3. Materiales Diluyentes Medios de Cultivo

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3. MATERIALES. DILUYENTES. MEDIOS DE CULTIVO

3.1 MATERIAL Y EQUIPAMIENTO BÁSICO

A. Material de vidrio o de plástico esterilizable. Tubos de ensayo de diferentesmedidas, placas de Petri, pipetas graduadas, asa de Digralsky, matraces, erlenmeyers,

probetas, botellas con tapón de rosca, portaobjetos, portaobjetos socavados,

cubreobjetos. B. Material diverso. Asas de Kolle, gradillas, cestillos metálicos, mecheros Bunsen,

trípodes, termómetros, algodón, papel de embalaje, indicadores de pH, etc.

Fig. 3.1

C. Aparatos I. Balanzas: Granatario, de precisión y analíticas.

II. Microscopio. Microscopio óptico con objetivo de inmersiónIII. Estufa de incubación

IV. Centrifuga

V. Autoclave

VI. Espectrofotómetro

VII. pHchímetro

VIII.Agitadores




3.2 CONDICIONES DE CRECIMIENTO

Para un buen crecimiento microbiano se tienen que cumplir una serie de requerimientos

fisicos y químicos:

a. Requerimientos Físicos: Temperatura, pH, presión osmótica.

b. Requerimientos químicos: Agua, fuentes de carbono y nitrógeno, sustancias

minerales, oxígeno y factores orgánicos de crecimiento.

3.3 DILUYENTESLas muestras problemas presentan a menudo una concentración de bacterias excesiva, que

precisa de diluciones previas, para realizar siembras que permitan lecturas dentro de la

normativa (30-300 colonias/placa petri).

La característica principal de un buen diluyente es que no produzca modificaciones

cualitativas ni cuantitativas en la flora existente, es decir, que mantenga lo más fielmente

posible la flora de la muestra, sin suprimirla ni favorecer su desarrollo.

Los diluyentes requieren por ello cumplir con determinadas exigencias de los

microorganismos, en cuanto a: pH, Isotonicidad

Diluyentes En Microbiología se utilizan varios diluyentes, habitualmente los siguientes:

Agua de triptona (Tryptone Water: TW)

Soluciones salinas

Las soluciones salinas no son medios de cultivo ya que no permiten el crecimiento de los

microorganismos. Mantienen los microorganismos en suspensión sin que disminuya su

viabilidad, debido a que son isotónicosiy tienen niveles de pH adecuados.

Para su preparación se disuelven las sales en agua destilada y se ajusta el pH con ácido

clorhídrico 0,1 N o hidróxido de sodio 0,1 N. La solución así preparada se distribuye en

recipientes adecuados y se esteriliza en autoclave.

a) Solución de Ringer 3333b) Solución salina (SS) c) Tampón fosfato (PBS)

Presión osmótica

Si ponemos en contacto a través de una membrana semipermeable (pergamino o cerámica

porosa impregnada de ferrocianuro de cobre), dos disoluciones con diferente concentraciónde soluto, el flujo de disolvente es mayor desde la disolución más diluida hacia la disolución

más concentrada. (debido al impedimento producido por las moléculas de soluto)

Se denomina osmosis al paso de disolvente a través de una membrana semipermeable.




Llamamos presión osmótica a la presión hidrostática que es capaz de impedir el flujo neto

de disolvente hacia la disolución a través de la membrana semipermeable.

Ley de Van't Hoff : = M$R $T =

n

V $R $T

Osmosis inversa , fenómeno que se obtieneejerciendo sobre la disolución concentrada una

presión superior a la presión osmótica

(desalinización de agua, concentración de zumos

de frutas).

Osmol Presión osmótica de un mol de soluto no

disociado disuelto en 1 litro de agua a 22,4 at. de

presión y 0º C.

El estado de la concentración salina del medio respecto a las células puede ser de tres tipos:

1. Isotónico, si las concentraciones del medio y las células son iguales. En microb. se

suele trabajar en condiciones de isotonía (300 miliósmoles j dº 10-20 % sacarosa).

2. Hipertónico, si la concentración del medio es mayor que la de las células. Los

halófilos (Staphylococcus) permiten concentraciones muy altas de NaCl. En general

los salazones son un buen método de conservación. 3. Hipotónico el medio presentan menor presión osmótica que las células. La bacterias

que pueden vivir en medios hipotónicos (acuosos), se debe a la pared rígida que

permite que el agua no penetre la bacteria.

En el mundo de las procariotas, seres ligados por completo al medio acuático, las barreras

que aíslan en cierto modo a la delgada membrana celular son:

La pared celular no es rígida (balón de fútbol). Como una pelota inchada, el

protoplasto totalmente lleno confiere rigidez a la célula. La pared celular es permeable

a sales y sustancias de bajo peso molecular.

La cápsula (en ocasiones)

La membrana citoplasmática es semipermeable y osmóticamente activa: controla la entrada y

salida de sustancias disueltas, así como la eliminación de residuos.

Si hacemos aumentar la presión osmótica exterior (medio hipertónico añadiendo + azúcar o

urea), se extrae agua de la célula y el protoplasto se encoje (plasmólisis). La célula puede

modificarse de forma irreversible.

Si el medio es hipotónico, la célula recibe agua del medio y se incha (turgencia). La célula

puede reventar.

Seres unicelulares, como los protozoos ciliados y otros muchos, presentan un conjunto de

vacuolas dilatables, que actúan regulando el nivel de agua en el citoplasma.




Estos fenómenos osmóticos explican muchas propiedades de los seres vivos:

Las raíces absorben agua cuando las soluciones del suelo son hipotónicas respecto del

citoplasma de las células de la planta. En caso contrario, el agua sale de la planta y

esta acaba secándose.

El crecimiento rápido de las plantas se debe en gran medida a la turgencia que

provoca en sus células la entrada de agua del suelo. Las inyecciones intravenosas han de tener la misma concentración salina que el

plasma sanguíneo, pues si fueran más diluidas, podría provocarse la rotura de las

células sanguíneas.

La mayoría de las bacterias no necesitan regular su osmolaridad interna con precisión porque

están protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presión osmótica

interna.

Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio. Si la

presión osmótica interna desciende por debajo de la externa, el agua sale de la célula y el

volumen del citoplasma disminuye, dañándose la membrana. En las bacterias Gram positivas

esto provoca que la membrana celular se separe de la pared, se dice que la célula se ha

plasmolizado.

Las bacterias varían ampliamente en sus requerimientos osmóticos. Algunas crecen en

disoluciones muy diluidas y otras en disoluciones de elevada osmolaridad que reciben el

nombre de osmófilos.

La mayor parte de los ambientes naturales con elevada osmolaridad contienen concentraciones altas

de sales, especialmente cloruro sódico. Los microorganismos que crecen en este tipo de ambiente se

llaman halófilos.

Las bacterias se pueden dividir en 4 amplias categorías con respecto a su tolerancia a la sal:

1. no halófilos2. organismos marinos3. halófilos moderados4. halófilos extremos

Algunos halófilos, por ejemplo, Pedioccocus halophilus, pueden tolerar concentraciones elevadas de

sal en el medio de crecimiento, pero también pueden crecer en medios sin NaCl.

Otras bacterias, entre las que se incluyen las marinas y algunos halófilos moderados, así como los

halófilos extremos, requieren NaCl para el crecimiento.

pH del medio

Los iones OH-y H3O

+son los más móviles de todos, por lo que pequeñas variaciones

en su concentración tienen grandes consecuencias.

Las lesiones que aparecen a valores de pH desfavorables no se deben directamente a

la acción de los iones hidroxilo/hidronio, sino a que una concentración elevada de




estos desplaza el equilibrio de los ácidos o bases débiles presentes en la disolución en

favor de las formas no disociadas, las moléculas de ácidos y bases (sin carga)

penetran con mucha mayor facilidad en las células que los productos de su

disociación. El succianato dibásico, el ácido cítrico tribásico, penetran tanto más

rápidamente en la célula, cuanto más bajo sea el valor del pH del medio.

a. neutrófilos la mayoría de m.o. se desarrollan óptimamente a pH 7. b. alcalófilos, algunas bacterias prefieren un medio ligeramente alcalino (nitrificantes,

rizobios, actinomicetos o bacterias degradadoras de la urea como el Proteus pH 8),

Vibrio Cholerae se desarrolla bien a pH 9. c. acidófilos

1. pocas son ácidotolerantes (lactobacillus, acetobacter,...)

2. acidófilas: Thiobacillus

Los Hongos preferentemente a pH 5,0.

Medios tamponadosEs fácil en un medio de cultivo que puedan aparecer variaciones de pH como consecuencia

de los metabolitos que se producen en la degradación de los nutrientes por parte de lasbacterias. Es típico en la fermentación glucídica que se produzca acidificación del medio, o

que se alcalinize el medio al utilizar la bacteria sales de amonio, como fuente de energía, en

la degradación proteica.

El mantenimiento de un determinado valor de pH durante el crecimiento tiene gran

importancia para los mo. que producen ácidos pero no los toleran (Lactobacilos,

Enterobacterias, muchas Pseudomonas).

a. Fosfatos inorgánicos tienen leve efecto tampón a pH >7,2 b. Carbonato de calcio en caso de producción más fuerte de ácidos c. Carbonato de sodio si no se quieren componentes insolubles

Los fosfatos son ampliamente utilizados para la preparación de medios porque son los únicos

agentes orgánicos que tienen acción amortiguadora en la escala fisiológicamente importante

en torno a la neutralidad y porque son relativamente atóxicos para los microorganismos.

Además, proporcionan una fuente de fósforo, un elemento esencial para el crecimiento.

A concentraciones elevadas el fósforo se hace inhibidor, de tal manera que la cantidad de

fosfato de amortiguación que puede ser utilizada en un medio está limitada por la tolerancia

del organismo en particular que se va a cultivar. Generalmente, pueden ser tolerados por las

bacterias y los hongos unos 5 g de fosfatos de potasio por litro de medio.




Temperatura

1. . Cada bacteria tiene una zona de crecimiento determinada por temperaturas máxima y

mínima. Según sea el valor de la temperatura óptima se clasifican en:

a. psicrófilas o criófilas afinidad por el frío 5-25 ºC . Son organismos entre los

que predominan algunas bacterias marinas (bacterias luminiscentes) ; tienen su

tasa óptima de crecimiento por debajo de los 20 ºC. b. mesófilas crecen bien a la temperatura corporal de los mamíferos (20-42 ºC) c. termófilas afinidad por el calor (40-70ºC Bacillus stearothermophílus,

Thermoactinomyces vulgaris; Se denominan organismos termófilos extremos

a aquellos que tienen su óptimo de crecimiento por encima de los 65ºC

(Thermus aquaticus, Sulfolobus); algunos de ellos pueden crecer a

temperaturas por encima de los 70ºC (varias especies del género Bacillus y

Clostridium) o incluso por encima de los 80ºC (Sulfolobus acidocaldarius) o

incluso a 105ºC (Pyrodictium occultum, una bacteria reductora de sulfato

anaeróbica estricta).

3.4 MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los

microorganismos. Han de tener fuentes de carbono, oxígeno, hidrógeno, nitrógeno, azufre,

fósforo y en menor cantidad otros elementos, tales como hierro, magnesio, etc.

Los medios de cultivo sólidos no sólo sirven de fuente de nutrientes, sino también como

soporte físico para las bacterias, de tal forma que crezcan formando colonias y sean visibles a

simple vista.

La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad de mediosde cultivo es también grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para

todos ellos. En el anexo I se detalla la composición de los medios de cultivo más frecuentes.




3.5 COMPONENTES BÁSICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Agar. El agar e utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de

cultivo. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido, al que

acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de

agar al 1-2 % en agua licúa hacia los 100 ºC y se gelifica alrededor de los 40 ºC,

dependiendo de su grado de pureza. Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p. ej.,

carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y calor, y posteriormente

concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados

son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos:

extracto de carne, de levadura, de malta, etc. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales

minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o

vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos

y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Fluidos corporales. Sangre completa, plasma, o suero sanguíneo son frecuentemente

añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos.

Carbohidratos. Llamados comúnmente azúcares, se utilizan para enriquecer medios,para promover el crecimiento o la pigmentación y para determinar si los organismos

pueden producir ácido y gas a partir de ellos. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de

cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los

microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está

próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias

como las peptonas, previenen una desviación de pH. Indicadores de pH. Indicadores ácido-base se añaden a menudo a los medios de

cultivo con objeto de detectar variaciones de pH. Agentes reductores. Se añaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de

gérmenes anaerobios. Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede

convertirlo en selectivo. Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sódica,

antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente

a determinados microorganismos. 3.6 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

A) SEGÚN SU UTILIZACIÓN

Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.

Agar nutritivo, Agar PCA, Agar TSA, Medio CPS (almidón-peptona-caseína) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado tipo de

microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos

determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás. Entre los más usados destacan los

medios que se emplean para el recuento de los organismos intestinales del grupo

coliforme (Agar Mc Conkey, Medio de Endo). Otros medios seleccionan

determinado tipo de patógenos (Agar Salmonella-Shigella), Caldo de Rothe para la

detección de estreptococos de origen fecal.




Medios diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que

un determinado tipo de microorganismo posee. Se utilizan para determinar las

propiedades fisiológicas y bioquímicas de las bacterias. Son ejemplos el agar citrato

de Simmons para determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como única

fuente de carbono.

B) SEGÚN SU ESTADO FÍSICO

Sólidos: Placa de Petri. Se ven perfectamente las colonias y se puede tomar una sola

colonia con mayor facilidad que en tubo. Sufre mayor desecación y todo el

medio es aerobio. Tubo con agar inclinado. Se siembra por picadura o estría, el fondo es

anaeróbico y la superficie inclinada aeróbica. Se contamina y deseca menos

que la placa de Petri. Semisólidos

Tubo con agar recto. Se utiliza para observar la motilidad tras la siembra por

picadura. Líquidos

Tubo. Todo el medio es aeróbico debido a las corrientes de convección.

3.7 PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma liofilizada que es preciso

rehidratar. En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar

la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del

fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los

componentes previamente esterilizados en autoclave.

Antes de su esterilización, los medios líquidos en caldo se distribuyen en los recipientes

adecuados (tubos o matraces); en ningún caso la altura del líquido en el recipiente debe

exceder un tercio del volumen total de este. Si es un medio sólido, habitualmente se procede a

fundir el agar en un baño María antes de esterilizarlo.

Finalizada la esterilización en el autoclave:

Los medios líquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente.

Los medios sólidos contenidos en tubos deben inclinarse para solidificarse, adoptando

la forma de agar inclinado (pico de flauta o slant). Las placas de Petri se preparan vertiendo el medio aun fundido y estéril dentro de

ellas en un ambiente aséptico (p.ej., en la proximidad de la llama de un mechero

Bunsen).

Caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperaturaambiente. No obstante, para reducir su deshidratación es mejor conservarlo a 4 ºC,

en posición invertida y envueltas en bolsas de plástico microporoso.




Fig. 3.1

Caducidad. Los medios de cultivo preparados y almacenados adecuadamente, tienen por

regla general, las siguientes caducidades:

Placa Petri: 2,5 meses

Tubos: 6 meses




PRACTICA 3.1 IDENTIFICACIÓN DE NUTRIENTES:

A) RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO.Los glúcidos (Hidratos de carbono) se clasifican en tres grupos:

Monosacáridos: Glucosa, Fructosa, Galactosa.

Disacáridos: Maltosa, Sacarosa, Lactosa.Polisacáridos: Almidón, Celulosa

Monosacáridos. Identificación con Reactivo de Fehling.

El reactivo de Fehling está formado por dos soluciones:

A) solución sulfato de cobre y

B) solución de NaOH y tartrato de sodio y potasio

Al mezclar las dos disoluciones se forma hidróxido de cobre (II) de color azul intenso e

insoluble, que no precipita sin embargo ya que forma un ion complejo con la sal orgánica.

Al adicionar el licor de Fehling a un compuesto reductor (glucosa) el Cu2+

pasa a Cu+, que en

medio básico da un precipitado de color pardo-rojizo.Polisacáridos. Identificación con Lugol (reactivo específico para almidón). El Lugol es una

solución que da una coloración azul violeta específica con el almidón.

Procedimiento: Marcar cada par de tubos como "A - B".

2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de glucosa

2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de fructosa

tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de maltosa

2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de sacarosa

2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de lactosa

2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de almidón

Añadir a los tubos "B" 2 ml de reactivo de Fehling (recién preparado).

Observar resultados a los 2 min. y cada 5 min.durante la ½ hora siguiente

Añadir a los tubos "A" unas gotas de disolución de Lugol. Agitar.

Observar los cambios producidos y anotar los resultados.

Hidrólisis del almidónLa enzima amilasa, presente en la saliva, actúa sobre el polisacárido almidón,

hidrolizando el enlace O-glicosídico, que se transforma en glucosa.

Procedimiento:Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo numerados del 1 al 4.

Añadir en cada tubo 5 ml. de una solución diluida de almidón.A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva (aprox. 1 ml.).

Colocar los tubos 3 y 4 al baño maría ( aprox. a 37 ºC) durante 15 min.

Realizar la prueba de Fehling sobre los tubos 1 y 3

Realizar la prueba del Lugol sobre los tubos 2 y 4.

Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones




Hidrólisis de la sacarosaEl ácido clorhídrico permite romper el enlace o-glicosídico. La hidrólisis de la

sacarosa descompone el disacárido en los dos monosacáridos glucosa y fructosa.

Procedimiento:Poner en dos tubos de ensayo numerados 5 ml. de solución de sacarosa

Añadir 10 gotas de HCl 10% en el tubo nº 1. Calentar suavemente a la llama delmechero durante un par de minutos. Dejar enfriar.

Realizar la Prueba de Fehling en ambos tubos calentandolos 5 min. al baño maría.


B) RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS.

Identificación con Sudán III ( colorante específico para grasas, que se manifiesta en la

aparición de un color naranja caraterístico).

Procedimiento: Numerar 10 tubos de ensayo

Añadir 2 ml de agua en los tubo nº 1-2Añadir 2 ml de disolución de glucosa en el tubo nº 3-4

Añadir 2 ml de aceites diversos en los tubos nº 5-6, 7-8, 9-10.

Añadir 5 gotas de Sudan III en cada uno de los tubos impares. Observar la coloración.

Añadir 5 gotas de tinta roja en cada uno de los tubos pares. Observar la coloración.

Añadir 1 ml. de agua a los tubos de aceite, agitar fuertemente y dejar reposar.

Observar carácter hidrófilo/lipófilo del Sudán III.

Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones.

C) RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS.

Prueba del biuret .Reactivo específico para proteínas. Al mezclar una proteína con un álcali

concentrado y algunas gotas de sulfato de cobre(II) diluido se produce un color violeta-

rosáceo, debido al grupo - CO·NH- (enlace peptídico).

Prueba xantoproteica. Las proteínas tienen en su estructura aminoácidos aromáticos que

tratados con HNO3, dan un compuesto de color amarillo (compuestos aromáticos

nitrados) que al añadir un álcali da color anaranjado oscuro.

Procedimiento:Numerar 4 tubos de ensayo y añadir:

Tubo nº 1, 3 ml. dº al 50% de clara de huevo y 10 gotas de ácido nítrico concentrado.

Agitar para evitar la coagulación de la parte superior.

Tubo nº 2, 3 ml. de disolución de clara de huevo. Añadir reactivo de Biuret: 2 ml.disolución A y 4-5 gotas solución B.

Tubo nº 3, 2 ml de solución de sacarosa y 10 gotas de ácido nítrico concentrado.

Tubo nº 4, 2 ml de solución de sacarosa Añadir reactivo de Biuret: 2 ml. disolución A

y 4-5 gotas solución B.

Calentar al baño maría 5 min. los tubos 1 y 3. Enfriar y alcalinizar el medio con gotas

de NaOH 20 % (controlar el pH con papel indicador).





Reacción de los aminoácidos azufrados

Se separa mediante un álcali, el azufre presente en los aminoácidos azufrados. El

acetato de plomo precipita el azufre en forma de sulfuro de plomo de color negro.

Procedimiento

Poner en el tubo de ensayo 3 cc. de clara de huevo.Añadir 2 cc. de solución de NaOH 20%.

Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5 %

Calentar el tubo hasta ebullición

Coagulación de proteínas

Colocar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo.

Añadir 5 gotas de ácido acético y calentar el tubo a la llama del mechero

Observar los resultados

Residuos: Reactivo de Fehling Bidón D Aceite Bidón aceites Lugol Fregadero Proteínas Fregadero

PRÁCTICA 3.2 MODIFICACIÓN DE LAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO(Escherichia. coli, Staphylococcus epidermidis, Saccharomyces cerevisiae)

A) Efecto del pH sobre los microorganismos.

a) Preparar caldo TSB (artesano y sin tamponar) a pH1

4, 5, 7, 10. Distribuir y esterilizar:

- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB a pH 4


- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB (comercial) a pH 7


- 1 tubo control de TSB sin inocular

Sembrar con asa de Kolle de cada cultivo dispuesto al efecto. Incubar 48 h. a 37 ºC.

(Saccharomyces a 27 ºC). Recoger los datos (claro, algo turbio, turbio, muy turbio) en un

cuadrante. Enumerar las conclusiones que se deriven de los resultados obtenidos.

B) Efecto de la presión osmótica sobre los microorganismos a. Preparar tubos inclinados con 10 ml. de agar TSA(máximo pico de flauta)

3 tubos de TSA

3 tubos de TSA con un 5% de NaCl.

3 tubos de TSA con un 10% de NaCl. 3 tubos de TSA con un 15% de NaCl.

1 tubo control de TSA sin inocular

Esterilizar y sembrar en estría con asa de Kolle un inóculo de cada una de los dos cultivos

puros dispuestos al efecto. Incubar 48 h. a 37 ºC (Saccharomyces a 27 ºC).

Recoger los datos (claro, algo turbio, turbio, muy turbio) en un cuadrante. Enumerar las

conclusiones que se deriven de los resultados obtenidos.

1Para preparar los caldos a pH 4, 5, 10 utilizar disoluciones tampón 4, 5, 10 respectivamente.




DILUCIONES

Diluir una solución consiste en disminuir la concentración de soluto de la misma añadiendo

disolvente (diluyente). Es necesario diluir las muestras para obtener concentracionesadecuadas a las técnicas de recuento de microorganismos.

Si tomamos 1 ml de una solución (agua de pozo, carne en agua de peptona, NaOH 5%, etc...)

y le añadimos 4 ml de diluyente (agua destilada, solución Ringer, agua de peptona, ...)

podemos decir que hemos realizado una dilución:

15 (numerador = nº partes solución inicial, denominador = nº partes solución final)

1:4 (partes de solución inicial: partes de diluyente)

al 20 % (partes de solución inicial en 100 partes de solución final.

15 $ 100 = 20%

) diluir la solución 5 veces (nº de veces que aumenta el volumen de la disolución inicial.

Es el inverso del factor de dilución15 )

Diluciones.

Se cumple en diluciones sucesivas que: c2 = c1 ·1d1

1d2

$ $ $ siendo:

c2 = concentración final de la disolución

c1 = concentración inicial de la disolución1d = factores de dilución

Preparación de diluciones.

Para preparar una dilución1d por cada unidad de volumen de solución inicial añadiremos (d-

1) unidades de volumen de diluyente. Ej. Para hacer una dilución 1/5 de una solución inicial,

deberemos añadir a cada ml de soluto 4 ml de diluyente

Diluciones decimales

1/10 (10-1

) ----> 1 ml de solución inicial/10 ml disolución final.

Para diluciones decimales añadiremos 1 ml de soluto a 9 ml de diluyente (factor de dilución

1/10).

Banco de diluciones

Es la preparación de una serie de diluciones de una determinada sustancia a partir de una

solución madre o solución inicial. Las sucesivas diluciones tienen una concentración cada

vez menor.




Problema nº 1: Explicar qué volúmenes de diluyente se necesitarían para preparar las

siguientes diluciones (se parte de 10 ml. de disolución inicial).

Diluir una solución 1/4 Diluir al 5%

Diluir una solución 1:4 Diluir una solución 10 veces

Problema nº 2: Calcular la concentración de una dilución obtenida a partir de una solución inicial al 10 % y que se ha diluido al 1/10.

Problema nº3: Calcular la concentración de una dilución obtenida a partir de una solución inicial de glucosa 5 g/l y que se ha diluido primero al 1/10 y la solución obtenida se vuelve a

diluir al 1/5. ¿Cuál será el fáctor de dilución total?

Problema nº 4: Cuántos ml de agua destilada hemos de añadir a 1 ml de una solución inicial

para hacer una dilución decimal (1/10). Y para una dilución decimal de 10 ml .

Problema nº 5: Si tenemos 0,3 ml de una solución salina al 5% y añadimos 4,7 ml de agua

destilada, que concentración tendrá la solución resultante.

Problema nº 6. Partiendo de una solución madre de NaCl de concentración 9 g NaCl/l,

efectuar un banco de diluciones con 3 tubos que contiene cada uno de ellos 8 ml de agua

destilada y siendo los sucesivos factores de dilución 1/5. Describe como realizarías la

operación y cuál sería la concentración final en g/l, y el factor de dilución total.

Problema nº 7: Expresar de otra forma las siguientes diluciones:

diluir n veces % 1/d 1:x

50%

1/10

1:1

25%

1/5

diluir 4 veces

3. Materiales Diluyentes Medios de Cultivo

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