MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO TRADICIONALESSEGN SU ESTADO FISICO Slidos, presentan en su composicin una agente solidificante (AGAR) en proporcin de 12 a 15 gramos por litro. Semislidos, presentan AGAR en su composicin, pero a una concentracin mucho menor, entre 2,5 a 4 gramos del agente solidificante. Lquidos, no presenta ningn agente solidificante.

SEGN SU COMPOSICION Empricos, en su composicin aparecen sustancias orgnicas Sintticos, en su composicin aparecen sustancias qumicas definidas Semisintticos, en su composicin aparecen molculas de naturales hidrolizadas

SEGN AL USO AL QUE SE DESTINEN

Enriquecidos, suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores, tales como sangre de caballo, etc.

Diferenciales o de aislamiento, contienen colorantes, azucares e indicadores para provocar la respuesta bioqumica conocida.

Selectivos e inhibidores, adems de los componentes de los medios diferenciales, contienen en su composicin una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompaante de la muestra a estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca.

Transporte y mantenimiento, se utilizan en la recogida, transporte y conservacin de muestras biolgicas. Son medios muy reductores que inhiben las reacciones enzimticas autodestructivas dentro de las clulas evitando los efectos destructivos de la oxidacin.

Uso general, son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos.

Filtros de membrana, son medios que permiten el examen de grandes volmenes con un baja concentracin de microorganismos, la separacin de los microorganismos del medio de cultivo e incluso su cambio de un medio de cultivo a otro, permite el crecimiento sin interrupcin del microorganismo.

Mtodo de preparacin

Agar Levine EMBEs un medio selectivo y diferencial.La lactosa es utilizada va fermentativa por las enterobacterias con produccin de cido.Cando la acidificacin es muy intensa los colorantes precipitan, lo que origina colonias negruzcas con brillo metlico caractersticas de E. coli.E. coli forma colonias de 2-4 mm con brillo metlico caracterstico.Enterobacter aerogenes forma colonias de 4-6 mm con centro pardo grisaceo y no brillo metlicoProteus, Salmonella y Shigella, forman colonias transparentes por no utilizar la lactosa.

Agar CetrimidaEs un medio selectivo para aislamiento de Pseudomonas.La Cetrimida (Cetil-trimetil-amonio-bromuro) sirve para conseguir una notable inhibicin de la flora acompaante.Una concentracin de 0,3 g/l ejerce una suficiente inhibicin de los microorganismos acompaantes perjudicando minimamente el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. Estas colonias forman un pigmento verde-azulado (piocianina) y son fluorescentes a la luz UV.

Manitol saladoEs un medio selectivo para el aislamiento de Staphylococcus.La alta concentracin de sal permite solo el crecimiento de microorganismos tolerantes a ella, entre los que se encuentran, entre otros, los del genero Staphylococcus. La fuente de carbono es elmanitol que se degrada con produccin de cido, lo que se pone de manifiesto por un viraje en el colorante Rojo de fenol, que cambia a color amarillo.Staphylococcus aureus forma colonias puntiformes rodeadas de un halo amarillo.

Agar SangreEs un medio de cultivo enriquecido y diferencial que permite el crecimiento de gran nmero de microorganismos.Se emplea para determinar las reacciones de hemlisis-hemlisis: lisis parcial de los glbulos rojos, se forma un halo verdoso alrededor de la colonia.-hemlisis: lisis completa de los glbulos rojos, aparece una zona transparente alrededor de la colonia.-hemlisis: no actan sobre los glbulos rojos, no forman ningn halo.Hemolisis deStreptococcus spp. (izquierda) alfa hemolisis (S. mitis); (en medio) Beta hemolisis (S. pyogenes); (derecha) gamma hemolisis (= no hemoltico,S. salivarius)

Mac Conkey AgarPermite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin enlas colonias, y la precipitacin de las sales biliares.Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.Escherichia coli- Rojas con halo turbioKlebsiella pneumoniae- Rosadas mucosasSalmonella typhimurium- Incoloras, transparentesShigella flexneri- Incoloras, transparentesProteus mirabilis -Incoloras, transparentesEnterococcus faecalis- Diminutas, incoloras, opacas

Bilis-Verde Brillante, Agar

Se emplea como medio selectivo y diferencial para determinar bacterias Coliformes en agua, aguas residuales y alimentos.La presencia conjunta del verde brillante y de la bilis hacen que el medio sea selectivo para bacilos Gram-negativos, los cuales al fermentar la lactosa dan lugar a colonias intensamente rojas rodeadas de un halo rosa, que contrastan con el fondo verde azulado del medio.

Bilis-Verde Brillante 2%, Caldo

Coliformes en aguas, leches, productos alimenticios y otras muestras(NMP)El objetivo de este medio es el de poder inhibir el crecimiento de los microorganismos distintos de los del grupo de Coliformes, al tiempo que stos puedan crecer sin restriccin. Con la presencia de la Bilis de buey y del Verde Brillante se consigue la inhibicin de casi la totalidad de los microorganismos Gram-positivos y de los Gram-negativos distintos de los del grupo de los Coliformes.Debe confirmarse la identificacin por otras pruebas ya que la fermentacin de la lactosa con formacin de gas se interpreta como indicativo de E. coli. La produccin de gas se evidencia con la campana de Durham.

Salmonella Shigella AgarMedio de cultivo utilizado para el aislamiento a partir de heces, alimentos.Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias. Los microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Salmonella typhimurium Transparentes, centro negroShigella flexneri IncolorasShigella sonnei IncolorasProteus mirabilis Transparentes, centro negroEscherichia coli Rosadas a rojasKlebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosasEnterococcus faecalis Incoloras, de muy escaso crecimiento

Agar SabouraudEl bajo Ph del medio resulta favorable para el crecimiento de los hongos y ligeramente inhibitorio para las bacterias. En caso de requerirse un inhibir el crecimiento de bacterias se recomienda usar agentes antimicrobianos como la gentamicina (gram-) o cloramfenicol.

Mueller Hinton Agar

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos.

MEDIOS DE CULTIVO CROMOGNICOSEl incremento del comercio internacional de alimentos en los ltimos aos hizo necesario el uso de medios de diagnstico microbiolgicos cada vez ms rpidos y eficienteslas empresas productoras de medios para deteccin y recuento de microorganismos han desarrollado una gran variedad de medios de cultivos, kits y equipos que permiten un diagnstico cada vez ms rpido y sumamente eficaz, que conducen a obtener resultados sobre la presencia de determinado patgeno en tan solo 24 a 48 horas

Ventajas

Eliminan la necesidad del subcultivoEliminan la elaboracin de numerosas pruebas bioqumicas economizando tiempo y dinero. Desventajas:La actividad enzimtica de los microorganismosInterpretacin de los colores por parte del operador. Sin embargo con respecto a esto ltimo se han desarrollado equipos que facilitan la lectura de las placas. Para la realizacin de estas tcnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.Los medios de cultivo cromognicos, basados en reacciones de color frente al patgeno buscado, permiten poner de manifiesto la produccin de hemolisinas en tan solo 24 a 48 horas mostrando una sensibilidad cercana al 100%.

Compass Listeria Agar Validacin AFNOR (segn ISO 16140) Formulacin conforme ISO 11290-1/A1 y 11290-2/A1 Resultados negativos en 48 h Confirmacin de positivos en 72 h con Confir37m L. Mono Agar Enumeracin de Listeria monocytogenes en 1 sola placa T=C t=24+2h

Compas salmonella agarAislamiento, diferenciacin y enumeracin de Salmonella Validacin AFNOR Resultados en 24 h Se puede usar como confirmacin despus del SesameSalmonella Test T=37C t=24+2h

Compass Bacillus Cereus AgarDeteccin y el recuento de esporas yformas vegetativas de Bacillus cereus en productos alimentarios. El sustrato cromognico del medio es hidrolizado por el Bacillus cereus, desarrollando colonias de color azul. Selectividad: inhibicin de la mayora de la flora contaminante secundaria. Ciertas cepas deStaphylococcus aureus presentan colonias incoloras con un dimetro inferior a 0,5 mm. Se obtiene un resultado directo por la aparicin de colonias azules a las 24 horas de incubacin,sin confirmacin.

Compass enterococus agarRecuento de Enterococcus en productos alimentarios La eleccin adecuada de agentes selectivos y la temperatura de incubacin, a 44C, aseguran la inhibicin de la microflora secundaria. El sistema enzimtico se basa en la revelacin cromognica de la actividad -glucosidasa gracias al X-glucsido, dando lugar a colonias azules. Se obtiene un resultado directo por la aparicin de colonias caractersticas a las 24 horas de incubacin, sin confirmacin. Fcil deteccin: por el precipitado del substrato calorimtrico en el centro de la colonia despus de la hidrlisis de la enzima -glucosidasa.

E.Coli Chromogenic AgarDeteccin de coliformes totales y E.coli en aguas Formulacin segn normativa: Orden SCO/778/2009,Directiva 98/83/CE y Real Decreto 140/2003 Medio selectivo y especifico Incorpora la vancomicina y la cefsulodina Fcil interpretacin de las colonias Referencias:032383030 CCA Coliformes Chromogenic Agar,30 placas filtracin

TBX Agar Recuento de Escherichia coli en productos alimenticios Resultados en 24 h sin necesidad de confirmacin T=44C t=18-24h Referencias:007255500, TBX Agar 500g007254100, TBX Agar 100g007736010, TBX Agar 10x100ml032321020, TBX Agar 20 placas

Compass Enterobacter Sakazakii AgarDeteccin de Enterobacter sakazakii en productos lcteos,productos deshidratados y materias primas usadas en frmulasinfantiles Excelente especificidad, sensibilidad y recuperacin deEnterobacter sakazakii Fcil de interpretar T=44C t=24+2h Referencias:007777500, Compass Enterobacter Sakazakii 500g007779020, Compass Enterobacter Sakazakii 20 placas

Compass salmonella agar Deteccin especfica de todas las cepas de Salmonella con la actividad C8-esterasa: coloniasrojo-magenta Discriminacin de las bacterias similares a las salmonelas con la actividad -glucosidasa:colonias azul-verdosas Eleccin adecuada de agentes selectivos que asegura la inhibicin de la flora de interferencia,incluso las especies ms prximas a las salmonelas y serotipos atpicos que pueden causarconfusin en otros medios. Optimizacin del medio para conseguir una lectura ms fcil y rpida (colonias ms grandes,color homogneo)

Salmonella: colonias rojo-magentaOtras bacterias

El COMPASS Salmonella Agar es un medio cromognico que detecta TODAS las salmonelasincluyendo:- Salmonella typhi y S.paratiphi- Cepas atpicas:- Lactosa (+) (S. Seftenberg y subespecies arizonae y diarisonae)- Sacarosa (+)- -galactosidasa (+)- H2S (-)- Propilenglicol (-)- Lisina descarboxilasa (-)- Glucuronato (-)- No mviles (S. Pollorum y gallinarum)

Medios cromognicos preparadosCOMPASS Listeria AgarSensibilidad: todas las cepas de Listeria monocytogenes son caractersticas a las 24 horas deincubacin. Especificidad: otras bacterias distintas a L.monocytogenes son azules sin halo o incoloras. Selectividad: alto grado de inhibicin de la flora contaminante secundaria. Fcil lectura e identificacin sencilla.

COMPASS Salmonella AgarOtras Listeria:colonias azul-verdosas sin haloListeria monocytogenes:colonias azul-verdosa + haloIncubacin 24 horas a 37C

COMPASS Enterococcus Agar

Medio selectivo usado para el recuento de Enterococcus en productos alimentarios La eleccin adecuada de agentes selectivos y la temperatura de incubacin, a 44C, aseguranla inhibicin de la microflora secundaria. El sistema enzimtico se basa en la revelacin cromognica de la actividad -glucosidasa graciasal X-glucsido, dando lugar a colonias azules. Se obtiene un resultado directo por la aparicin de colonias caractersticas a las 24 horas deincubacin, sin confirmacin.

COMPASS ECC AGAREs un medio cromognico selectivo usado para el recuento simultneo y especifico de Escherichia coli y coliformes en productos alimentarios y productos destinados a la alimentacin animal (incubacin a 37C). Tambin se puede incubar a 44C para enumerar y distinguirEscherichia coli de otros coliformes termotolerantes. Se basa en la deteccin simultanea de 2 actividades enzimticas: -galactosidasa para loscoliformes (colonias rosa) -glucuronidasa para E.coli (colonias azul-prpura) Permite un mejor recuento de las colonias de E.coli a 37C. Adems las coloniasson mayores y con un color ms intenso.

Sesame salmonellaIncubacin: 24 horas a 37CColonias caractersticas de Escherichia coli(colonias azul-pprura: actividad-galactosidasa y -glucuronidasa) ycoliformes (colonias rosa: produccin de -galactosidasa)

Sesame Salmonella test

Deteccin rpida de Salmonella Validacin AFNOR (segn ISO16140) Resultados negativos en 48 h Confirmacin de positivos en 72 h El medio de enriquecimiento Sesame Salmonella Enrichment se puede utilizar como Agua dePeptona Tamponada. Muy fcil de interpretar

Compass enterococcus agarcolonias azul verdosas tras 24 horas deincubacin a 44CUsado para el recuento de Enterococcus en productos alimentarios La eleccin adecuada de agentes selectivos y la temperatura de incubacin, a 44C, aseguran la inhibicin de la microflora secundaria. El sistema enzimtico se basa en la revelacin cromognica de la actividad -glucosidasa gracias al X-glucsido, dando lugar a colonias azules. Se obtiene un resultado directo por la aparicin de colonias caractersticas a las 24 horas de incubacin, sin confirmacin. Fcil deteccin: por el precipitado del substrato calorimtrico en el centro de la colonia despus de la hidrlisis de la enzima -glucosidasa.

MEDIOS DE CULTIVO FLUOROGNICOS

La rpida deteccin e identificacin de los microorganismos es muy importante en diversos campos de aplicaciones e investigacin.La incorporacin de enzimas y substratos en medios de cultivo selectivos puede eliminar la necesidad de realizar subcultivos y pruebas bioqumicas adicionales para establecer la identidad de ciertos microorganismos.strpuedeeliminar la necesidad de realizaradicionales para establecer la identidadde ciertos microorganismos.

Sustratos FluorognicosColorantes Fluorognicos(8-anilino-1-naphthalene-sulphonicacid, ANS) pH-indicadores fluorescentes (acridine,7-hydroxycoumarin) Indicadores Redox (azul de metileno,verde de Janus, verde B, indigocarmin) Sustratos enzimaticos

Los sustratosenzimticosfluorognicosgeneralmenteconsisten de unsubstrato especficopara una enzimaespecfica tal comouna azcar o unaminocido y unfluorgeno, siendocapaz de convertirla luz UV a luzvisible .La mayora de sustratosenzimticos fluorognicos sonderivados de la Coumarina, talcomo: 4-methylumbelliferone (4-MU) 7-amido-4-methylcoumarin (7-AMC) 4-trifluoromethylumbelliferone (4-TMU)

Sustratos metilumbelliferyl(MUG)

Ventajas Solubles en agua. Estables al calor Alta sensibilidad. No riesgosos para la salud. Precio rasonable . Amplio rango de substratos Mtodos con aprobaciones (ISO, IDF, EPA)Desventajas

Cuando se utiliza la tcnica enzimtica, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que da respuesta positiva al grupo coliforme y posee adems la enzima B-Glucoronidasa, la cual tiene la propiedad de abrir el substrato fluorognico, resultando en la liberacin del fluorgeno.Fluorocult E.coli O157:H7 (Merck)

COMPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOTRADICIONALES VS CROMOGENICOS / FLUOROGENICOS

IDENTIFICACION BACTERIANALos procedimientos para llevar a cabo la identificacin bacteriana van desde los simplemente descriptivos (morfologa y tincin), pasando por las pruebas bioqumicas simples para deteccin de productos metablicos o de una determinada reaccin enzimtica, llegando hasta tcnicas muy sofisticadas como PCR.Las pruebas bioqumicas nos indican una serie de caractersticas metablicas que, en conjunto, nos permitirn diferenciar unas bacterias de otras). Existe un gran nmero de estas pruebas, por lo que es importante considerar:* Origen de la cepa: de dnde la hemos aislado.* Condiciones bajo las que ha sido aislada.* Morfologa.* Tincin, especialmente la de Gram.* Posibilidad de formacin de esporos.* Posibilidad de formacin de cpsula.

IDENTIFICACION BACTERIANA

IDENTIFICACION BACTERIANA

IDENTIFICACION BACTERIANA

IDENTIFICACION BACTERIANA

REACCIONES METABOLICAS

REACCIONES METABOLICAS

REACCIONES METABOLICAS

REACCIONES METABOLICAS

REACCIONES METABOLICAS

REACCIONES METABOLICAS

REACCIONES METABOLICAS

REACCIONES METABOLICAS

REACCIONES METABOLICAS

CASO 1: coliformes totales y E.coli en aguas utilizando el Fluorocult LMXLos coliformes totales presentaron una media geomtrica mucho mayor cuando se utiliza el Caldo Fluorocult LMX que cuando se emplean los medios tradicionales, lo cual indica la superioridad de este medio en el recobrado de estas bacterias con respecto a los medios tradicionales. En el caso de E.coli no se observan grandes diferencias en las medias geomtricas obtenidas por ambos mtodos. En el anlisis de coliformes totales y E.coli mantienen el mismo comportamiento para las muestras, existe un mayor recobrado de bacterias con el Caldo Fluorocult LMX. La media geomtrica del NMP de coliformes, cuando se emplea este medio, es mucho mayor que la obtenida cuando se emplean en el anlisis los medios de cultivo tradicionales (CL-CBVB-EC). No obstante, en el caso de E.coli la diferencia que se observa en las medias geomtricas no es tan grande como la obtenida para coliformes totales.Estos resultados se deben a que la deteccin y cuantificacin de los coliformes mediante los medios tradicionales se realiza de manera indirecta, a travs de un subproducto de la reaccin de fermentacin de la Lactosa, el gas, y segn bibliografa basados en la capacidad de fermentar la lactosa con produccin de gas como factor diferencial, proporcionan resultados falsos, negativos, ya que el 10 % de las cepas de E.coli aisladas por ellos no son capaces de producir cido ni gas a partir de la lactosa.

CASO 2: ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE TECNICAS DE RECUENTO RAPIDO Y CULTIVOS TRADICIONALES PARA ANALISIS DE ALIMENTOS

GRACIAS

POR SU ATENCION

PREGUNTAS???...GRUPO 1:

VERONICA CHIMBOJANNETH CONTRERASJESSICA GUAMANCLARA SARMIENTO

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