2. การเตรียม Expression vector

�� bio_product.indd 1 8/5/2555 15:34:57

การจดการความร ปงบประมาณ พ.ศ. 2553

เรอง การผลตและการควบคมคณภาพ Biotechnological Products

ทปรกษา นางธรนารถ จวะไพศาลพงศ ผอ�านวยการสถาบนชววตถ

คณะผจดท�า นางวชชดา จรยะพนธ

นางสายวรฬ จดรกตตนนท

นายไพศาล พงจนนท

นายกรพงศ ภญโญสขข

นางสาวโสมมรสา พวงพรศร

นายจตพธ ตงตเวชกล

นางฐตาภรณ ภตภณโยวฒน

นางสาวพรรณพสทธ แสงนวล

พมพครงท 1 จ�านวน 1,000 เลม

สงหาคม พ.ศ. 2554

พมพท บรษท FULL FORSE จ�ากด

783 ซอยรชดานเวศน ถนนประชาอทศ เขตหวยขวาง กรงเทพฯ 10320

โทรศพท 02 274 3964-5

โทรสาร 02 691 3990

จดพมพโดย สถาบนชววตถ

กรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข จงหวดนนทบร

โทรศพท 02 591 0000 ตอ 99344 98366

โทรสาร 02 591 0000 ตอ 98131

�� bio_product.indd 2 8/5/2555 15:34:58

ค�ำนยม

ผลตภณฑชววตถเพอการรกษาชนดbiotechnologicalproductsเปนชววตถ

ชนดทผลตดวยเทคโนโลยชวภาพ(biotechnology)ซงเปนเทคโนโลยททนสมยและกาวหนา

อยางรวดเรวและมแนวโนมทจะมการน�าเขาจากตางประเทศเพมมากขนเพอน�ามาใชในการ

ปองกนและรกษาโรคสถาบนชววตถกรมวทยาศาสตรการแพทย ในฐานะทเปนหองปฏบต

การควบคมคณภาพชววตถของประเทศ จงตองรวบรวมและพฒนาองคความรทเกยวของ

ทงทางดานกระบวนการผลตและการควบคมคณภาพผลตภณฑดงกลาวเพอใหมศกยภาพ

พรอมทจะท�าหนาทตรวจสอบคณภาพตลอดจนประสานความรวมมอกบหนวยงานผเกยวของ

ทงภาครฐและเอกชนเพอควบคมคณภาพชววตถเพอการรกษาชนดใหมๆทผลตดวยเทคโนโลย

ชวภาพไดตามมาตรฐานสากลอยางมประสทธภาพ สรางความมนใจแกผใช

คมอการผลตและการควบคมคณภาพชววตถชนด biotechnological products

ฉบบนเปนผลผลตของการจดการความรทกลนกรองและเรยบเรยงโดยบคลากรของสถาบน

ชววตถ ดวยความมงมนทจะเผยแพรองคความรและสรางการแลกเปลยนเรยนร ทงภายใน

สถาบนและเครอขายการควบคมคณภาพชววตถ

กรมวทยาศาสตรการแพทยหวงเปนอยางยงวาคมอการผลตและการควบคมคณภาพ

ชววตถชนด biotechnological products ทจดท�าขนน จะอ�านวยประโยชนแกผเกยวของ

สมตามเจตนารมยของคณะผจดท�าทกประการ

(นายแพทยสถาพร วงษเจรญ)

อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

�� bio_product.indd 3 8/5/2555 15:34:58

ค�ำน�ำ

ปจจบนเทคโนโลยดานการผลตยามความกาวหนาเปนอยางยงโดยมการประยกต

ใชเทคโนโลยชวภาพเพอใหไดยารกษาโรคชนด biotechnological products หรอ

biopharmaceuticalproductsซงเปนโปรตนและแอนตบอดทมความบรสทธสงและจ�าเพาะ

ตอโรคมากขน เปนผลตภณฑทโมเลกลซบซอนยากตอการวเคราะหหรอผลตใหไดตาม

มาตรฐานเหมอนกนทกครงสารตงตนของแตละรนการผลตอาจมความแตกตางและมโอกาส

ปนเปอนมากซงจะมผลตอความบรสทธของผลตภณฑการควบคมคณภาพ(qualitycontrol)

จงเปนมาตรการทก�าหนดขนเพอใหมนใจวาจะไมมผลตภณฑทคณภาพไมเปนไปตามมาตรฐาน

ออกสทองตลาด

อยางไรกตามเทคโนโลยการวเคราะหในปจจบนยงไมสามารถตรวจจบถงความ

ผดปกตไดทกกรณ ดงนนการตรวจวเคราะหคณภาพเฉพาะยาส�าเรจรปเพยงอยางเดยวจง

ไมสามารถใหความมนใจไดวายามคณภาพตามมาตรฐานทตองการ จ�าเปนตองวเคราะห

คณภาพของ biotechnological products ตงแตการคดเลอกสารตงตนและกระบวนการ

ผลตทไดออกแบบมาเปนอยางด(qualitybydesign)การวเคราะหความเสยงดานคณภาพ

(quality risk management) หากเกดความเปลยนแปลงแมเพยงเลกนอยในกระบวนการ

ผลตตองตดตามตรวจสอบวามผลเปลยนแปลงโมเลกลของโปรตนทเปนตวยาส�าคญกระทบ

ตอความปลอดภยและประสทธภาพของยาหรอไมอยางไร ดวยเหตนขอมลจาก drug

development, manufacturing process, process validation, in-process control,

stability และ batch consistency จงมความส�าคญเทากบการวเคราะหคณลกษณะของ

ยาและผลการตรวจวเคราะหเพอปลอยผานยาส�าเรจรป

ดงนนบคลากรของสถาบนชววตถผรบผดชอบเกยวกบการตรวจวเคราะหรบรอง

คณภาพทางหองปฏบตการและประเมนทะเบยนต�ารบยาของชววตถชนดbiotechnological

products เพอการขนทะเบยนจ�าหนายในประเทศจงตองมความรลกซงทงเทคโนโลย

การผลต เทคนคและเครองมอการตรวจวเคราะหทใชในปจจบน การจดการความรเรอง

�� bio_product.indd 4 8/5/2555 15:34:58

“การผลตและการควบคมคณภาพชววตถชนด Biotechnological Products” จงม

ความจ�าเปน ดงนนในป 2553 น สถาบนชววตถไดรวบรวมและเรยบเรยงความรทเปน

สาระส�าคญใหมเนอหากระชบและทนสมยเพอเปนเครองมออบรมบคลากรของสถาบนชววตถ

ใหสามารถบรณาการความรเพอประเมนต�ารบยาและวางแผนการตรวจวเคราะหคณภาพ

ทางหองปฏบตการไดอยางเหมาะสมตามมาตรฐานสากลและเทาเทยมกนทกต�ารบ และเปน

ประโยชนส�าหรบนกวชาการผผลตหรอบคลากรของบรษทผน�าเขาผลตภณฑเหลานซงจ�าเปน

ตองมความรความเขาใจเทคโนโลยการผลตและการตรวจวเคราะหเชนกนเพอใหสามารถจด

เตรยมเอกสารต�ารบยาเพอยนขอขนทะเบยนไดอยางเหมาะสม ซงจะชวยใหการประเมน

เอกสารต�ารบยาด�าเนนไปไดอยางรวดเรวดวยความรความเขาใจทตรงกน

นางธรนารถ จวะไพศาลพงศ

ผอ�านวยการสถาบนชววตถ

มถนายน 2554

�� bio_product.indd 5 8/5/2555 15:34:58

บทท 1 Drug Development 1

1. การเตรยมยนทสนใจ (Isolation of DNA) 1

1.1 การเตรยมยนจากดเอนเอ 1

1.2 การเตรยมยนจากmRNA 2

1.3 การเตรยมโดยวธ PCR 3

1.4 การสงเคราะหนวคลโอไทดดวยเครอง automate DNA synthesizer 3

2. การเตรยม Expression vector 3

3. Biological system 10

3.1 E. coli 10

3.2 Gram-positive bacteria 10

3.3 Lower eukaryotic cells 10

3.4 Mammalian cells 12

3.5 Insect cells-baculovirus system 12

4. Cell transformation 16

4.1 วธทางเคม (chemical treatment) 16

4.2 วธการใชกระแสไฟฟา (electroporation) 17

5. Selection and screening methods 18

5.1 Antibiotic sensitivity or resistance 18

5.2 Nutrient requirements 19

5.3 Blue-white selection 19

5.4 Pigment formation 19

6. Seed lot system 24

6.1 การเตรยมmaster cell bank 24

6.1.1 การเลอกเซลลทใหผลผลตมากทสด 25

6.1.2 การทดสอบหา stability gene expression 25

สำรบญ

หนำ

�� bio_product.indd 6 8/5/2555 15:34:58

6.1.3 การmodification cell 25

6.1.4 การเพมจ�านวนและเกบไวเปนmaster cell bank 25

6.2 การเตรยมworking cell bank 26

บทท 2 Industrial Production of Biotechnological Products 27

1. Upstream processing 27

1.1 การเตรยมวตถดบ 28

1.2 การเพมจ�านวนเซลล 28

1.3 การผลต 28

1.3.1 Batch fermentation 28

1.3.2 Continuous fermentation 28

1.3.3 Fed-batch fermentation 29

2. Downstream processing 32

2.1 Extraction and Isolation of Recombinant Protein 32

2.1.1 Cell harvesting 34

2.1.2 Cell disruption 34

2.1.3 Cell debris removal 37

2.1.4 Solubilization of inclusion body 37

2.1.5 Refolding of recombinant protein 42

2.2 Purification 43

2.2.1 Capture phase 44

2.2.2 Intermediate purification phase 45

2.2.3 Polishing phase 46

2.3 Formulation 47

2.4 Filling process 48

3. Process validation และ In-process control 48

สำรบญ

หนำ

�� bio_product.indd 7 8/5/2555 15:34:58

สำรบญ

หนำ

บทท 3 Viral Safety Evaluations of Biotechnological Products 49

1. Quality control of cell substrate 50

2. Viral clearance evaluation 50

3. In-process control and product testing 52

บทท 4 Protein Characterization and Quality Control 53

1. ความส�าคญของการควบคมคณภาพ 53

2. หวขอการตรวจวเคราะห 55

3. วธวเคราะห 59

4. ขอก�าหนดเฉพาะ 68

5. การศกษาความคงตว 68

เอกสำรอำงอง 71

�� bio_product.indd 8 8/5/2555 15:34:58

บทท 1 Drug Development

รปท 1 การเตรยม DNA จาก RNA 2

รปท 2 การตดของเอนไซมแบบสมมาตร 5

รปท 3 การตดของเอนไซมแบบไมสมมาตรและแบบสมมาตร 6

รปท 4 แสดงการท�างาน repressor element เมอ active repressor protein (สแดง)

จบบน operator (สเหลอง) ท�าใหขวาง RNA polymerase จนท�างานไมได

ดงนนจงไมมการแสดงออกของยน 7

รปท 5 เมอม inducer (substrate หรอสารเคม) สเขยว ไปจบกบโปรตน repressor

ท�าใหมรปรางเปลยนแปลงไปจนไมสามารถเกาะท operator ได ดงนน

RNA polymerase จงท�างาน 8

รปท 6 his-tag recombinant protein 9

รปท 7 แสดงความแตกตางต�าแหนงการสรางโปรตนใน

eukaryotic cells และ prokaryotic cells 11

รปท 8 (a) แสดง protein folding โดยโปรตน chaperone ในระหวางทยงม

กระบวนการ translation เพอปองกนโปรตนถกท�าลาย

และ (b) เกดขนใน endoplasmic reticulum 13

รปท 9 แสดง protein glycosylation 14

รปท 10 การเตมคารโบไฮเดรตแบบN-linkage และO-linkage 14

รปท 11 Cell transformation โดยวธทางเคม 17

รปท 12 Cell transformation โดยการใชกระแสไฟฟา 18

รปท 13 DNA probe แสดงการตรวจหายนทสนใจดวยเทคนค replica

และ hybridization 20

รปท 14 แสดงการตรวจหาโปรตนเทคนค antibody hybridization 21

สำรบญรป

หนำ

�� bio_product.indd 9 8/5/2555 15:34:58

รปท 15 แสดงการตดดเอนเอดวยเอนไซมสองชนดเมอแยกกนตด และเมอตดพรอมกน

ผลการตดดวยเอนไซม 1 และ 2 ไดดเอนเอจ�านวน 3 ชนและ 2 ชนตามล�าดบ

แตเมอตดดวยเอนไซม ทงสองชนดพบวาจะได ดเอนเอ จ�านวน 4 ชน 22

รปท 16 เทคนคการวเคราะห ดเอนเอดวย southern blot hybridization 23

รปท 17 การเพมจ�านวนดเอนเอดวยวธ PCR 24

รปท 18 การเตรยมworking cell bank 26

บทท 2 Industrial Production of Biotechnological Products

รปท 1 ตวอยางขนตอนการผลตในขนตอน upstream processing 27

รปท 2 ชนดของ fermentors 29

รปท 3 การเจรญของเซลลใน fermentors ทง 3 ชนด 29

รปท 4 microbial growth curve 30

รปท 5 ภาพตวอยางภายในถง fermentor แสดงเครองมอควบคม

และตรวจสอบสภาวะภายใน 31

รปท 6 ขนตอน การแยกสกด recombinant protein 33

รปท 7 หลกการกรอง ระบบ dead end (a) และ cross flow (b) 34

รปท 8 หลกการแตกเซลลดวยแรงขดส 35

รปท 9 หลกการแตกเซลลดวยความดนสง 36

รปท 10 หลกการท�าใหเซลลแตกดวยแรงกระแทกของของเหลว 36

รปท 11 อธบายลกษณะการเปลยนสภาพของโปรตนใน inclusion bodies 38

รปท 12 แสดงการมวนพบของโปรตนจากองคประกอบของโมเลกล 38

รปท 13 อธบายโครงสรางของโปรตนระดบตางๆ 41

รปท 14 แสดงใหเหนวาเมอเพมกระบวนการ purification ปรมาตรสารทไดจะยงนอยลง 43


หนำ

�� bio_product.indd 10 8/5/2555 15:34:58


หนำ

รปท 15 แสดงล�าดบขนตอนเตรยมโปรตนใหบรสทธ 44

รปท 16 แสดงการแยก fusion protein โดยม tag และการตดของ

เอนไซม protease ใน affinity chromatography 45

บทท 4 Protein Characterization and Quality Control

รปท 1 SEC-HPLC 60

รปท 2 (A) แสดงหลกการแยกสารเทคนค SEC-HPLC

(B) แสดงการแยกสารดวยเทคนค ion exchange-HPLC 60

รปท 4 SDS-PAGE 61

รปท 5 IEF 62

รปท 6 Capillary Electrophoresis 63

รปท 7 AminoAcid Sequencing 64

รปท 8 AminoAcid Sequencing 65

รปท 9 ELISA 66

รปท 10 ELISA แบบ competitive 66

�� bio_product.indd 11 8/5/2555 15:34:58

สำรบญตำรำง

หนำ

บทท 1 Drug Development

ตารางท 1 ชนดของเวคเตอรแบงตามขนาดของชนดเอนเอทแทรก 3

ตารางท 2 ตวอยางของ fusion system ในการเตรยม recombinant protein

ใหบรสทธ 9

ตารางท 3 ชนดของเซลลทใชในการผลต 15

ตารางท 4 แสดงความแตกตางและขอดขอเสยของเซลลชนดตางๆ 15

บทท 2 Industrial Production of Biotechnological Products

ตารางท 1 ตวอยาง strong denaturants 39

ตารางท 2 ตวอยาง in vitro refolding aids 40

ตารางท 3 แสดงการเปรยบเทยบเทคนคทใชใน chromatography

กบขนตอนตางๆในการ purification 46

บทท 4 Protein Characterization and Quality Control

ตารางท 1 แสดงตวอยางรายการวเคราะห drug substance 56

ตารางท 2 แสดงตวอยางรายการตรวจวเคราะห drug product 58

�� bio_product.indd 12 8/5/2555 15:34:58

1

Drug Development

การพฒนาผลตภณฑชววตถเพอการรกษาดวยวธ recombinant technology โดยใหสงมชวตผลต

โปรตนหรอดเอนเอทตองการ ประกอบดวยขนตอนตางๆ คอ

1. Isolation of DNA

2. Expression construct

3. Biological system

4. Cell transformation method

5. Selection and screening method

6. Seed lot system

1. การเตรยมยนทสนใจ (Isolation of DNA)

ชนสวนดเอนเอ คอ ดเอนเอทสนใจจะน�ามาใชในการผลตผลตภณฑทตองการ โดยเตรยมมาจากเซลล

ทมความบรสทธเพยงพอ หรอสงเคราะหขนเมอทราบล�าดบของนวคลโอไทด วธการเตรยมยนทสนใจ เปนการ

แยกยนซงสามารถผลตโปรตนทตองการ ม 4 วธคอ

1.1 การเตรยมยนจากดเอนเอ

เซลลทน�ามาสกดควรเปนเซลลทมาจากเนอเยอโดยตรงหรอทเลยงจากหองปฏบตการ โดยมหลกการ

และวธการคอ เรมจากท�าลายผนงเซลลดวยการบด การใชคลนเสยง (sonication) หรอเอนไซม จากนนก�าจด

ไขมนและโปรตนดวย detergent และ protease และแยกออกดวยการเตม phenol / chloroform ขนตอน

สดทายคอ ท�าดเอนเอใหบรสทธดวย absolute ethanol ดเอนเอทสกดไดจดเปนสารพนธกรรมทงหมดของ

เซลล (whole genome) ดงนนเพอจะหาเฉพาะยนทสนใจสามารถใชวธการจบคเบสอยางจ�าเพาะของดเอนเอ

(southern blot) หรอหาล�าดบนวคลโอไทดโดยวธ DNA sequencing การเตรยมดเอนเอโดยวธดงกลาวมกใช

ในงานวจยเพอหายนทงหมดของสงมชวต โดยผลงานวจยทพสจนวามดเอนเอของยนทสนใจ จะถกน�าไปใชใน

กระบวนการผลต recombinant DNA ตอไป

�� bio_product - Copy.indd 1 8/5/2555 15:35:55

2

1.2 การเตรยมยนจาก mRNA

เตรยมจาก mRNA ซงเกดจากการถอดรหส (transcription) แลวใชเอนไซม reverse

transcriptase เปลยนเปน cDNA ดงนนจะไดยนซงท�าหนาทสรางโปรตนทสนใจจรงๆ นอกจากน จาก cDNA

ทไดจะไมมสวนของ intron (พบเฉพาะใน eukaryote เปนดเอนเอทไมมการถอดรหส ซงจะถกเอาออกเมอสราง

อารเอนเอ) สามารถน�าเขาไปใชใน prokaryotic cell เพอผลต recombinant protein ทงนเนองจากใน

กระบวนการถอดรหสพนธกรรม (transcription) ของ prokaryotic cell ไมมขนตอน remove intron หรอ

การลบล�าดบเบสทไมไดใชในกระบวนการแปลรหส

หลกการเตรยม เรมจากสกด mRNA จากเซลลทมยนทสนใจ ได mRNA ซงมนวคลโอไทด A

หลายๆ ตว (poly-A tail) อยทปลาย 3’ เรมการสงเคราะห cDNA โดยน�า mRNA ทสกดไดเปนแมแบบ

(template) และออกแบบ primer ทประกอบดวยนวคลโอไทด T หลายๆ ตว (poly-T oligonucleotide

primer) ตอกบนวคลโอไทด 18-20 ตวแรกของยนทสนใจใชเอนไซม reverse transcriptase ในการสงเคราะห

ใน step แรกนจะได single stand DNA ท complementary กบ mRNA จากนนจะตด mRNA

ทงโดยเอนไซม RNaseA สวนของ single stand DNA ทเหลออยมคณสมบตเปน hydrophobic จง

มวนงอเกดโครงสรางเปนตะขอเรยกวา hairpin loop ซงต�าแหนงนเองทจะท�าหนาทเปน primer ใหเอนไซม

DNA polymerase สงเคราะห double strand DNA ขนตอนสดทายใชเอนไซม S1 nuclease ตดสวน

hairpin loop ไดเปนดเอนเอสายคส�าหรบน�าไปใชผลต recombinant DNA (รปท 1)

รปท 1 การเตรยม DNA จาก RNA


3

1.3 การเตรยมโดยวธ PCR

เปนการสงเคราะหนวคลโอไทดดวยเทคนค polymerase chain reaction สามารถใชสงเคราะห

นวคลโอไทดทเปนต�าแหนงตดของ endonuclease enzyme เพอตดตอยนเขาเวคเตอร

1.4 การสงเคราะหนวคลโอไทดดวยเครอง automate DNA synthesizer

ใชสงเคราะหนวคลโอไทดไดตามทตองการ เชน ต�าแหนง signal DNA gene

2. การเตรยม Expression vector

ดเอนเอพาหะ (vector) หมายถง สงทน�าชนสวนดเอนเอเขาสเซลล สามารถเตรยมไดจากพลาสมด

พลาสมด (plasmid) หมายถง extrachromosomal double stranded DNA พบในแบคทเรยม

ลกษณะเปนวงกลมสามารถเพมจ�านวนไดเอง (self replication) โดยปกตม origin of replication เพยงหนง

ต�าแหนง มขนาดประมาณ 2,000-100,000 basepairs เลกกวาโครโมโซมของเซลล จ�านวนทมอยใน

แตละเซลลแตกตางกนตามชนดของเซลลและพลาสมด มหนาทอนซงไมเกยวของกบการท�างานของโครโมโซม

ของเซลล บนพลาสมดมยนเพยงหนงหรอสองยน ซงมประโยชนตอการอยรอดของเซลล เชน ยนทตอตาน

ยาปฏชวนะหรอโลหะหนก หรอยนทชวยใหพลาสมดเขาสเซลลได

expression vector จะน�าชนสวนดเอนเอเขาสเซลล มการเพมจ�านวนและท�าใหเกดการแสดงออก

ของยนได เวคเตอรแตละชนดมคณสมบตแตกตางกน ปจจบนมใหเลอกซอมากมายแลวแตจดประสงคของ

การเอาไปใช รวมถงตองค�านงถงองคประกอบตางๆ ในเวคเตอร เชน ต�าแหนงการตดของ restriction enzyme

การแบงชนดของเวคเตอรสามารถแบงไดหลายแบบ เชน การแบงตามลกษณะการท�างานของเวคเตอรและ

ขนาดของชนดเอนเอ ดงแสดงในตารางท 1 หรออาจแบงตามวตถประสงคการใชงาน

ตารางท 1 ชนดของเวคเตอรแบงตามขนาดของชนดเอนเอทแทรก

ดเอนเอพาหะ (Vector) ลกษณะส�าคญ ขนาดดเอนเอทแทรก

Plasmid ดเอนเอสายค, วงกลม 2-3 kb

ไวรสของแบคทเรย (Bacteriophage) ดเอนเอสายตรง 20 kb

Cosmids เปนสวนผสมของ phage และ plasmid 45 kb

YAC

(Yeast Artificial Chromosomes)

โครโมโซมทสงเคราะหขน 1,000 kb

BAC

(Bacterial Artificial Chromosomes)

โครโมโซมทสงเคราะหขน 100-300 kb


4

ชนดของเวคเตอรแบงตามการใชงาน

1. เวคเตอรเพอการเพมจ�านวนยน (cloning of gene)

2. เวคเตอรเพอสรางโปรตน (expression vector) เชน ในเวคเตอรตองมต�าแหนง promoter

3. เวคเตอรเพอสรางโปรตนและท�าใหโปรตนบรสทธ (expression and purification vector)

เชน ในเวคเตอรตองมต�าแหนง promoter และ fusion gene (ยนทสรางโปรตนไวใชในขนตอนการท�าให

recombinant protein บรสทธ)

4. เวคเตอรทท�าใหโปรตนออกมาอยนอกเซลล เชน เวคเตอรมยนของ signal sequence for secretion

5. เวคเตอรทสามารถอาศยอยใน host ไดมากกวา 1 ชนด เรยกวา shuttle vector

การน�าเวคเตอรไปใชในงานทมวตถประสงคแตกตางกนท�าใหเวคเตอรมองคประกอบทแตกตางกน

องคประกอบส�าคญใน expression vector

1. Start codon, stop codon : เปนต�าแหนงทก�าหนดใหเรมและหยดการสรางโปรตน start codon

ไดแก AUG stop codon อาจพบได 3 แบบคอ TAA, TAG และ TGA แตพบ TAA มากกวา

2. Origin of replication : เปนจดเรมของการเพมจ�านวนพลาสมด (copy number) origin of

replication (ori) เปนจดเรมตนของการถายแบบตวเอง หรอเปนต�าแหนงเรมตนของการท�างานของยนเพอ

เพมจ�านวน หรอใหเกดการสรางโปรตนอาจม 1-2 ต�าแหนง โดยพลาสมดทม origin of replication หลาย

ต�าแหนงจะสามารถอยไดในเซลลหลายชนด และหากตดตอยนเขาไปในพลาสมดมากกวาหนงยน แตละยนตอง

มชนดของ origin of replication แตกตางกน (incompatibility) หากในเซลลมพลาสมดมากกวาหนงชนด

และม origin of replication เหมอนกนจะมพลาสมดเพยงชนดเดยวทสามารถอยไดในเซลล สวนอกชนดจะ

ถกท�าลายไป แตหากม origin of replication ตางกน กจะสามารถอยรวมในเซลลได

3. Selectable marker : เปนยน marker เพอใชเปนสงแสดงหรอพสจนวา เซลลหรอ clone นนม

เวคเตอรและยงคงอย (stable) สวนมากใชการคดเลอกโดยเลยงเซลลบนอาหารทไมเหมาะสมหรอเปนพษ

4. Multicloning site (MCS) : เปนต�าแหนงตดส�าหรบ restriction enzymes ประกอบดวยต�าแหนง

ตดของเอนไซมหลายๆ ตวเพอเลอกใชเอนไซม restriction endonuclease ไดหลายชนดในการแทรกยน

(insert gene)

เอนไซม restriction endonuclease เปนเอนไซมทพบในแบคทเรยเกยวของกบการตด

ชนสวนของดเอนเอ ในธรรมชาตมหนาทปองกนเซลลจากการตดเชอไวรส สามารถตดสายคดเอนเอ ทต�าแหนง

จ�าเพาะทมขนาดความยาวประมาณ 4-8 base pairs เอนไซมตางชนดจะตดไดชนสวนดเอนเอทแตกตางกน

เมอเอนไซมตรวจพบล�าดบนวคลโอไทดทจ�าเพาะจะเขาจบกบโมเลกลของดเอนเอและท�าลายแรงยดเหนยวของ

น�าตาลและฟอสเฟต ม 3 ชนด คอ


5

a. Type I เปนชนดทจดจ�าล�าดบจ�าเพาะแตตดแบบ random

b. Type II เปนชนดทจดจ�าต�าแหนงตดทเฉพาะเจาะจงและตดโดยไมตองใช ATP จงถกน�ามาใช

ในการสราง recombinant DNA

c. Type III มลกษณะก�ากงระหวางชนดท 1 และ 2

การเรยกชอเอนไซมใชระบบอกษรภาษาองกฤษสามตวแรกแทนชอของแบคทเรยทใชแยกได

โดยตวแรกเปนชอ จนส ใชตวพมพใหญ อกษรทสองและสามเปนชอ สปชส ใชตวพมพเลก ถามรหสสายพนธ

ใหเตมหลงอกษรสามตวแรก เลขโรมนระบถงล�าดบทของการสกดจากแบคทเรยนน

การตดของเอนไซมท�าใหเกดผลได 2 แบบ คอ

1. ไดปลายท (flush หรอ blunt end) จากการตดสายทงคแบบสมมาตร (รปท 2) เชน การตด

ดวยเอนไซม SmaI

รปท 2 การตดของเอนไซมแบบสมมาตร

(ทมา: http://education.hudsonalpha.org/)

2. ไดปลายเหนยว (sticky end หรอ cohesive end) จากการตดสายคแบบไมสมมาตร

(รปท 3) เชน การตดดวยเอนไซม EcoRI


6

รปท 3 การตดของเอนไซมแบบไมสมมาตรและแบบสมมาตร

(ทมา: http://openwetware.org/)

5. Promoter คอยนทกระตนใหเรมการอานรหสเพอสราง mRNA มกมต�าแหนงกอนถง ribosome

binding site ประมาณ 10-100 นวคลโอไทด ตองมลกษณะทงายตอการกระตนและ strong เพยงพอ

การควบคมการท�างานของโปรโมเตอรได 4 ระดบ คอ

a. Minimal promoter ล�าดบของนวคลโอไทดบนดเอนเอ ซงเปนสวนทจ�าเปนส�าหรบกระบวนการ

ลอกรหส (transcription) มกใชเมอตองการศกษาการท�างานของสวนควบคมยน (gene regulatory elements)

b. Constitutive promoter ท�าใหยนแสดงออกหรอท�างานแบบตอเนองตลอดเวลา

c. Cell-specific promoter ท�าใหยนแสดงออกตรงบรเวณทเฉพาะเจาะจง

d. Regulated promoter ใชเมอตองการใหการแสดงออกของยนเปนไปตามเวลาทตองการ


7

6. Operator เปนดเอนเอทอยถดจากโปรโมเตอรโดยท�างานรวมกนในการควบคมการแสดงออกของยน

ต�าแนง operator จะถกควบคมการท�างานโดย regulatory element

ตวอยาง regulatory element เชน repressor protein ยบยงการแสดงออกของยนโดย

ขดขวาง RNA polymerase ไมใหท�างาน (รปท 4) และยนจะมการแสดงออกกตอเมอ ม inducer มาจบ

repressor protein ท�าใหมรปรางเปลยนแปลงไปจนไมสามารถจบกบ operator อกตอไป (รปท 5)

รปท 4 แสดงการท�างาน repressor element เมอ active repressor protein (สแดง)

จบบน operator (สเหลอง) ท�าใหขวาง RNA polymerase จนท�างานไมได

ดงนนจงไมมการแสดงออกของยน


8

รปท 5 เมอม inducer (substrate หรอสารเคม) สเขยว ไปจบกบโปรตน repressor ท�าใหมรปราง

เปลยนแปลงไปจนไมสามารถเกาะท operator ได ดงนน RNA polymerase จงท�างาน

7. Ribosome binding site เปนกลมของนวคลโอไทดประมาณ 8-13 นวคลโอไทด อยกอนถง

start codon ดานหนา (upstream) ยน จ�าเปนตองมส�าหรบการเรมสรางโปรตน ใน prokaryote เรยก

shine-dalgarno sequence สวนใน eukaryote เปนบรเวณ methyl guanosine cap

8. Fusion protein สวนใหญ tags and fusion proteins เปนบรเวณบนพลาสมดทเพมเตมมา

เพอวตถประสงคตางๆ เชน การออกแบบใหม histidine amino acid หลายๆ ตว (รปท 6) ตอจากโปรตน

ทสรางขนไวใชในการท�าใหบรสทธในกระบวนการ downstream process หรอการออกแบบเพม signal

sequence เพอใหโปรตนทสรางแลวไปอยนอกเซลล ตวอยาง fusion protein ดงแสดงในตารางท 2

9. Enhancer เปนต�าแหนงดเอนเอ อยใกลกบโปรโมเตอรท�าหนาทชวยเพมความสามารถ การสรางโปรตน

เมอ enhancer ท�างานจะโคงงอเปน loop ไปกระตนโปรโมเตอร

10. N-Terminal amino acid การเตม amino acid เพอเพมความเสถยรของโปรตนทสรางขน

(increasing protein stability)


9

ตารางท 2 ตวอยางของ fusion system ในการเตรยม recombinant protein ใหบรสทธ

Fusion partner Size Ligand Elution condition

ZZ (fragment of Staphylococcus

aureus protein)

14 kDa IgG Low pH

Histidine tail 6-10 aa Ni2+ Imidazole

PinPoint (a protein fragment which

is biotinylated in vivo in E.coli)

13 kDa Streptavidin Biotin

MBP (maltose binding protein) 40 kDa Amylase Maltose

GST (glutathione S-transferase) 25 kDa Glutathione Reducing agent

Flag (a peptide recognized by

enterokinase)

8 aa Specific MAb Low calcium

ทมา: Adapt from Nygren et al. 1994, Trends Biotechnol. 12:184-188

รปท 6 his-tag recombinant protein


10

3. Biological system

เมอได expression construct แลวและตองการผลตผลจาก recombinant protein นนตองเลอก

เซลลเจาบาน (host) ใหเหมาะสมกบเวคเตอรเพอใหสามารถเพมจ�านวนและสรางโปรตนทตองการได โดยปกต

เมอจะสราง expression construct ตองค�านงถงชนดของเซลลทจะน�ามาใชพรอมกนไปดวย

cell system คอ การเลอกชนดของเซลลเพอผลต recombinant protein โดยจ�าเปนตองเลอกให

เหมาะสมกบเวคเตอร (host-vector system) และคณสมบตของโปรตนทตองการ

ชนดของเซลลเจาบาน (host)

3.1 E. coli

เปนเซลลทนยมน�ามาใชมากทสดในการผลตโปรตนทไมตองการกระบวนการ post-translational

modification ของโปรตนภายหลง เซลลนมขอดหลายอยาง คอ เปนเซลลทไดรบการศกษาวจยมาเปน

อยางดจงมขอมลดานพนธกรรมและสรรวทยามากเพยงพอทจะน�ามาใชทาง genetic manipulation งาย

ตอการเพาะเลยงใหไดผลผลตมาก เนองจากมอตราการเจรญสงสามารถใหความเขมขนของเซลลไดมากกวา

50 g dry weight/l

สามารถกระตนใหยนมการแสดงออกในอตราทสงเมอเลอกเวคเตอรและโปรโมเตอรใหเหมาะสม

ตนทนการผลตต�า เนองจาก E. coli เจรญไดในอาหารเลยงเซลลแบบธรรมดาราคาถก รวมทงตนทนของ

fermentation process ทต�า

อยางไรกตามมขอเสยทตองพจารณาคอ ไดปรมาณ recombinant protein นอย อาจเนองจาก

ถกสลายดวยเอนไซมหรอเกดการรวมตวเปน inclusion bodies ท�าใหสญเสยไปจ�านวนหนงจากความยงยาก

ในการแยกสกดและการท�าใหบรสทธภายหลง แตปจจบนมการแกไขดวยการใช fusion partner

3.2 Gram-positive bacteria

เชน Bacillus subtilis เปนเซลลทน�ามาใชมากนอกเหนอจาก E. coli เนองจากมขอดกวา

E. coli คอ สามารถผลตโปรตนออกมามากแตขณะเดยวกนมขอเสยคอ มการผลตเอนไซม protease มาก

ซงจะท�าลายโปรตนอยางรวดเรว ทงเวคเตอรและโปรโมเตอรทจะน�ามาใชกบเซลลชนดนมจ�ากดและพลาสมดใน

เซลลไมเสถยรเทากบใน E. coli

3.3 Lower eukaryotic cells

เชน ยสต แตมขอจ�ากดดาน protein processing เชน กระบวนการ glycosylation ดงนน

หากตองการผลผลตเปนโปรตนชนดทไมซบซอนมากนกสามารถเลอกใชยสตได การแยกเกบออกมาจาก

fermenter ท�าไดงายเนองจากเซลลมขนาดใหญกวาเซลลแบคทเรย นอกจากนยสตยงอยในรายการ genetic

material ของส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยาของสหรฐอเมรกา (US-FDA) ทมความปลอดภยเพยงพอ


11

ทจะน�ามาใช (Generally Regarded as Safe: GRAS) ขอจ�ากดของยสตคอ มระดบการแสดงออกของยนต�า

ม glycosylation สง และมความจ�ากดในการเลอกใช genetic system อนๆ

เซลลยสตเปนทสนใจทจะน�ามาผลต heterogenous protein ซงถกน�ามาใชตงแตป 1979 แทน

E. coli เนองจากมขอดกวา mammalian cells หลายประการ คอ ใหปรมาณ recombinant protein มาก

ในอาหารเลยงเซลล ได growth rate เพมเรว งายตอการขยายก�าลงการผลตโดยไมลดปรมาณผลผลต ควบคม

gene expression งาย ตนทนการผลตต�า ไมม endotoxin หรอ lytic virus และไมเปน human pathogenic

ตอคน

ยสตตวแรกทน�ามาใชคอ Saccharomyces cerevisiae น�ามาผลต interferon, hepatitis B

surface antigen เปนตน แตมขอเสยคอ ม high glycosylation จงมการคดเลอกตวใหม คอ Pichia gastoris,

Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica etc.

รปท 7 แสดงความแตกตางต�าแหนงการสรางโปรตนใน

eukaryotic cells และ prokaryotic cells


12

3.4 Mammalian cells

เซลลทน�ามาใชมากคอ Chinese Hamster Ovary (CHO) การเลอกใช mammalian cells

มกใหโปรตนทมองคประกอบสมบรณถกตองทงชนดของกรดอะมโนและ post-translational processing ขอด

ของเซลลชนดนในแงของ host-vector system มความเหมาะสม เนองจากโปรตนทไดสวนใหญจะอยนอกเซลล

และมคณภาพใกลเคยงกบทผลตจากธรรมชาต แตขอเสยคอ มตนทนการผลตสง เนองจากเซลลมการ

เจรญเตบโตชา ตายงาย อาหารเลยงเซลลมราคาแพง และมระดบการแสดงออกของยนต�า มการแบงตว

ไมบอยมากนอกจาก transformed cells ทเปน continuous cell lines ซงแบงตวไดไมจ�ากดเชน เซลลมะเรง

หากน�ามาใชตองระมดระวงเปนพเศษโดยเฉพาะในขนตอนการท�าใหบรสทธซงไมควรใหมการปนเปอนของ

nucleic acid ของเซลลเขามาในผลตภณฑ นอกจากนเวคเตอรทจะใชกบ mammalian cells อาจม primate

viruses ซงเปนอนตรายหากเวคเตอรเหลานนสามารถกลบมากอโรคในคนได โดยปกตยนในเวคเตอรเหลาน

ไมสามารถแสดงออกไดมากในเซลลปกต แตท�าไดโดยเลอกใชเวคเตอรชนด high copy number การเลยง

เซลลตองใชเวลานาน อาจมากถง 6 เดอนเพอใหยนท�างานอยางเตมท แตถาหากใชเซลลทเปน hybridoma

จะใหผลดกวา

เหตผลส�าคญในการเลอกใชเซลลสตวเนองจากคณภาพของโปรตนทผลตไดเหมอนกบโปรตนจาก

ธรรมชาตมากทสด แตภายหลงพบวาคณภาพของโปรตนเปลยนแปลงไปเนองจากสภาวะการเพาะเลยงเซลลท

เปลยนแปลงเมอเพมก�าลงการผลต และคณภาพของโปรตนอาจเปลยนแปลงตามชวงเวลาทเกบเซลลรวมทงการผลต

โปรตนปรมาณมากๆ อาจท�าใหเกดภาวะอมตวภายในเซลล มผลใหการปรบแตงโครงสรางของโปรตนไมสมบรณ

วธทน�ามาแกไขและลดปญหาเหลานไดแก

– การเลอกใชเซลลหรอ genetic materials ตางๆ จากเซลลทชวยลดการผลตเอนไซม sialidase

– เพมความสามารถดาน protein processing

– การปรบเปลยนองคประกอบของอาหารหรอการเตมสารเคมบางอยางทจะชวยลดการผลต

สารทไมตองการ เชน เอนไซมบางชนด

3.5 Insect cells-baculovirus system

โดยปกตแลวจะไมน�าเซลลแมลงมาใชในงานดานการตดตอยนแต baculovirus ซงเปนไวรสของ

เซลลแมลงกลบเปนทสนใจเนองจากไมกอใหเกดโรคทงในคนและแมลง และม strong promoter ส�าหรบควบคม

การสรางโปรตน ดงนนนกวจยจงสนใจทจะน�า insect cells-baculovirus system มาทดลองผลตโปรตนเพอ

การศกษา host-vector system นมความปลอดภยมากกวา mammal-retrovirus system มระดบการแสดงออก

ของยนสงสามารถใหผลตผลภายในเวลาไมถงหนงเดอน และม protein processing ใกลเคยงกบ mammalian

cells แมจะมความแตกตางกนอยบางกบขนตอนธรรมชาต


13

polypeptide ทไดจาก eukaryote จะมขนตอน modification, cleavage, protein folding

(รปท 8) และ glycosylation

รปท 8 (a) แสดง protein folding โดยโปรตน chaperone ในระหวางทยงมกระบวนการ

translation เพอปองกนโปรตนถกท�าลาย และ (b) เกดขนใน endoplasmic reticulum

Glycosylation คอกระบวนการเตมคารโบไฮเดรตในสายโพลเปปไทด (รปท 9) ม 2 แบบคอ

N-linkage คอการเตมคารโบไฮเดรตในต�าแหนง N ของกรดอะมโน asparagine สวน O-linkage คอ

การเตมคารโบไฮเดรตในต�าแหนง O ของกรดอะมโน Serine (รปท 10)


14

รปท 9 แสดง protein glycosylation

รปท 10 การเตมคารโบไฮเดรตแบบ N-linkage และ O-linkage


15

การเตมหมฟอสเฟตและน�าตาล (phosphorylation and glycosylation in post–translational

protein processing) หมายถงการเตมหมฟอสเฟตและน�าตาลเขาในสายโปรตนทเซลลผลตออกมาใหเหมาะกบ

การท�าหนาทของโปรตนนน หากแตกตางไปจากธรรมชาตจะมผลตอคณภาพของ recombinant protein

ตารางท 3 ชนดของเซลลทใชในการผลต

Type of cells Examples

Animal cells

Chinese Hamster Ovary cells

Hybridoma cells, Insect cells

Moulds Penicillium spp., Aspergillus spp.

Yeasts

Saccharomyces spp., Saccharomycopsis spp.

Candida spp.

Bacteria

E. coli, Bacillus spp.

Pseudomonas spp., Streptomyces spp.

ตารางท 4 แสดงความแตกตางและขอดขอเสยของเซลลชนดตางๆ

Items Animal cells Moulds Yeasts Bacteria

Growth rate * ** *** *****

Easy to genitically

Manipulate

** ** *** *****

Folds proteins **** ** **

Glycosylate proteins ****

Hardiness * **** **** ****

บทบาทของ glycosylation ทมตอกระบวนการเหลาน คอ

¾¾ การจดเรยงตวของโปรตน (protein folding)

¾¾ ความเสถยรของโครงสรางโปรตน (structure stability)

¾¾ ตวแปลงสญญาณเฉพาะ (specific signal transduction)

¾¾ ความสามารถในการสรางและคดหลงสารตางๆ (secretion)


16

บทบาทของ glycolipid / proteoglycan / glycoprotein มผลตอ

¾¾ สวนประกอบของผนงเซลล (cell wall component)

¾¾ การขนสงและการสอสารภายในเซลล (intracellular transport and communication)

บทบาทของ phosphorylation มผลตอ

¾¾ กระบวนการควบคมเซลล (cellular regulation process)

¾¾ การปรบเปลยนปฏกรยาของเอนไซม (modulation of enzyme activity)

¾¾ การเจรญของเซลล (cell growth)

¾¾ การควบคมการแสดงออกของยนและการสงเคราะหโปรตน (control of gene expression

and protein synthesis)

¾¾ การควบคมเมตาบอลซม (metabolic regulation)

¾¾ การควบคมตวแปลสญญาณ (signal regulation)

¾¾ การเกดเนองอก (tumor formation)

จะเหนไดวา phosphorylation และ glycosylation มความส�าคญมากตอหนาทและ activity

ของ recombinant protein เนองจากกระบวนการทงสองเกดใน eukaryotic cells ไมพบในแบคทเรยจงตอง

มการศกษาวจยและวางแผนใหเหมาะสมเพอใหไดผลตภณฑทมคณภาพตามตองการ ซงในการควบคมการเกด

ระดบ phosphorylation และ glycosylation ของ recombinant protein จ�าเปนตองเลอกชนดของ

expression system ทเหมาะสม

4. Cell transformation

Transformation เปนการน�าดเอนเอเขาสเซลลทพรอมจะรบดเอนเอภายนอก (competent cell) วธท

นยมใชม 2 วธ ดงน

4.1 วธทางเคม (chemical treatment)

โดยใชสารเคมประเภทไอออนบวกเพอใหผนงเซลลเปด (รปท 11) เชน แคลเซยมคลอไรด

สวนมากใชกบ E. coli ตวอยาง การเตรยม competent cells ดวย calcium chloride method

เตรยมเซลลระยะ early log phase แลวปนใหเซลลตกตะกอนทความเยน 4 องศาเซลเซยส ละลายเซลล

ในน�ายาแคลเซยมคลอไรดซงจะเพม permeability ของเซลลท�าใหไดเซลลทพรอมส�าหรบ transformation

เตมพลาสมดและแชตอในน�าแขง จากนนยายหลอดแชท 42 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท เตมอาหารเลยงเซลล

และอนท 37 องศาเซลเซยส 1 ชวโมงกอน spread บนอาหารเลยงเชอ selective medium


17

รปท 11 Cell transformation โดยวธทางเคม

4.2 วธการใชกระแสไฟฟา (electroporation)

เปนวธทท�าใหผนงเซลลเปดโดยใชกระแสไฟฟา (รปท 12) หลกการคอ น�าหลอดทมเซลลและ

พลาสมด ผานกระแสไฟฟา 25 microfarads 2.5 kilovolts และ 200 Ohm นาน 4.6 µs

ในการผลตตองการทจะใหเซลลรบ expression construct หนงอนตอหนงเซลล (เนองจาก

หากเซลลรบพลาสมดเขาไปหลายอนอาจเกดการแลกเปลยนชนสวนดเอนเอ ท�าใหไดสารทมคณสมบตตางไปจาก

ทตองการ) แตเปนการยากทจะควบคม


18

รปท 12 Cell transformation โดยการใชกระแสไฟฟา

5. Selection and screening methods

หลงจากเลยงเซลลไประยะหนงแลว ตองท�าการคดเลอกหาเซลลทม expression construct และ

ตรวจสอบวา expression constructs นนมชนสวนดเอนเอทตองการหรอไม พรอมทงตรวจยนยนวาเปน

sequence ทถกตองเพอจะไดน�าไปผลตตอไป

วธการคดเลอกเซลลทมเวคเตอรทตองการ ไดแก

5.1 Antibiotic sensitivity or resistance

อาศยยนซงมคณสมบตไวหรอดอตอยาปฏชวนะบนเวคเตอร เชน มยนทผลตเอนไซม beta-

lactamase ซงจะ hydrolyse ยาปฏชวนะกลม penicillin ได เซลลทมเวคเตอรนจะสามารถเจรญไดในอาหาร


19

ทมยาปฏชวนะน เซลลอนทไมมเวคเตอรดงกลาวจะไมสามารถเจรญได หรออกวธหนงทนยมใชเชนกนคอ ตดตอ

ยนเขาไปในต�าแหนงของยนทมคณสมบตดอตอยาปฏชวนะในขนตอนการสราง recombinant DNA ซงเปน

การท�าลายยนนนเปนผลใหเซลลทมเวคเตอรนนไมสามารถเจรญไดในอาหารทมยาปฏชวนะชนดนน เปนตน

5.2 Nutrient requirements

เปนการคดเลอกเซลลหรอโคโลนทตองการโดยใชความตองการสารอาหารเปน marker เชน

การมยนทสามารถสรางกรดอะมโน leucine บนเวคเตอรท�าให transformed cells เจรญไดในอาหารทไมม

กรดอะมโนชนดนแต non-transformed cells จะตายหมด

5.3 Blue-white selection

พลาสมดหลายชนดมยน lac z ทสรางเอนไซม β-galactosidase วธนเวคเตอรทเปน wild

type จะมยนซงเปลยน substrate คอ X-gal ไดเมดสฟาจงมองเหนโคโลนเปนสฟาขณะทเวคเตอรทสรางมา

ถกท�าลายยนนไปแลวจากการตดตอชนสวนดเอนเอ จงไมปรากฏเมดส จะเหนโคโลนเปนสขาว

5.4 Pigment formation

กรณน transformed cell มพลาสมดทมยนสราง green fluorescent protein (gfp) เปน

โคโลนสเขยวและเมอดดวยแสง UV จะเรองแสง

เมอคดเลอกไดเซลลทตองการแลวตองท�าการตรวจสอบเซลลทคดเลอกมา เพอยนยนวามชนสวนดเอนเอ

ทตองการอยจรง ดวยการแยกดเอนเอออกมาและวเคราะหทง phenotype และ genotype เพอดการ

เปลยนแปลงของ sequence ทอาจเกดขนดวย การตรวจสอบ phenotype ท�าไดหลายวธ เชน อาศย

specific enzyme activity หรอ immunological activity หรอจากการตรวจสอบดผลผลตจากยนนน

การตรวจสอบ genotype ของเซลลใชวธทาง nucleic acid techniques ตรวจสอบโครงสรางหรอ

ล�าดบนวคลโอไทดโดยวธทเหมาะสม เชน DNA sequencing หรอใช restriction enzymes และใช

electrophoresis วเคราะหขนาดชนสวนทถกตดและดความบรสทธ

การวเคราะหคณภาพดเอนเอ อารเอนเอ และ เซลล

ปจจบนสามารถวเคราะหคณภาพโปรตนไดหลายวธ และดวยเทคโนโลยทพฒนาอยางรวดเรว จงอาจม

เทคนคใหมๆมาพรอมกบยาชนดใหมทพฒนาเพอการรกษาโรคทมประสทธภาพมากขน

1. การตรวจหายนทสนใจ

1.1 DNA probe

การตรวจหายนทสนใจจาก cDNA library โดยใชหลกการ hybridization หรอการใชคณสมบต

เรองการจบคเบสอยางจ�าเพาะของดเอนเอ (G:C, A:T) วธท�าคอ ยาย recombinant clone ทขนบน


20

selective medium ไปท membrane เรยกวาเทคนค replica จากนนน�า membrane ทมเชอมาท�าใหเซลล

แตกและสายดเอนเอแยกออกจากกนดวยการเพม pH ของสารละลาย เตม DNA probe ทประกอบดวย

ชนสวนยนทสนใจและตดอยกบสารเรองแสงหรอสารรงส recombinant clone ทมยนทสนใจจะปรากฏสาร

เรองแสงหรอสารรงส (รปท 13)

รปท 13 DNA probe แสดงการตรวจหายนทสนใจดวยเทคนค replica และ hybridization

1.2 Protein probe

เปนอกวธของการหายนทสนใจ โดยหา recombinant clone ทมการ expression วธการคอ

ถายแบบโคโลนเชอทขนบน selective medium ลงบน membrane โดยวธ replica จากนน probe ดวย

primary antibody ทจ�าเพาะตอ expressed protein ขนสดทาย ใช secondary antibody ทตดดวย

สารรงส (radio label) หรอสารเรองแสง (fluorescence) เชอทม expression จะเหนสารรงสบนฟลม

เอกซเรยหรอเหนการเรองแสงดงรปท 14


21

รปท 14 แสดงการตรวจหาโปรตนเทคนค antibody hybridization

2. การตรวจหา recombinant clone

2.1 Gel electrophoresis

หลกการ เปนการแยกสารโดยอาศยกระแสไฟฟาพาโมเลกลซงมประจไฟฟาลบวงไปยงขวบวก

บนแผนเจลทเปน agarose ความแตกตางของขนาดและปรมาณประจของโมเลกลจะท�าใหการเคลอนทแตกตาง

กน โมเลกลทมขนาดใหญวงชากวาขนาดเลก หรอทมประจนอยจะวงชากวาหรออาจท�าใหประจของทกโมเลกล

เปนลบโดยการเตม detergent SDS แลวตดตามผลโดยแชแผนเจลในสารละลายของ ethidium bromide


22

(EtBr) ซงจะแทรกเขาไปตามชองของสายดเอนเอ ถายงมดเอนเอมากกยงมชองวางส�าหรบ EtBr มาก EtBr

จะเรองแสงเมอสองดวยแสง UV และเมอเทยบกบ control sample กจะทราบขนาดของตวอยางดเอนเอ

2.2 Restriction enzyme mapping

เปนการตดสายดเอนเอดวย restriction enzyme โดยจะตองทราบต�าแหนงทแนนอนและชนด

ของเอนไซมบนสายดเอนเอนนๆ หลงจากตดดวยเอนไซมจะไดดเอนเอสายสนๆ หลายชน จากนนน�ามาแยกดวย

วธ gel electrophoresis ซงจะเหนจ�านวนชนดเอนเอทไดเมอตดดวยเอนไซมแตละชนดโดยสมพนธกบขอมล

ต�าแหนง restriction enzyme บนดเอนเอ (รปท 15) เปนอกวธใชตรวจสอบยนยนความถกตองของ construct

vector

รปท 15 แสดงการตดดเอนเอดวยเอนไซมสองชนดเมอแยกกนตดและเมอตดพรอมกน

ผลการตดดวยเอนไซม 1 และ 2 ไดดเอนเอจ�านวน 3 ชนและ 2 ชนตามล�าดบ

แตเมอตดดวยเอนไซม ทงสองชนดพบวาจะได ดเอนเอ จ�านวน 4 ชน


23

2.3 Southern blot hybridization

หลกการ เปนการแยกดเอนเอโดย gel electrophoresis แลวท�าการถายซบดเอนเอจากเจล

ลงบนกระดาษ nitrocellulose (ซงท�าหนาทเปน solid support) และตรวจ sequence ดวย probe ซงเปน

single-stranded DNA fragment ทมความจ�าเพาะซง DNA fragment นตดฉลากเปน radioactive tag

ท�าใหมองเหนต�าแหนงทเขาจบกบตวอยางดเอนเอทเปน single-stranded DNA (รปท 16)

รปท 16 เทคนคการวเคราะห ดเอนเอดวย southern blot hybridization

2.4 DNA sequencing

หาล�าดบนวคลโอไทดดวยเครอง automated sequencing

2.5 PCR (Polymerase Chain Reaction)

เปนการสงเคราะหดเอนเอสายใหมจากสายตนแบบ ดวยเอนไซม DNA polymerase และ

primer 1 ค ปฏกรยาม 3 ขนตอน ประกอบดวย การแยกสายดเอนเอตนแบบใหเปนเสนเดยว (denaturing)

ทอณหภม 92-95 องศาเซลเซยส ขนตอนทสองลดอณหภมลงเปน 60-65 องศาเซลเซยส เพอให primer

จบคกบดเอนเอตนแบบ เรยกวา annealing ขนตอนท 3 เรยกวา extension เปนขนตอนการสงเคราะหดเอนเอ

สายใหมดวยเอนไซม DNA polymerase ทอณหภม 72-75 องศาเซลเซยส การเพมจ�านวนด�าเนนตอไป

อกหลายรอบ (cycle) จนไดสายดเอนเอจ�านวนมาก (รปท 17)


24

รปท 17 การเพมจ�านวนดเอนเอดวยวธ PCR

6. Seed lot system

เปนการเตรยม seed หรอ cell ทใชเปน cell bank โดยมขนตอนหลกสองขนตอนคอขนตอน

การเตรยม master cell bank และขนตอนการเตรยม working cell bank

6.1 การเตรยม master cell bank

เมอไดเซลลทตองการแลวจะตองน�าไปเลยง มการเพมจ�านวนใน well แลวดวา well ใดม

การผลตผลผลตมากทสดแลวน�ามาทดสอบหา stability gene expression จากนนจะมการ modification

cell ทไดตอไปอกเลกนอยจนไดเซลลทตองการแลวจงเพมจ�านวนและเกบไวเปน master cell bank


25

6.1.1 การเลอกเซลลทใหผลผลตมากทสด

เนองจากในการใสเวคเตอรเขาสเซลลนน เวคเตอรทเขาสเซลลอาจไมใชอตราสวน 1:1

ดงนนจงท�าใหผลตภณฑทไดออกมาไมเทากน เมอตองการใหไดผลตภณฑจ�านวนมากจงตองหาเซลลทไดรบ

เวคเตอรในอตราสวนทเหมาะสม เนองจากถาเซลลไดรบจ�านวนเวคเตอรมากเกนไปจะท�าใหเซลลเพมจ�านวนได

นอยลง

ในขนตอนนเปนการน�าเซลลทไดไปเลยงเพมจ�านวนใน well ตางๆ เพอดวาเซลลใน well

ใดมเวคเตอรทเหมาะสม แลวน�าแตละ well ไปทดสอบหาผลผลตทไดอาจใชวธในการวเคราะหทเหมาะสมกบ

ผลตภณฑ ตวอยางวธทใชในการทดสอบ เชน วธ ELISA test เนองจากเซลลทไดมจ�านวนไมมาก ซงวธนใช

ตวอยางในการวเคราะหในปรมาณนอย เมอไดผลการทดสอบแลวกเกบเปนขอมลโดยน�าเซลลทไดผลมากทสด

3-5 well แรกมาทดสอบตอไป แตอยางไรกตามเซลลใน well อนๆ กควรเกบไวเพอปองกนวา well ชดแรก

ทน�ามาทดสอบ stability gene expression ไมผาน

6.1.2 การทดสอบหา stability gene expression

เปนการทดสอบความคงตวของ gene expression เนองจากยนทเราใสลงไปในเซลลนน

ไมใชยนทเซลลนนมโดยธรรมชาต ในบางครงเซลลจะท�าลายยนทไดรบนนโดยอาจจะท�าลายทงเวคเตอร หรอ

ท�าลายเพยงบางยน ซงท�าใหผลผลตนอยลงเนองจากเวคเตอรทอยในเซลลมจ�านวนลดนอยลง ขนตอนนเปนการ

น�าเซลลทไดจากการทดสอบผลผลตมากทสดมาแบงเลยงโดยอาจเลยงไวในสภาพแวดลอมปกต หรอเลยงใน

selective media ทมความเขมขนสงขน โดยจะแสดงตวอยาง เชน ในกรณทเวคเตอรนนมระบบการคดเลอก

โดยยน DHFR ซงจะท�าใหเซลลสามารถเจรญไดในอาหารเลยงเซลลทม MTX อย โดยเพมความเขมขนของ

MTX จาก 0.01 µM ในการคดเลอกเซลลครงแรกเปน 0.1 µM และสดทายเปน 5 µM เพอดความคงตว

ของ gene expression ทใสลงไปใน เวคเตอร และผลผลตทได รวมทงความสมบรณของ vector วายง

คงเดมหรอไม ซงจะน�าเซลลทมความคงตวของ gene expression ไปใชในการผลตตอไป

6.1.3 การ modification cell

เมอไดเซลลทเหมาะสมแลวบางครงอาจมการ modification cell ทไดยกตวอยางเชน

อาจมการเปลยน media ทใชเลยงเซลลจาก selective media เปน seed media หรอมการเปลยนจากเดม

media ทใช PBS เปนไมใช PBS เพอลดการปนเปอนของสารกอโรคจากผลตภณฑทไดจากสตว

6.1.4 การเพมจ�านวนและเกบไวเปน master cell bank

เมอไดเซลลทตองการแลวกน�ามาเกบเปน master cell bank การเกบเซลลจะเกบตาม

หลกการเกบเซลลปกตโดยอาจเกบเซลลในสารละลาย DMSO แลวน�าไปลดอณหภมลงอยางชาๆ โดยอาจเกบ

ไวใน nitrogen tank โดยให vial อยเหนอสารละลายในถง เมอจะท�าการผลตกน�า working cell bank


26

มาท�าการเพมจ�านวน เมอไดจ�านวนมากพอแลวจงน�าไปใชในการผลตและควรแบงแยกเกบไวในสถานทมากกวา

2 สถานท เพอปองกนการผดพลาดซงอาจท�าให master cell bank ในสถานทนนเสยหาย

6.2 การเตรยม working cell bank

เนองจาก master cell bank มปรมาณไมมากจงตองน�า master cell bank มาเพมจ�านวน

เซลลเพอใชเปนเซลลเรมตนในการผลตดงรปท 18 สวนวธการเกบจะเหมอนกนกบ master cell bank

stock culture (0.5-1 ml) (master cell bank)

vial thaw in flask 25 ml

subculture in shake flask (200-1000 ml)

storage as working cell bank

รปท 18 การเตรยม working cell bank

กระบวนการ seed lot system น ตองมการควบคมคณภาพของเซลลทน�ามาใชในการผลต

โดยจะตองมการตรวจสอบในขนตอน host cell ทใช master cell bank, working cell bank และ

cell at or beyond the maximum หรอเซลลทมอายมากทสดนบตงแต master cell bank ทใชใน

การผลต วาเซลลในขนตอนดงกลาวมการเปลยนแปลงหรอมการปนเปอนหรอไม การทดสอบสวนใหญจะเปน

ไปตาม guideline มาตรฐานหรอตามต�ารายาสากล

ตวอยางการทดสอบไดแก การทดสอบ vector sequence, amino sequence ของ ผลตภณฑ

ทผลตได character ของ cell line จ�านวนเวคเตอรในเซลล และการทดสอบการปนเปอนของเชอรา

เชอแบคทเรยและเชอไวรส


27

Biotechnological Products

หลงจากการเตรยมได expression construct และ cell substrate ทเหมาะสมแลวสงทตองการ

ตอไปคอ การผลตโปรตนทตองการ โดยการเพมจ�านวนเซลลภายใตสภาวะทเหมาะสม กระบวนการเพาะเลยง

เพมจ�านวนเซลลเรยกวา fermentation หรอ bioprocessing เรมตนจากการพฒนาการผลตในหองปฏบตการ

จนไดวธทเหมาะสมแลว จงน�าไปสการเพมขนาดการผลต (scaled up) เปนระดบอตสาหกรรมเพอการคา

(industrial fermentation) กระบวนการผลตประกอบดวยขนตอนใหญ คอ upstream processing และ

downstream processing

1. Upstream processing

เปนขนตอนเกยวกบการเตรยมวตถดบ เชน อากาศ น�า อาหารเลยงเซลล growth factor ตลอดจน

ขนตอนส�าคญคอการเพมจ�านวนเซลลและการผลตสารทตองการซงเกดเปนไดทง aerobic และ anaerobic

แตโดยปกตวธ aerobic จะยงยากกวาเนองจากตองมระบบกระจายอากาศทเหมาะสม

stock culture (0.5-1 ml) (working cell bank)

vial Thaw in flask 25 ml

seed bioreactor (200 L) (working cell bank)

production in bioreactor (1,000 L)

harvest cells

รปท 1 ตวอยางขนตอนการผลตในขนตอน upstream processing

Industrial Production of


28

1.1 การเตรยมวตถดบ

วตถดบตองไมเพมการปนเปอนเขาไปในระบบการผลตหรอมการควบคมใหมการปนเปอนอย

ในเกณฑทยอมรบได เชน อากาศตองมการผาน HEPA filter สวนน�าทใชในการผลตตองมกระบวนการผลต

และมการทดสอบทยนยนไดวามคณภาพตรงตามเกณฑทจะใช เชน เปน water for injection (WFI) ตองม

ผลการตรวจสอบเพอยนยนคณภาพของวตถดบวาไมมการปนเปอนจากวตถดบทน�ามาใชในการผลต

สารประกอบทใชในการเตรยมอาหารเลยงเชลล โดยเฉพาะสารทไดจากสงมชวตตองมเอกสาร

ใบรบรองจากผจ�าหนาย แสดงคณภาพของสารเพอปองกนการปนเปอนสารกอโรคตางๆ รวมถงการควบคม

คณภาพสารเคมทใชในการผลตเชนกน

1.2 การเพมจ�านวนเซลล

เมอได working cell bank แลว น�าเซลลทไดมาเพมจ�านวนใหเพยงพอเพอใชในการผลตตอไป

โดยการเลยงเซลลและ passage cell ไปในภาชนะทมขนาดมากขนเรอยๆ จนเพยงพอตอการผลต

1.3 การผลต

ถงหมก (bioreactor หรอ fermentor) เปนหวใจส�าคญของกระบวนการผลต (bioprocessing/

fermentation) เพราะเปนอปกรณส�าคญส�าหรบเพาะเลยงเพมจ�านวนเซลล ตองมการออกแบบใหเหมาะสม

ตอการกวนผสมสาร การปรบคา pH และอณหภม ตลอดจนการเตมอากาศ ปจจบนมถงใหเลอกหลายแบบ

Fermentation มระบบการท�างานแบงเปน 3 หลกการ ดงรปท 2 และ 3 คอ

– Batch fermentation

– Continuous fermentation

– Fed-batch fermentation

1.3.1 Batch fermentation

เปนกระบวนการเพมจ�านวนเซลลและผลตเพยงหนงรอบการผลตหนงครง โดยในถงจะม

อาหารเลยงเซลลปรมาณหนง และเมอเสรจสนกระบวนการจงถายเกบสารตางๆออกมาแลวจงท�าความสะอาดถง

เพอเรมการผลตรอบใหมตอไป

1.3.2 Continuous fermentation

มระบบการเตมอาหารเขาในถงตลอดเวลา ขณะเดยวกนจะมการแยกเกบสารออกมา

อยางตอเนองโดยควบคมปรมาณเซลลภายในเพอไมใหจ�านวนเซลลลดลงเนองจากเซลลอาจหลดออกไปเมอมการ

ถายเกบสาร ขอดของวธนคอ สามารถลดขนาดของถง ลดคาใชจาย และไดโปรตนทมคณภาพเหมอนกนมากกวา

แตขอเสยกม เชน มโอกาสสญเสยพลาสมด จากการผลตเปนระยะเวลาตดตอกนยาวนาน รวมทงการรกษา

สภาพความปราศจากเชอท�าไดยากกวา และหากองคประกอบของอาหารเลยงเซลลแตกตางกนในแตละ batch


29

อาจมผลเปลยนแปลงการเจรญของเซลลและมผลตอปรมาณของโปรตนทตองการ

1.3.3 Fed-batch fermentation

เปนวธทนยมใชมากทสดในการผลตสารชวภาพตางๆ หลกการคอ มการเตมอาหารเขาไป

ในถงอยางตอเนองโดยไมมการแยกเกบสงใดออกมาระหวางกระบวนการเมอถงมปรมาตรสารเพมมากขนจนเตม

จงมการถายเทสารออกบางสวนหรอทงหมดแลวจงเรมกระบวนการใหม วธนจงเหมาะตอการผลตสารทเกดขน

ขณะทเซลลมอตราการเจรญต�าหรอเปนศนย ซงไมตองการอาหารมาก และเหมาะกบการผลตระดบอตสาหกรรม

รปท 2 ชนดของ fermentors

(ทมา: www.np.edu.sg/~dept-bio)

รปท 3 การเจรญของเซลลใน fermentors ทง 3 ชนด

(ทมา: www.gmu.edu/departments/biology/)


30

ปจจยทเกยวของและตองค�านงถง

1. Microbial growth kinetics

2. Maximizing fermentation efficiency

3. Bioreactors

เมอเลยงเซลลเจรญในถงหมกจะมลกษณะการเจรญแสดงเปนกราฟดงรปท 4

1. Lag phase เปนขนตอนแรกทเซลลเรมการเจรญอยางชาๆในสภาวะทก�าหนดให

2. Log หรอ Exponential phase เซลลมอตราการเจรญขนสงสด

3. Stationary phase ขนตอนนเซลลมอตราการเจรญเตบโตและอตราการตายเทากนท�าใหไมเหน

การเปลยนแปลงทางจ�านวน

4. Death phase เซลลมการเจรญลดลงหรอเรมหยดและอตราการตายของเซลลเพมขน

รปท 4 microbial growth curve


31

Microbial growth kinetics การทจะใหเซลลมการเจรญเตมทตองมวธการเลยงอยาง

เหมาะสมซงแตกตางจากการเลยงในหลอดทดลอง ตองศกษาชวงเวลาหรอขนตอนทจะสามารถเกบเซลล

(cells harvesting) หลงจากเซลลมการเจรญเตบโตไประยะเวลาหนงซงขนอยกบชนดของผลผลตทตองการ

เชน ถาเปนโปรตนจะเกบเซลลทปลาย log (2) ถาเปนการผลตยาปฏชวนะมกเกบเซลลในขน stationary (3)

Maximizing fermentation efficiency ปจจยทมผลตอประสทธภาพสงสดของ fermentation

ไดแก

• pH

• อณหภม

• อตราการผสม

• ลกษณะการผสม

• ปรมาณกาซออกซเจนทตองการ

จงตองมการศกษาและควบคมเปนอยางดเพราะเซลลแตละชนดตองการสภาวะแตกตางกน

(รปท 5)

รปท 5 ภาพตวอยางภายในถง fermentor แสดงเครองมอควบคมและตรวจสอบสภาวะภายใน

(ทมา: http://cwx.prenhall.com)


32

2. Downstream processing

เปนขนตอนการแยกเกบสารทผลตไดหลงกระบวนการหมกและน�ามาท�าใหบรสทธจนเปนผลตภณฑ

ส�าเรจรป

เทคนคทวไปทใชในการแยกสกดโปรตนและการท�าใหบรสทธ

• Dialysis เปนวธใชก�าจดสารโมเลกลเลก เชน เกลอชนดตางๆ หรอโปรตนอนๆ โดยอาศย

การซมผานถงซงเปน semi-permeable membrane ของโมเลกลเลก (< 50 daltons)

ออกคงเหลอสารทมขนาดใหญกวาอยภายใน

• Centrifugation ดวยความแตกตางของน�าหนก รปราง ความหนาแนนของโปรตน และ

ความหนาแนนของสารละลายท�าใหสารตางๆ แยกออกจากกนเมอปนทความเรวทเหมาะสมท�าให

ไดสารละลายทใสขนเหมาะส�าหรบการท�าใหบรสทธตอไป

• Zone centrifugation เปนการปนแยกในสารละลายทเปน gradient

• Sedimentation equilibrium เปนการแยกโดยอาศย continuous gradient

• Filtration ตองเลอกใหเหมาะสมทงการกรองธรรมดา และกรองเพอก�าจดไวรส

• Chromatographic techniques ใชส�าหรบการเตรยมสารเพอน�าเขาสขนตอนอนตอไป และใช

แยกสกดสารรวมถงการท�าสารใหบรสทธโดยเลอกวสดอปกรณใหเหมาะสมโดยพจารณาถง

ลกษณะทางกายภาพ ทางเคม และทางชวเคมของโปรตนทตองการ แบงเปนหลายวธ คอ

– Affinity chromatography

– Ion exchange chromatography

– Hydrophobic interaction chromatography

– Gel filtration

– Reverse phase chromatography

ขนตอนของ Downstream processing

2.1 Extraction and Isolation of Recombinant Protein

หลงจากเลยงเซลลไปไดในระยะเวลาหนงเซลลจะท�าการสรางโปรตนออกมา แบงผลตภณฑทได

เปน 2 ชนดคอ extracellular product และ intracellular product

Extracellular product คอ โปรตนทสรางในเซลลแลวจะถกขบออกมานอกเซลลท�าใหการแยก

สกดท�าไดงาย


33

Intracellular product คอ โปรตนทถกสรางมาแลวและน�าไปเกบอยท periplasm ซงเปน

ชองวางระหวาง cell wall และ cell membrane หรออยใน vacuole บรเวณ cytoplasm ซงจะน�า

ออกมาไดยากกวา extracellular product

โปรตนทไดจากการผลตนนม 2 ชนด คอ soluble protein หรอ insoluble protein พบวาม

เซลลหลายชนดทใหโปรตนในสภาพ insoluble aggregates เรยกวา inclusion bodies (IBs) ซงเปนโปรตน

ทไม active เนองจากมโครงสรางไมเปนสภาพธรรมชาต อาจพบเปนลกษณะ dimers หรอ multimers อยางไร

กตามโปรตนทเกดเปน IBs มขอด คอ

• เปนการรวมตวของโปรตนจ�านวนมากทเซลลผลตออกมา (50% หรอมากกวา)

• โปรตนสวนใหญใน IBs เปนโปรตนทเกดจาก over expression ของพลาสมด

• รปแบบของ IBs ชวยปกปองโปรตนไมใหถกท�าลายดวยเอนไซม protease

• รปแบบของ IBs ชวยปกปองเซลลจากความเปนพษของ recombinant protein

ทผลตมาจ�านวนมาก

การแยกสกดโปรตนทไดจากการผลต โดยทวไปประกอบดวยขนตอนดงรปท 6

cell harvesting

cell disruption

cell debris removal

solubilization of inclusion bodies

refolding of recombinant protein

รปท 6 ขนตอน การแยกสกด recombinant protein


34

2.1.1 Cell harvesting

เปนขนตอนการเกบผลตภณฑของ extracellular product หรอแยกเกบเซลลออกจาก

ของเหลวในถง เทคนคทนยมใชในการ harvest เซลล เชน การปนแยก และการกรอง

การปนแยก เปนการแยกสารโดยใชหลกการของสนามแรงหมนเหวยง ความสามารถใน

การแยกดวยวธนขนอยกบขนาดอนภาค ความแตกตางของความหนาแนน รวมทงความหนดของสารละลาย

โดยการปนแยกความเรวสง (high speed semicontinuous centrifugation) เหมาะกบการผลตระดบ

หองปฏบตการ หากเปนการผลตทมปรมาตรมากวธนมความยงยาก

การกรองอาศยความแตกตางของขนาดของโมเลกล มใหเลอกหลายแบบ เชน dead end

หรอ cross flow ดงรปท 7

รปท 7 หลกการกรอง ระบบ dead end (a) และ cross flow (b)

(ทมา: http://www.memos-filtration.de)

หากความหนาแนนของสารไมแตกตางกนมากอาจใหผลไมดเทาทควร การเลอกใชการปน

จะใหผลดกวา อยางไรกตามมปจจยหลายอยางทมผลตอการเลอกวธ ไดแก ชนดของอาหารเลยงเซลล ขนาด

ของเซลล ระดบขนาดของการผลต ตลอดจนเงนทน

2.1.2 Cell disruption

เปนขนตอนทใชส�าหรบ intracellular product โดยเปนการท�าลาย cell เพอใหได

ผลตภณฑออกมาจากเซลล ซงมหลายวธขนอยกบต�าแหนงการเกบโปรตนและชนดของเซลล รวมถงลกษณะ

ของผนงเซลล แตไมวาจะใชวธใดกควรเปนวธทมประสทธภาพและไมเปนการกระท�าทรนแรงตอเซลลมากเกนไป


35

เพอใหโปรตนยงคงสภาพได

Cell disruption methods แบงเปน 3 วธ ดงน

Chemical methods: ไดแก การใช alkali, detergents หรอ organic solvents

เชน acetone, alcohol ซงสามารถใชไดกบโปรตนทอยระหวางผนงเซลล และ cytoplasmic membrane

การใช organic solvent ชวยใหสารทเกบไดมสารปนเปอนนอยแตตองระวงเรองความปลอดภยในการใช

organic solvent

Biological methods: เปนการใชเอนไซมทเหมาะสมกบชนดขององคประกอบของ

ผนงเซลล (enzymatic lysis) เปนวธทเหมาะกบการผลตระดบ laboratory scale แตขอเสยคอการเตม

เอนไซมลงไปเปนการเพมสารปนเปอนและท�าใหตองก�าจดออกในกระบวนการท�าใหบรสทธอกดวย

Physical methods: แบงเปน

• แบบ non-mechanical methods การแตกเซลลดวย non-mechanical methods

เชน freeze-thaw cycles และ osmotic shock ซง osmotic shock จะใหผลผลต

ต�ากวาการแตกเซลลดวยวธ homogenization

• แบบ mechanical methods หรอ วธกล เชน

– Sonication ซงเปน high pressure sound wave เหมาะกบงานทมปรมาตร

สารนอยๆ

– Wet-milling (รปท 8) โดยน�าเซลลมาผสมรวมกบ glass beads ขนาดเลกกวา

1 mm ใน mill chamber เมอกวนสวนผสมภายในท�าใหเกดแรงขดสและท�าใหเซลลแตก วธนเหมาะกบเซลล

หลายชนด และเหมาะกบการผลตปรมาณมากหรอมความเขมขนของเซลลมาก

รปท 8 หลกการแตกเซลลดวยแรงขดส


36

– High-pressure homogenization (รปท 9) เซลลจะถกปลอยเขาไปใน

chamber พรอมกบอดแรงดนเขาไปและลดแรงดนอยางรวดเรวท�าใหเซลลแตก วธนเหมาะกบงานทมปรมาตร

สารไมมาก

รปท 9 หลกการแตกเซลลดวยความดนสง

– Impingement (รปท 10) เซลลถกปมใหไหลเขาไปในทอสองดานดวยความเรวสง

และกระทบกนทจดหนง ซงจะเกดเปนแรงกระแทกท�าใหเซลลแตก วธนเหมาะกบสารทมปรมาตรมากๆ

รปท 10 หลกการท�าใหเซลลแตกดวยแรงกระแทกของของเหลว


37

สงทควรพจารณาในขนตอนการแตกเซลลคอ การเพม protease activity และการ

กลบคนการละลายของโปรตน (resolubilization of inclusion body protein) เพราะปจจยทงสองจะท�าให

ปรมาณของสารทตองการ (yield) ลดลง ดงนนควรเลอกใชบฟเฟอรทเหมาะสมเพอรกษา pH และ ionic

strength ของอาหารเลยงเซลล การแตกเซลลตองท�าอยางรวดเรวในอณหภมทเหมาะสม อาจมการเตมสาร

อน เชน protease inhibitor, sucrose หรอ maltose เพอเปน stabilizer ของ lysosomal membrane

และเพอลดการปลอยเอนไซม protease ทงนตองค�านงถงปรมาณทเตมลงไปดวยเนองจากตองมการก�าจด

ออกภายหลงจงควรเตมปรมาณนอย หากมปรมาณมากอาจท�าใหใชเวลาในการท�าใหบรสทธนานเกน

นอกจากนวธการสกดโปรตนจะได mixture ทมสวนประกอบตางๆ ของเซลลปนอย

เชน nucleic acid ท�าใหเกดความหนด ซงสามารถก�าจดออกได

2.1.3 Cell debris removal

หลงจากการแตกเซลลแลวตองก�าจดเศษชนสวนของเซลลออกจากโปรตนทตองการ ซง

ตองพยายามใหเซลลแตกใหมากทสด เนองจากหากเซลลแตกไมสมบรณจะท�าใหตกตะกอนรวมกบ inclusion

body แลวแยกทงโดยการปนแยกหรอการกรอง ความยงยากทมกเกดขนคอการทมเศษชนสวนขนาดเลก และ

การอดตวกนแนนหรอความหนดขนของสารทกรองได การเลอกใช aqueous polymer liquid-liquid two

phase ซงม polyethylene glycol (PEG) เปนสวนหนงและมโพลเมอร เชน dextran หรอเกลอเชน

potassium phosphate อกสวนหนง ซงจะไดโปรตนอยในสวนบนซงเปน PEG phase และเศษของเซลล

จะอยในสวนลางสามารถแยกออกไดโดยการปน หากตดฉลาก PEG ดวย ligands ทเหมาะสมกจะเปนวธการ

แยกแบบ affinity partitioning

2.1.4 Solubilization of inclusion body

เปนขนตอนทใชในการการคลายตวของ IBs มวธดงน

– isolation of inclusion bodies: เนองจาก IBs มความหนาแนนสงดงนน

จงสามารถปนดวยความเรวต�า เชน 5,000-12,000 g แยกออกมาได หลงจากปนแลวลางตะกอนดวยบฟเฟอร

ทมสวนผสมของ chaotropic agents เชน 0.5-1 M quanidine-HCl หรอ urea หรอใชสารจ�าพวก

detergents เชน 1% Triton X 100 หรอ 1 mg/ml sodium deoxycholate เปนตน ซงเปนขนตอนท

ส�าคญทจะชวยก�าจดสงปนเปอนโดยเฉพาะเอนไซม protease และโปรตนปนเปอนสวนทละลายน�าไดออกมา

(รปท 11 และ รปท 12)


38

รปท 11 อธบายลกษณะการเปลยนสภาพของโปรตนใน inclusion bodies

(ทมา: www.pharmaceutical-technology.com)

รปท 12 แสดงการมวนพบของโปรตนจากองคประกอบของโมเลกล


39

– solubilization of aggregated protein: เมอแยกโปรตนออกจาก IBs แลว

ตองท�าใหอยในสภาพทละลายน�าไดโดยใชสารเคมท�าลายสภาพธรรมชาตและใหกลบคนสภาพเดม (denaturation

and re-folding) น�าโปรตนทลางแลวมา resuspend และ incubate ในบฟเฟอรทม strong denaturant

(ตารางท 1) และ reducing agent เชน DTT beta-mercaptoethanol ซงจะชวยรกษาสภาพ cysteine

ใหอยในสภาพ reduced form และท�าลาย disulfide bonds ทเกดจากการตกตะกอน อณหภมทมกใชใน

ขนตอนนคอ 30 องศาเซลเซยส ซงชวยใหเกดการละลายดขน หลงการละลายแลวน�าไปปนเพอก�าจดตะกอน

อนๆทยงเหลออยซงจะมผลรบกวน refolding ภายหลง (ตารางท 2)

ตารางท 1 ตวอยาง strong denaturants

Denaturant Typical concentration for use Range

Urea 8 M 2-8 M

Quanidine hydrochloride 6 M 3-8 M

Sarkosyl (N-lauroylsarcosine) 2%

Triton X 100 2% + 1.5% -

N-acetyl trimethylammonium chloride 5%

N-octylglucoside 2% -

Sodium dodecyl sulphate 0.1% 0.1-0.5%

Alkaline pH Above pH 9 (NaOH) -


40

ตารางท 2 ตวอยาง in vitro refolding aids

Additives Typical concentration for use

Chaotropic agents

Quanidine-HCl 1

Urea 4

L-arginine 0.5

Salts

Amonium sulphate 1

Sugars

N-acethyglucosamine 1

Glucose 1

Glycerol 10-50%

Detergent and surfactant

Tween -

SDS -

Polyethylene glycol 10-100uM

Short chain alcohol

N-pentanol 1-10 Mm

N-hexanol 10 uM-10mM

Cyclohexanol 1 uM-10 mM


41

รปท 13 อธบายโครงสรางของโปรตนระดบตางๆ

(ทมา: http://www.contexo.info)


42

2.1.5 Refolding of recombinant protein

ขนตอนนเรมตนดวยการก�าจด denaturant ประสทธภาพของ refolding ขนอยกบการ

เกดการแขงขนทจะเกด refolding และ aggregation จงตองพยายามลดการเกด aggregation โดยควบคม

ความเขมขนของโปรตนไมใหสงเกนไปใหอยในชวง 10-100 mcg/ml และโปรตนแตละชนดมสภาวะทเหมาะสม

ตอการเกด refolding ตางกน จงตองศกษาปจจยทแตกตางกน ไดแก

• องคประกอบของบฟเฟอร (pH ionic strength)

• อณหภม

• additives อนๆ

หากโปรตนม disulfide bonds ตองเตม thiol reagent เชน reduced และ oxidized

glutathione หรอ cysteine และ cysteamine เพอใหไดแรงยดเหนยวนกลบคนมา

วธการอนทใช refolding โปรตน

– Dialysis: เปนวธทใชมากวธหนง

– Slow dilution: เปนการท�าให solubilizing agent เจอจางลง ท�าใหโปรตน

กลบคนสภาพสงทตองระวงคอการเกด rapid dilution ขณะท�า dialysis และ slow dilution เมอโปรตน

เรมกลบคนสภาพเดมจะมโอกาสเกด aggregate ไดงายตองปองกนโดยการเตม mild solubilizing agent

ลงใน refolding agent

– Pulse renaturation: เพอควบคมโปรตนทจะคนสภาพใหมความเขมขนต�าซงจะ

ชวยไมให aggregate มวธปฏบตคอ เตมโปรตนลงไปในระบบเปนระยะๆใหไดความเขมขนทเหมาะสมจนเกด

refolding จนหมด

– Chromatography: เปนการก�าจด solubilizing agent วธหนงโดยเลอกชนด

ของ column ใหเหมาะสม เชน size exclusion chromatography ion exchange chromatography,

affinity chromatography เปนตน ซง denaturant จะถกก�าจดไปขณะทโปรตนเคลอนตวผาน column อยาง

ชาๆหรอจบกบ matrix ภายใน column วธนชวยใหไดโปรตนปรมาณมากแมความเขมขนของโปรตนจะสงระดบ

mg/ml ดงนนจงสามารถใชวธ chromatography หลงการ solubilized โปรตน กอนทจะท�า refolding ได

เนองจากปจจบนเรซนทบรรจใน column สามารถทนทานตอสารและสภาวะ solubilization

กระบวนการ glycosylation คอการเตมน�าตาลเขาไปในโปรตน เปน glycoproteins

ซงกระบวนการดงกลาวจะเกดขนภายในเซลล การผลตจะตองใชเซลลยคารโอตเทานน กระบวนการดงกลาว

ไมสามารถเกดขนไดในเซลลโปรคารโอต ดงนนถาผลตภณฑทตองการเปนกลม glycoproteins ตองออกแบบ

เซลลทใชเปนเซลลยคารโอต


43

นอกจากนอาจมการท�า fractional precipitation ซงเปนการท�าสารใหเขมขนขน สาร

ทใชตกตะกอน ไดแก เกลอชนดตางๆ (ammonium sulphate, sodium sulphate) ethanol acetone และ

polyethylene glycol ขนแรกโปรตนขนาดใหญจะถกตกตะกอนออกมากอน โปรตนทตองการจะตกตะกอนใน

ขนตอนตอไป และก�าจดเกลอหรอ alcohol ออกโดย gel filtration หรอ diafiltration

2.2 Purification

เปนการท�าโปรตนทผลตไดใหบรสทธมากขน แตถามขนตอนมากขนปรมาณสารทไดจะนอยลง

จงจ�าเปนตองควบคมกระบวนการใหนอยทสด แตเหมาะสมทท�าใหสารบรสทธ ซงสามารถแบงไดเปน 3 phase

ดงรปท 14

รปท 14 แสดงใหเหนวาเมอเพมกระบวนการ purification ปรมาตรสารทไดจะยงนอยลง


44

2.2.1 Capture phase

เปนขนตอนทเพมความเขมขนของสารใหมากขนลดปรมาตรลง โดยวธการขนกบการ

ออกแบบสารทได เชนถาออกแบบใหสารทไดม tag ในขนตอนนสามารถใช affinity chromatography ไดโดย

การออกแบบสารทตดกบ stationary phase ใหเปนสารทสามารถจบกบผลตภณฑได เชน เปน anti-body

ของผลตภณฑหรอเปน receptor ของผลตภณฑ ตวอยางเชน การเลอกใช gene fusion system ชวยให

นกวทยาศาสตรแยกโปรตนออกมาไดโดยวธทงายและสะดวก โดย affinity chromatography ดงรปท 15

และรปท 16

รปท 15 แสดงล�าดบขนตอนเตรยมโปรตนใหบรสทธ


45

รปท 16 แสดงการแยก fusion protein โดยม tag และการตดของ เอนไซม protease

ใน affinity chromatography

(ทมา: http://escience.ws/)

นอกจากนอาจใชคณสมบตทางกายภาพของผลตภณฑเชน ion exchange chroma-

tography แตถาใช ion exchange chromatography สารทไดจะตองมการ clarification เชนการ

desalting กอนเขาส phase ตอไป

2.2.2 Intermediate purification phase

เปนขนตอนหลกในการใช remove impurity เชน การลดระดบ pH เพอก�าจด virus

กรองผาน ultra-filtration membranes มใหเลอกหลายขนาด และหลายแบบเปนการก�าจดเกลอและโมเลกล

เลกๆออกจากโปรตนไดอยางมประสทธภาพ อาจตองใชการกรองแบบปราศจากเชอ เนองจากกระบวนการท�าให

สะอาดปราศจากเชอไมสามารถใชความรอนไดเพราะจะท�าใหโปรตนเสยสภาพ

เทคนค chromatography ทนยมใชในขนตอนน ไดแก ion exchange chromatography

ซงเปนการแยกสารโดยใชสมบตความเปนประจของสารเปนตวแยก และ hydrophobic interaction


46

chromatography ซงเปนการแยกสารโดยใชสมบตความไมมขวของสารโดยแตกตางจาก reversed phase

chromatography ท�าใหโปรตนเสยสภาพนอยกวาในการชะสารออกจาก column นอกจากนนอาจสามารถใช

affinity chromatography ในขนตอนนได

2.2.3 Polishing phase

เปนการก�าจดสงปนเปอนทอาจหลงเหลออย และเปนขนตอนในการปรบ pH เพอความ

คงตวของผลตภณฑ ตวอยางวธทใชในขนตอนนไดแก ion exchange chromatography ซงสารทไดจะตอง

ท�าการ desalting อาจท�าโดย gel filtration chromatography เปนการแยกสารโดยอาศยขนาดโมเลกลของ

สารเปนตวแยก แตวธนสารทไดจะมความเขมขนนอยลงเนองจากใชปรมาณสารชะสงแสดงตวอยางในตารางท 3

เมอไดสารทตองการแลว บางผลตภณฑอาจเปลยนแปลงสารทไดเพอเพมการท�างานของ

สารใหมประสทธภาพสงขน ตวอยางเชน การเตมหม PEG หรอเรยกวาขนตอนการท�า PEGylation เพอให

สารออกฤทธไดดขน ซงสารทไดตองน�ามาท�าใหบรสทธขนอกครงอาจโดยวธการกรอง การหมนเหวยงหรอ

การผาน chromatography

สารทไดจากขนตอนนถาน�าไปเกบไวจะเรยกวา drug substance

ตารางท 3 แสดงการเปรยบเทยบเทคนคทใชใน chromatography กบขนตอนตางๆในการ purification

*IEX-Ion Exchange Chromatography, HIC-Hydrophobic Interaction Chromatography,

AC-Affinity Chromatography, GF-Gel Filtration Chromatography,

RPC-Revered Phase Chromatography


47

2.3 Formulation

เปนการเขาสตรต�ารบ เนองจากโมเลกลของ biotechnological products อาจไมเสถยรจาก

กระบวนการผลตตามคณลกษณะของยาทไวตอสงแวดลอม เชน อณหภมทเปลยนแปลง oxidation แสง

ionic content และปฏกรยาทางเคมหลายชนด เชน deamination, oxidation, proteolysis, disulfide exchange

และ racemization ซงเกดขนระหวางการท�าใหบรสทธ (post-translation) อาจมผลใหโมเลกลโปรตนไมเสถยร

การแกไข เชน การใชสาร polyethylene glycol หรอโมเลกลไขมนชนดอน

ซงการตรวจสอบสภาพความคงตวของยาท�าไดยาก ตองใชหลายวธรวมกนเพอวเคราะหปจจยตางๆ

ทเกยวของ เชน การเสยสภาพ การเกาะบนผว การจบตวกนของโมเลกลยา การตกตะกอนหรอการจบกบ

hydrophobic residues จงตองปรบแกไขโดยก�าหนด condition เชน pH ionic strength temperature

หรอเตมสารอน (additives) เพอชวยปรบสภาพใหมความคงตวดขนเหมาะสมตอการน�าไปใช เชน เกลอ

เพอชวยลดการเสยสภาพและการจบตวกนทเปนผลจากประจบนโมเลกลโปรตน หรอ polyalcohol ชวยตรง

โมเลกลไวกบตวท�าละลาย หรอ surfactants ตางๆ เพอปองกนการเกาะตดบนผวอนทไมตองการ รวมทงเตม

preservative บางชนด ตวอยางสารทเตมลงในสตรต�ารบไดแก

• pH buffer ใชเพอปรบ pH ใหเหมาะสมกบความคงตวของผลตภณฑ โดยใชกรดออน

และเกลอของมน ไดแก เกลอ phosphate, citric acid และ glacial acetic acid

เปนตน

• Isotonicity ใชเพอปรบคา osmolality ของผลตภณฑซงมผลตอความคงตวของ

ผลตภณฑเชนเดยวกบ pH สารทใชไดแก NaCl, sorbitol เปนตน

• Solubility ใชเพอเพมคาการละลายของผลตภณฑ เชน polysorbate 80 เปนตน

• Dilution ใชเปนตวท�าละลายผลตภณฑ เชน WFI เปนตน

• Stabilizer ใชเพอเพมความคงตวของผลตภณฑ สารในกลมนอาจใชปองกนการเกด

ปฏกรยาหรอการเปลยนทางกายภาพ รวมทงการเปนสาร preservative ไดแก maltose,

nitrogen, glycine, polysorbate 80 และ benzyl alcohol เปนตน

• Surface active agent ใชเพอปรบแรงตงผว ชวยในการน�าสงและการละลายของ

ผลตภณฑ เชน polysorbate 80

สารทไดจากกระบวนการเกบกอนเขาสขนตอนตอไปจะเรยกวา semi-finished product


48

2.4 Filling process

เปนขนตอนการบรรจสารลง container โดยผลตภณฑทเปนยาฉดจะตองมการท�าใหปราศจาก

เชอโดยการกรอง เนองจากไมสามารถฆาเชอดวยความรอนไดเพราะจะท�าใหโปรตนเสยสภาพ และการบรรจ

ตองควบคมไมใหมการปนเปอนของเชอขณะบรรจ

container ตองเปน container ทไมมผลตอผลตภณฑโดยไมมการดดซบผลตภณฑและไมปลอย

สารลงมาในผลตภณฑขณะบรรจ รวมทงสามารถปองกนการเปลยนสภาพของผลตภณฑได เชน ปองกนแสง

ปองกนการผานเขาออกของออกซเจนได เปนตน

ในการผลตนนเพอใหไดสาร biotechnological products จงจ�าเปนตองมการ validated

process ทใชในการผลตและการควบคมกระบวนการผลต เพอใหเซลลผลตสารทตองการออกมาตรงตามท

ตองการ

3. Process validation และ In-process control

เปนการตรวจสอบความถกตองของกระบวนการผลตในขนตอนตางๆ วาสามารถไดผลผลตมคณภาพ

สม�าเสมอและสอดคลองกบมาตรฐานทก�าหนดไวหรอไม และตองบนทกเปนเอกสารเพอเปนหลกฐานแสดง

คณภาพ ประสทธภาพและความปลอดภยของ biotechnological products จงรวมถงการประเมน viral

clearance ในขนตอนการ upstream processing และพสจนจากขอมล in-process control เปนการก�าหนด

คณภาพในการผลตของแตละขนตอนใหไดผลตภณฑทมคณภาพ เชน ในขนตอนการ fermentation ตองม

การปนเปอนของ endotoxin ไมเกน 1 EU/ml เพอทจะควบคมการปนเปอนของ endotoxin ในผลตภณฑ

ส�าเรจรป


49

Biotechnological Products

ความเสยงจากการปนเปอนเชอไวรสในผลตภณฑ biotechnological products มสงรวมถงการปนเปอน

adventitious agents อนๆ ซงหมายถงแบคทเรย รา มยโคพลาสมา เปนตน เนองมาจากการใชสารตงตน

องคประกอบของสารทใชในการผลตทปนเปอนหรอเกดการปนเปอนเชอโรคเหลานเขามาระหวางการผลต โดย

เฉพาะอยางยงปจจบนมการใชเซลลของคนและสตวเปนแหลงผลตมากขน เนองจากไดผลตภณฑทมคณภาพดกวา

การใชเซลลยสตหรอเซลลเชอจลนทรยอนๆ ซงเซลลของคนและสตวมกปนเปอน เชน ไวรส มยโคพลาสมา

อยกอนแลว ซงหากไมสามารถก�าจดออกไดและปนเปอนในผลตภณฑทเปนยา อาจกอใหเกดอนตรายตอผทไดรบ

ยาเหลาน ดงนนจงตองมกระบวนการควบคมการปนเปอนไวรส และ adventitious agents อนๆ

ทมาของไวรส

1. ไวรสใน master cell bank (MCB): เปนไวรสทแฝงอยในเซลลอยแลว (persistent virus

infection) เชน Herpes virus หรอ endogenous retrovirus ซงสามารถเพมจ�านวนจากเซลลรนหนงไป

อกรนหนง ไวรสปนเปอนส MCB ไดหลายทาง เชน เปนเซลลทเพาะเลยงมาจากเซลลสตวทมไวรสอยแลว

หรอใชไวรสเพอปรบแตงเซลลใหเปน cell line ทเหมาะสมตอการผลต เชน การใชไวรสเพอชกน�าใหเกดการ

แสดงออกของยน

2. ไวรสทปนเปอนระหวางการผลต: เนองจาก

• ใช biological reagents ทปนเปอน เชน animal serum ซงเปนองคประกอบของอาหาร

เลยงเซลล

• ใชสารทปนเปอนไวรส เชน monoclonal antibody ทใชใน affinity column

• ไวรสปนเปอนในเซลลและอาหารเลยงเซลลระหวางการเกบ

เนองจากการตรวจหาไวรสในยาส�าเรจรปมขอจ�ากดจากเทคโนโลยการวเคราะหทอาจไมสามารถ

ตรวจสอบการปนเปอนไดทกชนด จงตองมแนวทางควบคมคณภาพใหมความมนใจในความปลอดภย โดย

ประกอบดวย 3 หลกการ คอ

Viral Safety Evaluations of


50

1. การคดเลอกและตรวจสอบเซลลทจะน�ามาเปนแหลงผลต รวมทงสารตงตนอนๆ ทเกยวของ เชน

สวนประกอบของอาหารเลยงเซลล (quality control of cells substrates)

2. การประเมนความสามารถก�าจดและท�าลายไวรสของกระบวนการผลต (viral clearance evaluation)

3. การตรวจวเคราะหระหวางการผลตและการตรวจวเคราะหคณภาพผลตภณฑ (in-process control

and product testing)

1. Quality control of cell substrate

Cell line qualification

มโอกาสพบ endogenous retroviruses ปนเปอนอยในเซลลบางชนด หากจ�าเปนตองใชเซลลนนอยาง

หลกเลยงไมไดตองมการพจารณาอยางละเอยดและแสดงเหตผลจากการวเคราะห risk/benefit จากประโยชน

ในการน�ายาไปใชรกษาโรค การกอโรคของไวรสในคน รวมทงขนตอนการเตรยมยาใหบรสทธดวย

การคดเลอกเซลลเพอเปน cell substrate ตองพจารณาแหลงทมาของเซลล การตรวจสอบการปนเปอน

adventitious agents ตางๆ ตงแต parental cell line จนพฒนาเปน cell seeds MCB และ WCB

สวนใหญมกเปนขอมลจากการวจยและพฒนายา รวมถงการพฒนาเซลลเพอเปน cell bank โดยเฉพาะ

อยางยงหากเปนเซลลจากคนและสตวตองมขอมล เชน species strains เนอเยอหรออวยวะตนก�าเนด อาย

และเพศ ขอมลดานสขภาพ เพอด pathogenic agents และ physiological condition เปนตน รวมถง

รายละเอยดอนๆ เชน วธการเลยงเซลล หรอการปรบแตงเซลลใหมคณสมบตทตองการ วธการเกบเซลล ซง

ตองจดท�าเปนบนทกประวตของเซลล และมขอก�าหนดของเซลล (cells specification) กอนน�าไปใชและหลง

น�าไปใชในการผลตเพอใหมนใจวาเซลลยงคงสภาพเดมตลอดเวลา

เมอได cell substrate ส�าหรบการผลตแลว ตองก�าหนดแนวทางการตรวจทง MCB และ WCB

รวมทง end of production cells (EOP) ปจจบนมวธการตรวจหาไวรสหลายวธ ซงตองเลอกใหความเหมาะสม

กบไวรสนนๆ ทงวธทาง in vitro หรอ in vivo ทมความจ�าเพาะเหมาะสมและมความถกตองเชอถอได

2. Viral clearance evaluation

นอกจากการคดเลอกสารตงตนและเซลลทสะอาดปราศจากการปนเปอนไวรสและ adventitious agents

อนๆ แลว ตองออกแบบกระบวนการผลตใหสามารถก�าจดไวรส (clearance) ทอาจหลงเหลอหรอปนเปอน

เขามาระหวางการผลต อาจเปนการท�าใหออนฤทธลง (inactivation) หรอโดยการก�าจดไวรสออกไป

(removal) ทงนตองท�าการประเมนประสทธภาพของขนตอนนนๆ ในกระบวนการผลตวาสามารถก�าจดไวรสท

ปนเปอนได โดยท�าการศกษาและบนทกขอมลไวเปนหลกฐานอธบายเหตผลและผลทไดจากการศกษาน


51

จดประสงคของการศกษาเพอ

• ประเมนวากระบวนการการผลตมขนตอนใดทสามารถก�าจด/ท�าลายไวรสได

• ประเมนประสทธภาพการก�าจด/ท�าลายไวรสของขนตอนนนวาท�าไดมากนอยเพยงใด

หลกการ: โดยการเตมไวรส (spiking) ทรปรมาณจ�านวนหนงลงใน crude materials ทเกบมาจาก

การผลตกอนเขาสขนตอนทคาดวามความสามารถก�าจดไวรสได แลวไตเตรทหาปรมาณไวรสทเหลอโดย

infectivity assay ทเหมาะสม ค�านวณคา reduction factor เปนคา log reduction

ตองวางแผนการศกษาโดยเขยนเปนแผนการ (protocol) ขนตอนโดยละเอยดประกอบดวย

1. การคดเลอกเชอไวรส: แสดงเหตผลและหลกเกณฑการเลอกไวรสเพอน�ามาศกษาโดยทวไปตองอาศย

ขอมลจากชนดของเซลลทน�ามาใชวามโอกาสปนเปอนไวรสชนดใดบาง ทส�าคญตองพจารณาวาปจจบนมวธการ

และเซลลทเหมาะสมส�าหรบเตรยมใหไดไวรสปรมาณมากพอส�าหรบการน�ามาใชหรอไม ตลอดจนวธไตเตรทหา

ปรมาณไวรสทเชอถอได ถายงไมมวธทเหมาะสมส�าหรบไวรสทตองการศกษา โดยทวไปจะเลอกใชไวรสชนดอน

ทมความคลายคลงทมวธการเตรยมและการไตเตรททดแลวมาทดแทน

2. วธการศกษา: โดยปกตแลวจะไมท�าการศกษาการก�าจด/ท�าลายไวรสในพนทเดยวกบการผลต มกจะ

ด�าเนนการในหองอนทแยกเปนสดสวนโดยการจ�าลองขนตอนการผลตทคาดวาสามารถก�าจดไวรสไดใหเหมอน

หรอใกลเคยงกบการผลตจรง

หากมขนตอนทจะศกษาประสทธภาพการก�าจดไวรสมากกวาหนงขนตอน จะตองศกษาแยกทละขนตอน

และใชไวรสครงละหนงชนดจนครบทกชนดตามทวางแผนไวโดยมการท�าซ�าใหเหมาะสมเพอการค�านวณทางสถต

ทเชอถอได และแผนการศกษาตองค�านงถงปจจยตางๆทเกยวของเพอใหไดผลทสะทอนถงการผลตตามขนตอน

จรงและมความเชอถอมากทสด

3. การแปลผล: ความสามารถของแตละวธในการก�าจดแตละชนดมความแตกตางกน ควรแสดงผลการ

ก�าจดไวรสของแตละขนตอนตอไวรสแตละชนดเพอบอกถงประสทธภาพแลวจงแสดงเปนผลรวมของทกวธ

การก�าจดไวรสโดยวธตางๆ ทมปจจยทเกยวของ เชน physico-chemical properties ของไวรสโดยตรง

ดงนนผลการศกษาตองสามารถระบปจจยทเกยวของในการผลตทจะมผลตอประสทธภาพของวธเหลานและตอง

สามารถควบคมปจจยเหลานไดเพอใหมนใจวามประสทธภาพสม�าเสมอ และตองบนทกผลการศกษาไวเปนหลกฐาน

และเมอใดทมการเปลยนแปลงขนตอนในกระบวนการผลตหรอการท�าสารใหบรสทธอาจมผลทางตรงหรอ

ทางออมตอประสทธภาพการก�าจด ตองพจารณาการประเมนประสทธภาพซ�า เชน การเปลยนแปลงกระบวนการ

ผลตอาจมผลท�าใหปรมาณไวรสปนเปอนเซลลตางไปจากเดม หรอมผลลดระดบประสทธภาพการก�าจด เปนตน


52

3. In-process control and product testing

ในการออกแบบการกระบวนการผลต ตองก�าหนดแนวทางการควบคมคณภาพระหวางการผลต โดย

ทวไปมกตรวจหาการปนเปอนเชอตางๆ จากความปลอดเชอ และมการตรวจหามยโคพลาสมา ไวรสบางชนด

เปนตน โดยเฉพาะอยางยงหากใชเซลลคนหรอสตวจะมการตรวจสอบอยางละเอยดทงในระหวางการผลต เชน

การสมตวอยาง unprocessed bulk ซงเปนเซลลทเกบจากการผลตหลายรอบมาตรวจหาไวรส หากสามารถ

ท�าไดทงเซลลทสมบรณ (intact cells) หรอสวนผสมหลงการแตกเซลลแลว (mixture disrupted cells)

รวมทงสวนใสซงเปนอาหารเลยงเซลล (cell culture supernatant) หากตรวจพบ adventitious viruses

ในสวนผสมใดทเกบจากการผลตโดยปกตจะไมน�าไปผลตตอไปและตองตดตามหาสาเหตของการปนเปอนเพอหา

ทางแกไข นอกจากนตองท�าตรวจวเคราะหการปนเปอนในผลตภณฑทง drug substance และ drug product

ทงนจะตองก�าหนดไวอยางมหลกเกณฑพรอมเหตผลสนบสนนการตรวจและไมตรวจในขนตอนใด


53

and Quality Control

1. ความส�าคญของการควบคมคณภาพ

Biotechnological products ผลตจากสงมชวต เชน เชอจลนทรย E. coli ยสต หรอ mammalian

cells ซงมความซบซอน การก�าหนดแนวทางการควบคมคณภาพตองมความรความเขาใจเกยวกบกระบวน

การผลต เชน การผลตทใช eukaryotic cells จะมความซบซอนมากกวาการใช prokaryotic cells รถงแหลง

ทมาของสารตงตนและองคประกอบอนๆ เพอพจารณาความปลอดภยจากการปนเปอนเชอจลนทรย จากสาร

ตงตนและทปนเปอนเขามาระหวางการผลต รวมถงเขาใจคณลกษณะของผลตภณฑซงเปนโปรตน การทจะผลต

ใหไดโปรตนทตองการและทมคณภาพดสม�าเสมอตองประกอบดวยการท�า manufacturing process validation

รวมกบ batch analysis และ protein characterization

การตรวจสอบและควบคมคณภาพสงทเกยวของในกระบวนการผลตจนถงผลผลต ดงน

• Raw material testing and excipient testing

• Cell banking manufacturing (characterization and bio-safety testing)

• Process validation / viral clearance studies

• Bulk harvest testing

• Protein characterization and quality control

เมอไดโปรตนทตองการแลวตองตรวจสอบคณลกษณะดานตางๆ ดวยเทคนคการตรวจวเคราะหหลายวธ

โมเลกลโปรตนทไดมความซบซอนตองอาศยเทคนคหลายดานรวมกนทมความจ�าเพาะเพอใหรโครงสรางและ

องคประกอบและความคงตวของโปรตน ใหไดขอมลทถกตองซงยากกวาการวเคราะหยาประเภทโมเลกลเลก

(small molecules) ผลการตรวจวเคราะหโปรตนจากการผลตซ�าหลายๆรอบ (batch analysis) จะแสดงถง

คณลกษณะตางๆ ของโปรตนทเตรยมได และควรท�าการเปรยบเทยบกบการผลตหลายรปแบบ เชน รนทดลอง

หรอใชก�าลงการผลตขนาดเลกทเรยกวา pilot batch และรนทผลตตามขนาดก�าลงผลตเพอการคา

Protein Characterization


54

(commercial batch) ในการเตรยมเปนผลตภณฑยา โปรตนทเตรยมไดและผานการท�าใหบรสทธแลวเปน

active ingredient ทเรยกเปน drug substance (DS) ซงจะถกน�าไปจดเตรยมเพอเปนยาส�าเรจรป (finished

product หรอ drug product: DP) หากโปรตนหลายๆรนการผลตมคณภาพไมแตกตางกน แสดงถงความ

สม�าเสมอของคณภาพทไดและแสดงถงความสามารถในการควบคมกระบวนการผลตไดเปนอยางด

จดประสงคของการตรวจ DS และ DP จะแตกตางกนแมจะมบางหวขอทเหมอนกน ใน DS จะเนน

การพสจนโครงสรางของโปรตนทง primary, secondary และ tertiary structure รวมทงชนดของกรดอะมโน

ทอยปลายสายโปรตนทงสองดาน (N-terminal และ C-terminal) เพอยนยนชนดของโปรตนทได และตรวจสอบ

impurities profile ทง product-related impurities, process-related impurities รวมถง characterization

เพอด physical properties ตางๆ ขณะท drug product จะเนนการตรวจสอบ drug performance

จากบทท 2 ถาผลตโปรตนจาก mammalian cells จะมกระบวนการ post-translational ของโมเลกล

โปรตน หากไมสามารถควบคมกระบวนการผลตใหมความสม�าเสมอและเหมาะสมจะท�าใหไดโมเลกลโปรตนทม

ความแตกตางกนได โดยเฉพาะอยางยงกระบวนการ glycosylation ซงเปนการเตมโมเลกลน�าตาลอยางถาวร

บนสายโปรตน มทงแบบ N-linked glycosylation โดยมการเตมน�าตาลเชงเดยว N-acetylglucosamine

ทต�าแหนง N ของ NH2 ของกรดอะมโน asparagine ดวย covalent bond ทอยใกลกรดอะมโน threonine

หรอ serine และสวนชนด O-linked มการเตมน�าตาลเชงเดยว N-acetylgalactosamine (GalNAc)

ทต�าแหนง OH ของกรดอะมโน serine หรอ threonine เซลลอาจผลตสวนทเปนคารโบไฮเดรทซงเรยกวา

glycan หลายรปแบบ แตกตางกนทต�าแหนงการจบกบกรดอะมโน หรอล�าดบและจ�านวนโมเลกลน�าตาลทตอ

เปนสายเรยกเปน glycoforms การตรวจสอบองคประกอบคารโบไฮเดรทวามโมเลกลน�าตาลเชอมตอจาก

สายโปรตนใด และมโมเลกลน�าตาลชนดใดประกอบอยเปนคณลกษณะทน�ามาเปรยบเทยบผลตภณฑอางอง

biosimilar เนองจาก glycosylation มผลตอคณภาพทงดานประสทธภาพ drug performance และความ

ปลอดภย

นอกจากนโมเลกลโปรตนอาจเกดจบตวกนเปน dimers จดเปน product-related substances

เชนกน โดยอาจออกฤทธไดเหมอนหรอใกลเคยงกบโปรตนทเปนโมเลกลแบบ monomer (intact molecule)

สวนการจบตวกนเปน oligomers หรอ aggregates จดเปนสารปนเปอนชนด product-related impurities

ซงควรมประมาณเลกนอยหรอไมมเลย จงตองตรวจหาวามชนดใด รปแบบใด และมปรมาณเทาใด และจ�าเปน

ตองวเคราะหใหรวาโมเลกลเหลานมผลกระทบตอประสทธภาพและความปลอดภยหรอไม นอกจากนตองตรวจ

หาสารปนเปอนชนด process-related impurities ทส�าคญคอ โปรตนและ DNA ของ host cells ใน drug

substance เนองจากอาจมผลกระตนภมคมกนของผทไดรบยาทผลตจากโปรตนนเปนผลใหรางกายสราง

แอนตบอดตอตานเกดการดอยา หรอท�าใหเกดโรคอนภายหลง


55

ดงนนการควบคมคณภาพจงเปนขนตอนทส�าคญอยางยงตอความส�าเรจของการผลต biotechnological

products ทมคณภาพ วธการวเคราะหทน�ามาใชตองเหมาะสมซงขนอยกบเทคโนโลยการวเคราะหในขณะนน

เชน มความไวเพยงพอทจะแสดงโครงสรางและความบรสทธ ตลอดจนระบชนดและปรมาณสารปนเปอนได วธ

ตรวจวเคราะหทใชตองไดรบการตรวจสอบความใชไดหรอความถกตองของวธแลว (test method validation)

ผลการตรวจวเคราะหโปรตนทเตรยมไดจากขนตอนการพฒนายา in-process control และ batch analysis

จะน�ามาเปนขอก�าหนดเฉพาะ (specification) ของผลตภณฑยา biotechnological products ทไดซงตอง

ก�าหนดอยางมหลกเกณฑและมเหตผลเหลานสนบสนน

2. หวขอการตรวจวเคราะห

โดยทวไปหวขอการตรวจวเคราะหคณภาพอาศยวธทาง in vitro และ in vivo รวมกน ซงมอยางนอย

ดงน

1. ประสทธภาพ (efficacy)

2. ความปลอดภย (safety)

3. การตรวจเอกลกษณ (identity)

4. การวเคราะหความบรสทธ (purity) และการวเคราะหสารปนเปอน (impurities)

5. การวเคราะหคณลกษณะอนๆ (protein characterizations & physic-chemical properties)

6. ความคงตว (stability)

7. คณสมบตทางภมคมกนวทยา (immunological properties) หากจ�าเปน

ประสทธภาพ เปนการตรวจวดความสามารถในการออกฤทธของโปรตน ซงสวนใหญเปนวธ bioassay

ทงการใชเซลลเพาะเลยงหรอสตวทดลอง

ความปลอดภย ตรวจวเคราะหเพอใหเกดความมนใจวาโปรตนทไดมความปลอดภยตอการน�าไปใช

จากการตรวจสอบหลายวธ ทงความปลอดเชอ (sterility) จากรา แบคทเรยโดยวธ direct inoculation

หรอ membrane filtration ตรวจหาสารกอไขในกระตาย (rabbit pyrogen test) และเอนโดทอกซน

(endotoxin) จากการปนเปอนแบคทเรยแกรมลบดวยวธ LAL testing ตรวจหาความเปนพษ (abnormal

toxicity) ในหนตะเภาและหนถบจกร


56

การตรวจเอกลกษณ และการวเคราะหคณลกษณะอนๆ เปนการตรวจยนยนวาโปรตนทไดม

คณลกษณะตามทตองการเมอเปรยบเทยบกบสารมาตรฐาน รวมทงเทยบกบสารเดยวกนนทเปนสารธรรมชาต

ทรางกายสรางขนและศกษา physic-chemical properties เชน ตรวจสอบชนดของกรดอะมโนทประกอบเปน

โปรตนและโครงสรางระดบตางๆ ของโปรตนเชอมโยงกบคณสมบตเฉพาะเพอแสดงถงความเหมาะสมตอการน�า

ไปใชในการรกษาโรค โดยปกตมกมหวขอและรายละเอยดแตกตางกนแลวแตชนดของโปรตนทเปนยา วธการ

ตรวจควรมความจ�าเพาะกบชนดของโปรตนซงมหลายวธ และอาจวเคราะหทางชววทยารวมดวย เชน ดกลไก

การออกฤทธ

การวเคราะหความบรสทธ และสารปนเปอน แมวาปจจบนมวธการและขนตอนการเตรยมโปรตนให

บรสทธอยางมประสทธภาพ แตยงคงมความเสยงจากการปนเปอนเชอโรคและสารประกอบจากกระบวน

การผลตและสารตงตน จงจ�าเปนตองตรวจวเคราะหความบรสทธของโปรตนทเตรยมได รวมทงตรวจหา

product-related substances, product-related impurities และ process-related impurities เพอน�ามา

ก�าหนด impurities profile นอกจากนอาจตองศกษาคณสมบตทางภมคมกนวทยา หากจ�าเปนตวอยางรายการ

และวธตรวจวเคราะห drug substance และ drug product แสดงในตารางท 1

ตารางท 1 แสดงตวอยางรายการวเคราะห drug substance

Drug substance testing Methods

1. Appearance ตรวจลกษณะทางกายภาพดวย visual inspection หรอ

อาจมอปกรณเครองมอประกอบ

2. Identity (ตองมมากกวา 1 วธ) เพอตรวจสอบ

2.1 Structural characterization and

confirmation

– amino acid sequence

– amino acid composition

– terminal amino acids

– peptide mapping

– carbohydrate structure

• SDS-PAGE

• HPLC หลายชนด เชน SEC-HPLC, RP-HPLC,

IEC-HPLC, LC-MS

• IEF

• Nuclear magnetic resonance (NMR)


57


2.2 Physico-chemical properties

– molecular weight

– molecular size distribution

– isoform pattern

– extinction coefficient

– electrophoretic pattern

– spectroscopic profile

– pH

– osmolality etc.

IEF, extinction coefficient (UV) และ spectroscopic

profile จาก Spectrophotometry SDS-PAGE HPLC

และวธทางเคมอนๆ

3. Biological properties เพอด biological activity ทงใน in vivo และ in

vitro เชน ในเซลลเพาะเลยง ในสตวทดลองหรอโดยวธ

ทางภมคมกนวทยา enzyme-linked immunoassay

(ELISA)

4. Purity and impurities (ตองมมากกวา

1 วธ)

4.1 process-related impurities

– host cell protein

– host cell DNA

– chromatographic resins

– cell culture media etc.

SDS-PAGE, HPLC, ELISA หรอ immunochemistry

methods เชน western-blot

4.2 Product-related impurities และ

product-related variants

– truncated forms

– other modified forms

– aggregates

SDS-PAGE และ HPLC


58


5. Potency/efficacy ทงใน in vivo และ in vitro เชน ในเซลลเพาะเลยง

ในสตวทดลองหรอโดยวธทางภมคมกนวทยา เชน

enzyme-linked immunoassay (ELISA)

6. Quantity (protein content) UV method หรอ วธทางเคม เชน Lowry method

7. Safety tests

– pyrogenicity (rabbit test,)

– endotoxin (Limulus Amebocyte

Lysate: LAL)

– sterility หรอ bioburden

– abnormal toxicity

– mycoplasma

bioassay ใน in vivo เชน pyrogen test ในกระตาย

หรอ in vitro โดย LAL testing ซงเปนวธชวเคม และ

การตรวจความปลอดเชอทางจลชววทยา

ตารางท 2 แสดงตวอยางรายการตรวจวเคราะห drug product

Drug product testing Methods

1. Appearance ตรวจลกษณะทางกายภาพดวย visual inspection หรออาจ

มอปกรณเครองมอประกอบ เพอดลกษณะของผง หรอ

สารละลาย ส และสารปนเปอนอนๆ

2. Identity (ตองมมากกวา 1 วธ) โดยเนน

การเปรยบเทยบ drug product กบสาร

มาตรฐาน

peptide mapping SDS-PAGE capillary

electrophoresis หรอ immunoblot techniques

3. Product characterization เชน

monomer และ dimers aggregates

pH osmolality

HPLC และวธทางเคม

4. Potency ELISA ในเซลลเพาะเลยงหรอเทคนคทางชวเคมอน เชน

HPLC


59

Drug product testing Methods

5. Biological activity bioassay ในเซลลเพาะเลยงหรอสตวทดลอง

6. Quantity or strength (protein

content)

UV, HPLC

7. Purity and impurities เชน ปรมาณ

aggregates

HPLC ทง SEC-HPLC และ ion exchange HPLC

8. Safety

– pyrogenicity (rabbit test)

– endotoxin (LAL)

– sterility หรอ bioburden

– abnormal toxicity

ทงวธทาง bioassay ใน in vivo เชน pyrogen test ใน

กระตาย หรอ in vitro โดย LAL testing ซงเปนวธชวเคม

และการตรวจความปลอดเชอทางจลชววทยา

9. Exipient เชน polysorbate 80 Spectrophotometry HPLC หรอวธทางเคม

10. อนๆ เชน การวเคราะหปรมาณความชนดวย Karl Fischer methods

3. วธวเคราะห

การเลอกใชวธวเคราะหทเหมาะสมจะท�าใหรถงโครงสรางและคณลกษณะตางๆ ของโปรตนทเตรยมได

วธวเคราะหทเลอกใชอาจเปนวธจากต�ารายา (compendial methods) หรอเปน in-house method หากเปน

in-house method ตองเปนวธทไดรบการตรวจสอบความถกตองแลว (method validation) การคดเลอกวธ

วเคราะหมความส�าคญ เนองจากผลจากการวเคราะหจะถกน�ามาก�าหนดขอก�าหนดเฉพาะของยานนๆ หากวธ

มความไวตางกนกจะไดคาทตางกน ดงนนจงตองเลอกวธใหเหมาะสม โดยพจารณาจากหลกการของวธ

เครองมอหลก การเตรยมตวอยาง สารมาตรฐานและวธวเคราะหตลอดจนการค�านวณและแปลผล ดงนนจง

ตองใหเหตผลวาวธทเลอกใชนนเปนวธทเหมาะสมสามารถแสดงคณลกษณะดานนนๆ ของยาไดตามจดประสงค

หลกการของวธการวเคราะหทส�าคญมดงน

HPLC เปนวธการแยกสารออกจากกนโดยอาศยคณสมบตทางเคมของสารเหลานน เชน แยกโปรตน

จากขนาดและรปรางของโมเลกลดวย (size exclusion chromatography: SEC-HPLC) ดงรปท 1 และ 2

ซงโมเลกลทมขนาดใหญจะผาน column ออกมากอนโมเลกลเลก หรอการแยกโดยอาศยคณสมบตทม

ประจบวกและลบบนโมเลกลของสารดวย cation และ anion chromatography หรอแยกโดยใชการจบกน

อยางจ�าเพาะของโมเลกลดวย affinity chromatography เปนตน


60

รปท 1 SEC-HPLC

(ทมา: http://www.chem.agilent.com/)

(A) (B)

รปท 2 (A) แสดงหลกการแยกสารเทคนค SEC-HPLC

(B) แสดงการแยกสารดวยเทคนค ion exchange-HPLC


61

รปท 4 SDS-PAGE

(ทมา: http://ww2.chemistry.gatech.edu)

Electrophoresis มหลายวธ เชน SDS-PAGE, IEF, capillary electrophoresis เปนตน

SDS-PAGE เปนเทคนคการแยกสารบนแผนเจลในสนามไฟฟาโดยอาศยรปรางและขนาดของสาร โมเลกล

โปรตนทมขนาดแตกตางกนจะเคลอนทดวยความเรวตางกนจากขวบวกไปขวลบ เปนผลใหสารแยกออกจากกน

เมอน�าแผนเจลไปยอมสจะปรากฏแถบสของโปรตนตามจ�านวนชนดทอยในสารประกอบนน ดงรปท 4


62

เนองจากโปรตนเปนโมเลกลทมประจ จงน�ามาเปนประโยชนในการแยกสารบนเจลทมคา pH ตางๆ

เรยกวา isoelectric focusing (IEF) โมเลกลโปรตนจะเคลอนทไปบนแผนเจลทมคา pH แตกตางกน และจะ

หยดในต�าแหนงทคา pI ของโปรตนมคาเทากบคา pH บนแผนเจล ซงผลรวมของประจของโมเลกลเทากบ 0

เมอน�าแผนเจลไปยอมสจะเปนแถบสของโปรตนทประกอบในสารละลายนน (รปท 5)

รปท 5 IEF


63

ปจจบนไดมการพฒนารวมเทคนค HPLC เขากบ SDS-PAGE เปน capillary electrophoresis (CE)

ดงรปท 6 หรอ capillary zone electrophoresis (CZE) เปนเทคนคทนยมใชกนมากในการวเคราะหโปรตน

เนองจากเปนวธทงาย ใชเวลานอยกวาเดมแตใหผลทแมนย�าและคงทกวา SDS-PAGE แบบเดม เปนการแยก

องคประกอบของโปรตนตวอยางทเคลอนไปใน capillary tube ซงปลายทงสองขางจมในสารละลายอเลกโตรไลท

เมอผานกระแสไฟฟาแรงสงเขาไปใน tube จะท�าใหเกดประจในสารตวอยางจากขวบวกไปขวลบตามแรง

electro osmotic flow ท�าใหเกดการแยกของสารตวอยางเปนโซน เมอโซนของสารเคลอนทผาน detector

จะมการสงสญญาณจาก detector ไปยงหนวยประมวลผล ไดเปน electrophorogram

รปท 6 Capillary Electrophoresis

Amino acid sequencing เปนการศกษากรดอะมโนทประกอบเปนโปรตน สามารถตรวจสอบ

การเกด variation มชนดทแตกตางไปจากสารธรรมชาตหรอจากทควรจะเปน ประกอบดวยขนตอนการยอย

โปรตนทรปรมาณดวยกรดแลววเคราะหหาชนดของกรดอะมโนทแยกไดดวย ion-exchange HPLC หรอ

reverse phase HPLC และใหกรดอะมโนท�าปฏกรยากบสารมส เชน ninhydrin หรอ fluorescamine ซง

จะไดสตางๆกนตามชนดของกรดอะมโน ปรมาณของกรดแตละชนดแปรผนตามคาการดดกลนแสง ดงรปท 7


64

รปท 7 Amino Acid Sequencing

Terminal amino acids sequencing เปนการตรวจพสจนเอกลกษณของโครงสรางโปรตนวธหนง

โดยการตรวจล�าดบกรดอะมโนทอยปลายสายทงสองขางของสายโปรตน (N-terminal and C-terminal

sequencing) ดวย Edman reagent ปจจบนมเครองมออตโนมตท�าใหวเคราะหไดงาย


65

รปท 8 Amino Acid Sequencing

Peptide mapping เปนการตรวจคณลกษณะโครงสรางระดบ primary structure ของโปรตน

โดยใชเอนไซม protease เชน trypsin หรอใชสารเคมตดสายโปรตนใหเปน peptides สายสนๆและตรวจสอบ

ดวย SDS-PAGE ไดเปน peptide fingerprint และจะทราบน�าหนกโมเลกลของสาย peptides

Glycosylation analysis เปนการตรวจองคประกอบของคารโบไฮเดรทบนสายโปรตนทเรยกวา

glycan ใชเทคนค HPLC รวมกบ mass spectrometry (LC-MS) ทใชในปจจบนโดยการยอยโปรตนเปน

เปปไทดและแยกเปปไทดทไดดวย lectin affinity chromatography เพอจบสายเปปไทดทจ�าเพาะกบเลคตน

แลวน�ามาท�าใหบรสทธดวย hydrophilic interaction chromatography (HIC) และวเคราะห glycoform

ทต�าแหนง N-linked ดวยเอนไซมทเชอมตอกบ tag 180 แลวตรวจสอบเอกลกษณสายเปปไทดดวยเทคนค

LC-MS เมอวเคราะหดวยเลคตนชนดตางๆ จะไดขอมลจ�านวนมากและน�ามาประกอบกนเพอพจารณาล�าดบ

น�าตาลทตอใน glycoforms อกวธหนงคอให glycan จบบน solid support แทนการจบดวยเลคตน

แลวยอยดวยเอนไซม เชน peptide-N-glycanase ทจ�าเพาะกบ N-linked และน�ามาวเคราะหดวย LC-MS


66

ELISA เปนเทคนควธทนยมใชวเคราะหแอนตเจนหรอแอนตบอดโดยอาศยการจบกนอยางจ�าเพาะ

ระหวางโมเลกลทงสองบน solid phase (รปท 9 และ รปท 10)

รปท 9 ELISA

รปท 10 ELISA แบบ competitive


67

Mass spectrometry เปนวธททนสมยและนยมใชกนมากในปจจบนส�าหรบวเคราะหขนาดและล�าดบ

กรดอะมโนของสายเปปไทด โดยการยอยโปรตนดวยเอนไซมแลวใหสารละลายทไดผานเขาไปในเครอง HPLC

เมอสารผานถงปลาย column จะถกพนเปนละอองดวยหลกการ electrospray ionization เขาไปในเครอง

mass spectrometer ประจบนละอองจะท�าใหโมเลกลสารแตกเหลอเปนอออนเดยว วเคราะห spectrum ท

ไดดวยโปรแกรมคอมพวเตอรและเทยบกบขอมลใน database ค�านวณ mass-charged ratio ของสาร เมอ

ท�าซ�าดวยเอนไซมชนดอนทตดสายโปรตนในต�าแหนงตางๆกน และน�าผลมาพจารณารวมกนจะท�าใหรล�าดบ

กรดอะมโนของโปรตนนน ปจจบนมการพฒนาเทคโนโลยการวเคราะหโดยรวมเทคนคนกบ HPLC เปน

LC-MS ท�าใหมศกยภาพสงขน

Protein content การวเคราะหปรมาณโปรตนท�าไดหลายวธ และเนองจากโปรตนทเตรยมไดจะมความ

บรสทธสง ปรมาณนอย จงตองเลอกใหเหมาะสม วธทมกใชจงเปน UV-visible spectroscopy ไดแก

• การดดกลนแสงทความยาวคลน 280 nm tryptophan และ tyrosine เปนกรดอะมโนชนด

ทพบมากในโปรตนชนดตางๆ และสามารถดดกลนแสงทความยาวคลน 280 nm ไดด จงน�ามา

ค�านวณเปนความเขมขนของโปรตนของสารละลายนนได เหมาะกบสารทมความบรสทธมาก

แตตองระวงการปนเปอนจาก nucleic acid ซงสามารถดดกลนแสงทความยาวคลนนเชนกน

• Lowry method เปนการวเคราะหโดยใช Folin-Ciocalteau phenol reagent ท�าปฏกรยา

กบกรดอะมโนชนด tyrosine และ tryptophan บนสายโปรตนเกดสน�าเงนฟาและอานคา

การดดกลนแสงของโปรตนทความยาวคลน 500-750 nm และระบเปนปรมาณโปรตนโดยเทยบ

กบกราฟของสารมาตรฐาน ซงเปนวธทเหมาะสมกวา biuret test ในการตรวจหาปรมาณโปรตน

จ�านวนนอย

Karl Fischer method เปนการตรวจวเคราะหปรมาณน�าหรอความชนในโปรตนเปนคารอยละโดย

โมเลกลของน�าในโปรตนตวอยางจะถกสกดออกมาและท�าปฏกรยากบน�ายา Karl Fischer reagent ซงคา

กระแสไฟฟาจะเปลยนแปลงไปตามปรมาณน�าทท�าปฏกรยา ค�านวณปรมาณน�าเปนรอยละหรอ ppm

Direct inoculation/membrane filtration เพอตรวจสอบวา drug substance หรอ drug

product ทเตรยมได มความสะอาดปราศจากเชอรา แบคทเรย วธทใชคอ direct inoculation เปนการเตม

โปรตนตวอยางลงในอาหารเลยงเชอและสงเกตการเจรญของเชอภายใน 14 วน และวธท 2 คอ membrane

filtration โดยการกรองตวอยางโปรตนผาน membrane และน�า membrane ใสในอาหารเลยงเชอ สงเกต

วามการเจรญของเชอภายใน 14 วนหรอไมเชนกน


68

Abnormal toxicity test เปนการทดสอบความเปนพษของโปรตนหรอในสตวทดลองคอหนตะเภา

และหนถบจกร สงเกตอาการปวยและน�าหนกตวของสตวทเปลยนแปลงเทยบกบกลมควบคมภายใน 7 วน

Pyrogenicity test มสองวธคอ rabbit pyrogen test เปนการทดสอบในกระตาย เมอฉดโปรตน

ตวอยางเขารางกระตาย ท�าใหกระตายมอณหภมสงขนเกนกวาทมาตรฐานก�าหนดแสดงวามสารกอไข สวนวธ

LAL เปนการวเคราะหหาปรมาณเอนโดทอกซนของแบคทเรยแกรมลบทอาจปนเปอนในโปรตนทเตรยมไดโดย

อาศยคณสมบตของเอนโดทอกซนทสามารถท�าใหเลอดของแมงดาทะเลกลายสภาพเปนเจล สามารถค�านวณ

กลบเปนปรมาณเอนโดทอกซนได

4. ขอก�าหนดเฉพาะ

ขอก�าหนดเฉพาะเปนการก�าหนดคณภาพมาตรฐานของยาวามคณลกษณะตางๆอยางไร เชน ลกษณะ

ทางกายภาพ ความบรสทธ ปรมาณสารส�าคญ ประสทธภาพความแรง ปรมาณสารปนเปอน เปนตน ซง

ผผลตตองจดท�าขนอยางมหลกเกณฑและมเหตผลสนบสนน ซงขอก�าหนดอาจมาจากต�ารายาหากมก�าหนด

ไวแลว หรอจากผผลตกรณเมอตองการก�าหนดขนใหมแตตองมเหตผลชดเจน โดยเฉพาะกรณทเปนยาใหมซงยง

ไมมขอก�าหนดในต�ารายาใดๆ ผผลตตองแสดงทมาและเหตผลการก�าหนดคาตางๆ ซงมกเปนขอมลตงแตการ

วจยพฒนายา ขอก�าหนดของยามทงขอก�าหนดในการปลอยผานเพอจ�าหนาย (release specification) และ

ขอก�าหนดในการศกษาความคงตว (stability specification) ซงควรสอดคลองไมขดแยงกน

การก�าหนดรายการขอก�าหนดเฉพาะของยาเปนสวนหนงของการควบคม ซงรวมการควบคมสารตงตน

วตถดบ และ excipients, in-process testing, process validation, GMP, stability testing และการ

ตรวจสอบความสม�าเสมอของการผลตแตละรน โดยปกตการก�าหนดขอก�าหนดเฉพาะของยาอาศยขอมลจาก

ขนตอนการพฒนายา ขอมลการศกษาวจยทางพรคลนกและหรอทางคลนก ขอมลจากยาหลายๆ รนทผลตมา

เพอตรวจสอบความสม�าเสมอของการผลต และขอมลจากการศกษาความคงตว หากเปนการแสดงขอมลเพอ

ขนทะเบยนยา หนวยงานทเกยวของภาครฐจะเปนผตรวจสอบและรบรองขอก�าหนดเฉพาะ เมอตรวจรบรอง

คณภาพของยาทางหองปฏบตการจะตรวจวเคราะหตามขอก�าหนดเฉพาะของยาแตละชนดดวยวธมาตรฐานใน

ต�ารายาหรอทก�าหนดโดยผผลต ซงเปนการตรวจเพอยนยนวา ยามคณลกษณะตางๆ ตามทผผลตระบไว

5. การศกษาความคงตว

เนองจาก biotechnological products เปนโปรตนและเปบไทดโมเลกลทไมคอยเสถยร หากเปนไปได

มกผลตใหอยในรป lyophilized form เพอใหสามารถเกบไดนานมากขน แตปจจบนมผลตทงแบบน�าและ

แบบผง ในระหวางการผลตหรอการเกบโปรตนอาจเกดปฏกรยาหลายอยาง เชน deamination aggregation


69

หรอ oxidation proteolysis จากเอนไซม proteases ของ host cell และมกมการเตม stabilizer ใน

ยาส�าเรจรปใหไดยาคงสภาพไดดขน ซงไดแกสารกลม protein alcohol carbohydrates amino acids

bulking agents inorganic salt หรอ nonionic surfactants และปจจยอนทตองพจารณา เชน ปรมาณ

ความชน เปนตน ดงนนตองท�าการศกษาความคงตวของโปรตนเพอก�าหนดสภาวะและระยะเวลาการเกบท

เหมาะสม ซงจะเปนขอมลส�าคญทจะใชพฒนาสตรต�ารบและการเลอกภาชนะบรรจเมอน�าไปผลตเปน drug

sustance และ drug product ตอไป

การศกษาความคงตวของ drug sustance และ drug product ยาตองก�าหนดเปนแผนการศกษา

และอาศยหลายเทคนควธเพอใหไดขอมลความคงตวและการสลายตวของสาร แนวทางการศกษามดงน

1. Study protocol จดท�าแผนการศกษาทก�าหนดรายละเอยดวธการศกษาความคงตวโปรตนซงควรม

ขอมลเหลานเปนอยางนอย

1.1 แสดงรายละเอยดของตวอยางทน�ามาศกษา เชน เปนโปรตนทผลตจาก pilot scale หรอ

commercial scale หรอเปนรนทผลตใชเพอตรวจสอบกระบวนการผลต (process validation lots) และระบ

จ�านวนรนของตวอยางทน�ามาศกษา ขนาดบรรจ หมายเลขรน มรายละเอยดวนผลต เปนตน

1.2 ระบอณหภมทตองการศกษาความคงตวของโปรตน ซงมกเปนอณหภมทคาดวาจะเปนสภาวะท

เหมาะสมตอการรกษาสภาพโปรตนนน เชน –20 องศาเซลเซยส หรอ 2-8 องศาเซลเซยส รวมทงอณหภม

ทเปนสภาวะทรนแรงตอโปรตน เชนท 25 องศาเซลเซยส หรอ 45 องศาเซลเซยส หรออาจเพมเตมการศกษา

ทเปน stress condition อนๆเพอเปนขอมลสนบสนน เชน ศกษาทความชนสมพทธสง 75 เปอรเซนต

การใชแสง หรอทอณหภมต�าหรอสงมาก เปนตน ซงจะแสดงความไวของการสลายตวของตวยาในสภาพตางๆ

เพอใหไดขอมลลกษณะการสลายตวของโปรตน

1.3 ก�าหนดชวงเวลาทจะท�าการศกษา เชน 6 เดอน 12 เดอน หรอ 24 เดอน เปนตน ชวงเวลา

(interval) ทจะน�าตวอยางมาวเคราะหคณลกษณะ เชน วเคราะหทก 3 เดอนในปแรก (0, 3, 6, 9, 12)

ปทสองวเคราะหทก 6 เดอน ตลอดไปจนครบก�าหนดตามอายของยาทก�าหนดไว

1.4 ก�าหนดรายการวเคราะห (test items) ทจะใชตรวจสอบคณภาพโปรตนตวอยางและเกณฑ

ยอมรบ (acceptance criteria) วธวเคราะหทใชตองเหมาะสมและผานการตรวจสอบความถกตองแลว

1.5 ก�าหนดสถตทจะน�ามาใชในการวเคราะหและเกณฑการยอมรบ

2. Study results แสดงผลการศกษาความคงตวจากการวเคราะหคณภาพโปรตนในชวงเวลาตางๆ

ตามทก�าหนดไวใน protocol โดยปกตมกแสดงเปนตารางและกราฟใหเหนชดเจน การตรวจสอบคณภาพ

ควรประกอบไปดวย 4 หวขอเปนอยางนอย


70

• physicochemical characteristics เชน pH, ผลการศกษาจาก chromatography

electrophoresis เปนตน ซงจะเหนการเปลยนแปลงขนาดของโมเลกล และปรมาณสารปนเปอน

• ความปลอดเชอและความสามารถของสารกนเสย (ถาม)

• biological activity ของโปรตนตามเวลาทเปลยนไป

• ผลของภาชนะบรรจเชน ขวด จกยาง ตอคณภาพของยา

3. Conclusion เปนขอสรปถงการศกษาความคงตวของโปรตนทเตรยมไดน สามารถระบสภาวะการเกบ

ทเหมาะสมโดยมเหตผลสนบสนน รวมทงสามารถอธบายลกษณะการสลายตวของโปรตน

Biological Products / Biologics หมายถงผลตภณฑชววตถ ตามระเบยบส�านกงานคณะกรรมการอาหาร

และยา วาดวยขอก�าหนดชววตถทใชส�าหรบมนษย พ.ศ. 2543 ใหนยามวา ชววตถเปนผลตภณฑทมงหมาย

ส�าหรบน�ามาใชโดยตรงตอรางกายของมนษยในการวนจฉย บ�าบด บรรเทา รกษาหรอปองกนโรคของมนษย

ไดแก

1. ผลตภณฑทผลตจากสงมชวตโดยใชกรรมวธดงตอไปน

1.1 การเพาะเลยงจลนทรยหรอเซลล

1.2 การสกดสารจากเนอเยอสงมชวตทงมนษย สตว และพช

1.3 เทคนค recombinant DNA

1.4 เทคนคการผสมตางพนธ (hybridoma technique)

1.5 การขยายพนธจลนทรยในตวออนหรอในสตว

2. ผลตภณฑทไดจากการสงเคราะห ซงการตรวจสอบความปลอดภยและประสทธภาพความแรงตองอาศย

กระบวนการทางชววทยา

Biotechnological Products / Biopharmaceutical Products / DNA Recombinant-derived

Products หมายถงผลตภณฑชววตถ ทผลตดวยเทคนค recombinant DNA ใหไดโปรตนและแอนตบอด

ทมความบรสทธสง และมความจ�าเพาะตอโรค


71

เอกสารอางอง

1. Cooper GM. and Hausman RE. The Cell and Molecular approach. USA: Sinauer

Associated; 2007.

2. Hauke L, Elisabeth S, Rainer R. Advances in refolding of proteins produced in E. coli.

Current Opinion in Biotechnology 1998; 9. p. 497-501.

3. Jeffrey DF, Rachel BK, David SW. Single amino acid substitutions on the surface of

Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility

of fusion proteins. Protein Sci. 2001;10(3). p. 622-30.

4. Pingzuo L, Xiu-Gong G, Rogelio OA and Renugopalakrishnan V. Glycosylated and

Phosphorylated Proteins—Expression in Yeast and Oocytes of Xenopus: Prospects and

Challenges-Relevance to Expression of Thermostable Proteins. Protein Expression and

Purification 2001; 22(3). p. 369-80.

5. Ronald EW, et. al, editors. Handbook of Food Analytical Chemistry, Water, Proteins,

Enzymes, Lipids, and carbohydrate. New Jersey: John Wiley & Sons. Inc.; 2005.

6. Turner P, McLennan A, Bates A and White M. Molecular Biology (Instant Notes). 3rd ed.

Liverpool: Taylor & Francis Group; 2005.

7. Yan-Ping S, Wen-mei K, Jui-chan C, Chia-hui Y, Andrew HJW, and Ting-fang W.

High-throughput screening of soluble recombinant proteins. Protein Sci. 2002; 11(7).

p. 1714-19.

8. Alan C. George Mason University. Biotechnology Concentration; [cited 2004 Jul 15];

[1 screen]. Available at : URL : http://mason.gmu.edu/~achriste/biotec.htm.

9. Brigham Young University-Hawaii, Cloning; [cited 2008 Feb 14]; [1 screen]. Available at :

URL : http://w3.byuh.educourses/bio441/Lectures/Molecular%20Cloning/tsld021.htm.


72

10. Bruce AR. The University of Oklahoma’s Advanced Center for Genome Technology.

Notes on precipitation of nucleic acids; [cited 2006 July 23]; [1 screen]. Available at :

URL : http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_notes.html.

11. California State University. Biology techniques; [cited 2005 Jun 16]; [1 screen]. Available

at : URL : http://csun.edu/~hcbio027/biology/lec2/PL/pl.htm.

12. California State University. biotech-industries; [cited 2005 Dec 14]; [1 screen]. Available

at : URL : http://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec6/fusion.html.

13. CIAN Technologies Inc. rdna; [cited 2004 May 4]; [1 screen]. Available at : URL : http://

inforesource.ciantechnologies.com/sciences/rdna_main.html.

14. Cytos biotechnology. Product development. 2002; [cited 2005 Jul 5]; [6 screens]. Available

at : URL : http://www.cytos.ch/doc/Prodev_July02_KO.pdf.

15. Eastern Michigan University. Translation, 2003; [cited 2006 Aug 26]; [6 screens]. Available

at : URL : http://www.emunix.emich.edu/~rwinning/genetics/transl.htm.

16. Edvotek the biotechnology education company. Construction and Cloning of DNA

Recombinant; [cited 2006 Jan 24]; [1 screen]. Available at : URL : http://www.edvotek.

com/301.

17. European Molecular Biology Laboratory. Extraction clarification; [cited 2005 Jun 23];

[1 screen]. Available at : URL : http://www.embl- heidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/

draft_frames /flowch/extraction_clarification.htm.

18. Ferreira G. Review on Fed-Batch Fermentations: Mathematical Modeling, Parameters and

Control; [cited 2005 Jun 16 ]; [7 screens]. Available at : URL : http://userpages.umbc.

edu/~gferre1/outline.html.

19. George Mason University. Large Scale Production; [cited 2004 Jul 15]; [1 screen]. Available

at : URL : http://gmu.edu/departments/biology/385ch16LargeScalePrdtn/sld045.htm.


73

20. Henry J. College of St. Benedict, St. John’s University. PROTEIN FOLDING: STABILITY

IN VIVO AND IN VITRO; [cited 2005 Feb 16]; [1 screen]. Available at : URL : http://

employees.csbsju.edu/hjakubcwski/classes/ch331/prostructure/olprotfold.html.

21. Joseph P. MSUM biochemistry protein expression and purification guide; [cited 2005

July 15]; [6 screens]. Available at : URL : http://www.mnstate.edu/provost/Recombex-

presguide.pdf.

22. Keith Redway. Vectors. 2007; [cited 2008 Feb 12]; [1 screen]. Available at : URL : http://

www2.wmin.ac.uk/~redwayk/lectures/vectors.htm.

23. Lander University. Gene Analysis; [cited 2008 Feb 14]; [1 screen]. Available at : URL :

http://www.lande.edu/flux/gene_analysis_outline.htm.

24. Madigan, Martinko and Parker. Southern Illinois University, Biology of Microorganisms.1999;

[cited 2005 Aug 23; [23 screens]. Available at : URL : http://cwx.prenhall.com/bookbind/

pubbooks/brock/micro.htm.

25. Nation Agicultural Library. United states Department of Agriculture. Biotechnology

processing; [cited 2005 Sep 11]; [1 screen]. Available at : URL : http://www.nal.usda.

gov/bic/bio21/bioproc.html.

26. Ngee Ann Polytechnic. School of Life Sciences & Chemical Technology, Chemical and

Biomolecular Engineering; [cited 2005 May 22]; [1 screen]. Available at : URL : http://

www.np.edu.sg/~dept-bio/biochemical_cn/biomol.htm.

27. Oklahoma State University. Center for Health Sciences, DNA; [cited 2008 Feb 14];

[2 screens]. Available at : URL : http://ophs.okstate.edu/~ford/5824/5824%20Fall%202002/

Lecturs/DNA.htm.

28. Oklahoma State University. Molecular Genetics; [cited 2008 Feb 18]; [1 screen]. Available

at : URL : http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MG01.html.


74

29. Pacific Lutheran University. DNA Technology. 1999; [cited 2005 AUG 14]; [31 screens].

Available at : URL : http://www.nsci.plu.edu/~mivey/161/Genes.htm.

30. Rensselaer Polytechnic Institute (RPI). rDNA; [cited 2005 Mar 10]; [1 screen]. Available

at : URL : http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/biotech-eviron%20/projlect00/rdna/rdad.html.

31. Southern Illinois University. Biotechnology industries; [cited 2005 Sep 5]; [1 screen].

Available at : URL : http://www.science.siu.edu/microbiologies/coures/description-underg.

32. The International Development Research Centre, Online Biology. Biotechnology; [cited 2008

Feb 19]; [1 screen]. Available at : URL : http://www.agen.ufl.edu/~chyn/age2062/lect/

lect_09/lect_09htm.

33. The National Center for Biotechnology Information. DNA and RNA; [cited 2008 Feb 18];

[1 screen]. Available at : URL : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna/dna.htm.

34. The National Health Museum, Resource Centre. Biotech Applied, [cited 2008 Feb 18];

[1 screen]. Available at : URL : http://www.accessexcellence.org/RC/AB/BA/biotec.htm.

35. The University of Arizona, Biology Learning Centre. Biology; [cited 2008 Feb 18]; [1 screen].

Available at : URL : http://www.blc.arizona.edu/Marry/181/181Lecture/S02Lecture18.htm.

36. The University of Melbourne, Faculty of Medicine, Dentistry and Heath Sciences. Bio-

technology; [cited 2008 Feb 14]; [1 screen]. Available at : URL : http://www.microbiol.

umimelb.edu.au/micro/taff/tp/biotech2%20lectrure/outlinec.htm.

37. The University of Oklahoma, Advanced Center for Genome Technology. DNA Cloning

and Sequencing; [cited 2008 Feb 19]; [3 screens]. Available at : URL : http://www.

genome.ou.edu/protocol_book/protocol_partI.html.

38. University of Maryland. Dept of Cell Biology and Molecular Genetics, Biotechnology &

Recombinant DNA; [cited 2008 Feb 18]; [1 screen]. Available at : URL : http://www.

life.umd.edu/classroom/bsci424/BSCI223WebsiteFiles/Chapter9.htm.


75

39. University of Minnesota, College of Biological Sciences. Recombinant Protein Expression

Laboratory; [cited 2008 Feb 12]; [3 screens]. Available at : URL : http://biosci.cbs.umn.

edu/bpti/RPEL.htm.

40. University and State Library Saxony-Anhalt. Biochemical engineering; [cited 2005 Feb16];

[1 screen]. Available at : URL : http://sundoc.bibliothek.uni_halle.de/.

41. Will OL. Gene, The University of Oklahoma biotech production; [cited 2004 Jul 15];

[1 screen]. Available at : URL : http://faculty-staff.ou.edu/O/Will.Ortiz-Leduc-1/hon3970.

html.


2. การเตรียม Expression vector

Documents

Transcript of 2. การเตรียม Expression vector