为 DNA总是沿 5ˊ→ 3ˊ 方向合成,即两条新链是沿着相反方向合成。换句话说,就是一条子链的合成方向与复制叉移动的方向一致,该子链称为前导链;子链称为前导链;而另一条子链与复制叉移动的方向相反,这条链这条链称之为滞后链,但也是通过通过滞后链,但也是通过通过 5ˊ→ 3ˊ5ˊ→ 3ˊ 方向聚合形成方向聚合形成的。的。
9.4.1 9.4.1 在滞后链中在滞后链中 DNADNA 的合成是不连续的的合成是不连续的
根据岗崎实验,可以确定复制叉的一个“杈”(前导根据岗崎实验,可以确定复制叉的一个“杈”(前导链)是沿链)是沿 55ˊ-ˊ-33ˊ́ 方向连续合成的,而另一条链(滞后链)是方向连续合成的,而另一条链(滞后链)是通过岗崎片段方式不连续合成的。连续和不连续合成的结合通过岗崎片段方式不连续合成的。连续和不连续合成的结合使得复制叉整体向一个方向延伸使得复制叉整体向一个方向延伸。
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岗崎岗崎片段片段
复制叉移动方向
先导链
滞后链
DNA 聚合酶 III 同时催化两条链的合成
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前导链和滞后链的合成
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34.4.2 每个岗崎片段的合成开始于一个 RNA引物
不连续合成解释了滞后链是怎样合成的,但不能解释每个岗崎片段是怎样开始合成的。 DNA 聚合酶 III 不能从头开始进行聚合反应,它只能将核苷酸加到已有的多核苷酸链上。所以为了合成滞后链,需要在复制叉处合成一系列的短的 RNA引物。每个 RNA引物都是与滞后链模板部分互补的,而且在 DNA 聚合酶 III 催化下从引物 3ˊ 端延伸形成岗崎片段。
RNA引物是通过引发酶引发酶合成的,引发酶引发酶是一个称为引发体的大的复合物中的成分,引发体还包括使 DNA 解旋的解旋酶和解旋酶和其它的一些辅助蛋白其它的一些辅助蛋白。引发酶每秒钟催化一个大约长 10 个核苷酸的 RNA引物的合成。由于复制叉移动的速度大约为每秒 100
0 个核苷酸,所以大约每 1000 个核苷酸就要合成一个 RNA引物。
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34.4.3 DNA pol I 切去 RNA引物,并使岗崎片段延伸 DNA pol I 识别并结合于新 DNA 链的 3ˊ 端和下一个 RN
A引物之间的切口。然后 5ˊ→ 3ˊ 外切酶活性催化第 1 个 RNA
核苷酸水解,而 5ˊ→ 3ˊ5ˊ→ 3ˊ 聚合酶活性将一个脱氧核苷酸加到新聚合酶活性将一个脱氧核苷酸加到新DNADNA 链的链的 3ˊ3ˊ 端,端,这种同时降解和合成的过程称为切口平移切口平移。
通过这种方式,使得切口沿滞后链移动。在完成切去 RN
A引物和填充 RNA引物切去后的空缺后, DNA pol I 脱离 D
NA ,留下了被一个切口(一个磷酸二酯键的空)分开的双链DNA 。
最后在 DNA连接酶催化下,一个岗崎片段的 3ˊ 末端和另一个岗崎片段的 5ˊ 磷酸基团之间形成一个磷酸二酯键,完成了两个岗崎片段的合成。
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引发体
引物酶
DNA 聚合酶 III
DNA 聚合酶I
DNA连接酶
滞后链前导链
单链结合蛋白
解旋酶
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34.5 复制叉移动需要多蛋白复合体复制叉的移动除了需要用于聚合反应的 DNA pol III 以外,至少还需要四种其它蛋白质。其中主要的蛋白是解旋酶、拓扑异构酶、单链结合蛋白和 DNA引发酶(也称为引物合成酶)。
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解旋酶:解旋酶:是个需要 ATP 的酶,该酶刚好在移动的复制叉的前面沿着单链 DNA滑动。 E.coli 中最重要的解旋酶是 DnaB ,它是一个与引发体中的引发酶紧密聚合的蛋白质。 DnaB 使复制叉前面的双螺旋 DNA 解旋,解旋过程是与核苷三磷酸水解过程相偶联的。
拓扑异构酶拓扑异构酶 II 和和 IIII ::是用来将解旋酶作用后产生的扭转张力释放掉。 DNA快速解旋在复制叉处形成超螺旋头部。拓扑异构酶 I 是切断 DNA 中的一条链,使 D
NA旋转,而拓扑异构酶 II 可以切断 DNA 的两条链。
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单链结合蛋白(单链结合蛋白( SSBSSB ):其):其作用是当解旋酶作用后,它可以防止解开的螺旋恢复原来状态。它对单链 DN
A 有非常高的亲和性,在滞后链合成的开始需要单链结合蛋白,螺旋解旋后,前导链可以连续合成时就不需要这种蛋白了。
DNADNA 引发酶:引发酶:这个酶沿着滞后链在有规则的间隔内合成短的 RNA引物。然后通过 DNA pol III 在引物的 3ˊ-OH 端沿着 5ˊ-3ˊ 方向合成岗崎片段。 RNA引物可以被 DNA pol I除去,然后用互补的脱氧核苷酸填上。在复制起点处前导链合成开始时也需要引发酶。
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E.coli 中,是位于称为 orioriCC 遗传位点的单一一个起点遗传位点的单一一个起点。 o
riC 区含有两种重复类型的多个拷贝, DnaA 结合部位含有一个特殊的 9碱基对重复序列( 4 个拷贝),另一部位是富含另一部位是富含A-TA-T碱基对的重复区(碱基对的重复区( 33 个拷贝)(图个拷贝)(图 aa )。)。 图 b给出了在 oriC 处复制起始模式。大约有大约有 2020 个 个 DnaADnaA
蛋白与蛋白与 99碱基对重复区结合,并引起碱基对重复区结合,并引起 DNADNA 结构的变化,导致结构的变化,导致富含富含 1313 个个 A-TA-T碱基对重复区内双螺旋变性。碱基对重复区内双螺旋变性。 富含 A-T重复区的部位起着使复制泡中心定位的作用。一旦这个区接近其它 DNA 复制蛋白,在解旋酶和 SSB 作用下复制泡沿双向延伸形成两个复制叉复制泡沿双向延伸形成两个复制叉。然后引发酶合成 RNA引物,而 DNA pol III 开始前导链和滞后链的合成。
34.6 细菌中的 DNA 复制起始于染色体上唯一的一个部位
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E.coli 的 oriC 结构模式: a. OriC内富含 A-T序列和 4 个 9碱基对重复序列的分布; b. 在 oriC 处复制起始模式
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34.7 DNA 复制终止于 ter 区
在 ter 区内存在 5 个 DNA序列( terA 到 terE )。 ter序列排列在染色体上制造了一个复制叉“ 陷井”区,复制叉可以进入但不能出来。顺时针陷井由 terB 和 terC构成,反时针陷井由 terA 、terD 和 terE构成。
陷井区是终止子利用物质( Tus )的结合部位。 Tus 可以和每一个 ter 结合。一旦形成 Tus-Tus-terter 复合物,就可以通过阻止解旋就可以通过阻止解旋酶解旋酶解旋 DNADNA 来封闭复制叉的通路来封闭复制叉的通路。 Tus-ter 复合物只捕获来自一个方向(顺时针或反时针)的复制叉,而对来自另一个方向(反时针或顺时针)的复制叉不起作用。
终止区这样安排可确保两个从相反方向进入终止区这样安排可确保两个从相反方向进入 terter 区的复制叉总区的复制叉总能相遇能相遇,当一个复制叉遇到另一个复制叉时, DNA 复制就完成了。
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E.Coli 中的 ter 区组织600kb ter 区含有 5 个非对称的 ter 部位,每个都可与 Tus 结合。
箭头表示为每个复制体设置的可能的终止部位
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真核生物染色体一般都比细菌染色体大得多,如 E,coli 基因组是由 4.6×103kb组成的单一染色体,而真核生物通常含有一个以上的染色体,一般在 20至 30 对染色体之间。虽然染色体数目的增加使得基因组更复杂,但所有生物中的但所有生物中的 DNADNA 复制复制的生物化学机制基本上是类似的的生物化学机制基本上是类似的。
真核生物 DNA 复制还有以下一些特点 :
真核生物所含的 DNA 聚合酶种类更多些。 真核生物复制叉处需要的辅助蛋白不同。 真核生物也象 E.coli那样,复制是双向的。但 E.coli 染色体含有唯一的复制起点,而真核生物染色体存在许多复制起点。
34.8 真核生物 DNA 复制类似于原核生物 DNA
复制
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滚环复制滚环复制
首先一个引发体组装在模板链(+链)上 ,开始合成 RNA引物,然后在 DNA pol III 作用下,引物延伸生成一个互补链(-链)。
生成的双链 DNA 分子通过一个噬菌体编码的内切酶在+链上的特定部位制造一个缺口。
最后在 DNA pol III 作用下,+链从暴露出的 3
ˊ羟基延伸,取代原来的+链。
34.9 DNA 复制的其它方式
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线粒体 DNA 的复制采取的是一种特殊的 D-D-环环复制方式:
环状双螺旋 DNA 在某一点解旋,开始复制。但前导链和滞后链的起点不在同一位点。
首先合成前导链,结果一条链(滞后链模板)仍维持单链。形成一个形成一个 DD字型的环字型的环。当前导链合成到某一点时,露出滞后露出滞后链的起点链的起点,滞后链开始复制。
D-环复制
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34.10 利用 RNA 作为模板,逆转录酶可以催化 DNA 合成
逆转录病毒的基因组是 RNARNA 分子分子,在感染期间,RNA 分子可以逆转录为逆转录为 DNADNA 分子分子。 DNA再转录生产病毒 RNA ,或者与宿主 DNA 分子整合,使病毒潜伏于宿主后代中。
将逆转录病毒 RNA 转换成 DNA 的最关键酶是逆转录酶逆转录酶。该酶具有 RNase H 活性(降解 RNA 活性)和 DNA 聚合酶活性。
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mRNA
RNA-DNA杂化体
单链 DNA
双链 DNA
mRNA 的 cDNA拷贝
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逆转录病毒生活循环中的 7 个主要过程
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① 逆转录病毒进入宿主细胞进入宿主细胞;② 在逆转录酶的催化下,以病毒的 RNA为模板合成互 互 补补 DNADNA (( cDNAcDNA )),形成 RNA-DNA 杂化体,逆转录酶 将杂化体中的 RNA降解,同时以剩下的 DNA链为模 板合成另一条互补的 DNA链,结果形成双链结果形成双链 DNADNA;③ 双链 DNA整合到宿主整合到宿主 DNADNA中;④ 利用宿主复制和转录机器生产大量的病毒病毒 RNARNA;⑤ 转录出的mRNA翻译成病毒的包膜蛋白,逆转录酶 和壳体蛋白;
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⑥ 将病毒 RNA、逆转录酶和壳体蛋白组装成病毒 的核壳体;⑦ 核壳体结合包膜蛋白形成完整的逆转录病毒完整的逆转录病毒。
逆转录酶没有 3ˊ-5ˊ 外切酶活性或校正活性,所以它的错误率比任何 DNA 聚合酶都高,例如人免疫缺陷病毒 I ( HIV I )逆转录酶每合成 2000
到 4000 核苷酸就会掺入一个不正确的碱基,这也部分说明了 HIV I 的高突变率。
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34.11 损伤的 DNA 可以修复1 、脱嘌呤、脱氨和形成胸腺嘧啶二聚体都可能造成 DNA 损伤 DNA 损伤常见形式是通过 N-糖苷键的水解,鸟嘌呤或腺嘌呤的自发脱嘌呤作用形成脱氧核糖。据估计人体内细胞中每天每 109碱基对就有多达 103碱基对发生脱嘌呤。另一种类型损伤是胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶,胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶,如果不能校正,在 DNA 复制后,一个 C-G碱基对就将变成一个 A-T碱基对了。
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胞嘧啶脱氨如不校正将导致:
G-C突变为 A-
T
C U
U A
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紫外线和离子辐射诱导有可能形成胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体。一个胸腺嘧啶的 C-5 、 C-6 与相邻胸腺嘧啶上同样位置的碳之间形成一个环丁基环,环丁基环,结果使得 DNA骨架的结构发生了改变,有可能引起与互补链上的相应的腺嘌呤残基之间的氢键断裂。
胸腺嘧啶形成的示意图
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2 在 E.coli 中存在 4 种基本的修复系统 E.coli 中存在的 4 种基本类型的 DNA 修复系统:直接修复,核苷酸切除修复、碱基切除修复和错配修复。A.A.直接修复直接修复 某些损伤的核苷酸和错配的碱基可以被某些蛋白质识别和修复。他们不切断 DNA或切除碱基而是直接实施修复,这样的损伤修复机制称为直接修复。 DNA 损伤之一的胸腺嘧啶二聚体可以通过直接修复机制修复。胸腺嘧啶二聚体是紫外线辐射造成的,光激活酶光激活酶可以结合胸腺嘧啶二聚体引起的扭曲了的双螺旋部位。在可见光存在下,光激活酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生,正常的光激活酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生,正常的 A-TA-T碱基碱基对重新形成,对重新形成,然后光复活酶从已修复好的 DNA 上脱落。
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通过光复活酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程
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B. 核苷酸切除修复 修复酶是由基因 uvrA 、uvrB 和 uvrC 分别编码的三个亚基组成的,所以该酶又称为 ABCABC 切除核酸酶切除核酸酶。 首先首先 ABCABC 切除核酸酶切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含从损伤部位的两侧切去含有损伤的有损伤的 DNADNA 链,链,结果都出现一个单链缺口。然后在 DNA 聚合酶催化下按照互补链填充缺口,切口最后通过 DNA连接酶连接。
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C. 碱基切除修复
DNADNA糖基化酶糖基化酶是一个能识别 DNA 中象尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤那样的不正确碱基的酶,这些碱基都是由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤分别脱氨形成的。这样变型的碱基可以通过DNA糖基化酶切断 N-糖苷键除去,这样一来在 DNA 中制造了脱嘌呤或脱嘧啶的部位,通常将这样的部位称之 AP 位点。
每种 DNA糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。例如尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶,形成一个 AP 位点。然后一个称为 AP内切核酸酶切去含有 A
P 位点的脱氧核糖 -5- 磷酸,出现一个核苷酸空隙。然后在 D
NA 聚合酶作用下重新放置一个正确的核苷酸,最后通过 DN
A连接酶将切口封闭。
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尿嘧啶糖基化酶系统的修复过程
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D. 错配修复 偶尔错误的 DNA 复制会导致新合成的链与模板链之间的一个错误的碱基配对。这样的错误可以通过 E.coli 中的 3 个蛋白质( MutSMutS 、、 MutHMutH 和和 MutLMutL )校正。该修复系统只能校正新合成的 DNA ,其主要依据是新合成的链中 GATC序列中的A (腺苷酸残基)开始未被甲基化。 GATC 中 A甲基化与否常用来区别新合成的链(未甲基化)和模板链(甲基化)。这一区别很重要,因为修复酶需要识别两个核苷酸残基中的哪一个是错配的,否则如果将正确的核苷酸除去就会导致突变。未甲基化的 GATC序列不需要紧靠着错配碱基,因为错配碱基与GATC序列之间的间隔的 DNA序列可以被外切核酸酶切除,是从 3ˊ 还是从 5ˊ 方向切除取决于不正确碱基的相对位置。
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错配修复
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要点归纳
1. DNA复制是半保留复制,半保留复制已经经 Meselson-Stahl实验证实。在半保留复制方式中两条亲代链分开,分开后的每一条链都可作为模板用于合成互补的、反平行的子链。就是说双螺旋子链中有一条链来自亲代链,另一条链则是以该亲代链为模板新合成的互补链。
2. DNA 合成需要 DNA 聚合酶, DNA 聚合酶需要一个游离的 3′羟基作为引物(可以由 RNA或 DNA 提供),以脱氧核苷三磷酸作为底物,催化 3′羟基与脱氧核苷三磷酸的 5′-α- 磷酸基团形成磷酸二酯键,释放出焦磷酸(随后水解为无机磷酸),使核苷酸整合到延伸的聚核苷酸链中。新链按 5′→3′方向生长。
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3. 原核生物中存在 3种聚合酶( pol I、 II和 III)。而真核生物中存在 5种聚合酶( polα、 β、 γ、 δ和 ε)。在 E.coli中, pol Ⅲ是主要的复制酶,而 pol I 既有复制功能,又有修复功能。所有三种原核生物的 DNA聚合酶都具有 3′→5′外切酶的活性,该酶可以将经聚合酶催化错配的核苷酸切去。 DNA pol I和 III还具有 5′→3′外切酶活性。
4. 复制起始发生在复制起点, E.coli 中存在唯一的复制起点( OriC ),从一个复制起点沿着相反方向双向进行。真核生物染色体含有许多复制起点。真核生物 DNA 的复制也是双向进行的,但与 E.coli 不同,可以在许多复制起点同时双向进行复制。
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5. DNA复制需要双链解旋形成复制叉,解旋需要解旋酶,ATP 驱动的解旋酶使复制起点( OriC)区解旋,制造复制叉,单链结合蛋白与两条模板链结合防止他们重新形成双螺旋。在复制叉处,亲代 DNA的两条链作为模板用于合成新的 DNA。
6. 由于 DNA 聚合酶催化的链的延伸是 5′→3′方向,以及双螺旋 DNA 中的两条链是反平行的,因此聚合酶沿着复制叉处两条模板链移动的方向是相反的。结果造成一条链(前导链)的合成是连续的,合成方向与复制叉移动方向一致;另一条链(滞后链)的合成是不连续的,合成方向与复制叉移动方向相反。
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7. 复制起始是借助于引发酶合成的 RNA 引物开始的,前导链合成需要一个 RNA 引物,而滞后链需要多个 RNA 引物。在滞后链合成中,在 DNA pol III催化下,由每个引物按照模板链合成互补短DNA片段,称之为岗崎片段。然后 DNA pol Ⅰ的 5′→3′外切酶活性将 RNA 引物切除,再通过其聚合酶活性催化冈崎片段之间空隙的核苷酸填充,最后 DNA连接酶将新生的冈崎片段连接起来。
8. 复制的忠实性非常高,主要是由于 DNA 聚合酶具有3′→5′外切酶的活性。但在复制过程中由于碱基配对错误、以及碱基共价修饰、碱基缺失和插入都会产生突变,并造成DNA 损伤。复制后的修复主要包括 5 种修复机制:直接修复、切除修复、错配修复等。