11 高效液相色谱法 ( 续 )

11.4 检测器 最常用的液相色谱检测器依次是紫外检测器、示差折射检测器、荧光检测器和电化学检测器等。近年来出现的光散射检测器是新兴的通用型检测器。

表 11. 液相色谱常用检测器的一般性质

检测器 选择性 梯度洗脱 线性范围 检测限 (g/ml)

敏感性 对流速 对温度

紫外 紫外吸收 可以 105 2×10 － 10 不敏感 低

示差 通用型 不可以 104 2×10 － 7 不敏感 10 － 4

荧光 荧光物质 可以 103 10 － 11 不敏感 低

电化学 电活性 不可以 106 10 － 12 敏感 1.5%

电导 离子 不可以 2×104 10 － 8 敏感 2%

紫外 - 可见光吸收检测器和光电二极管阵列检测器

紫外 - 可见吸收检测器是一种应用最广 HPLC 检测器： ● 光吸收定律 ● 检测池结构 ● 波长选择：待测物的吸收波长和溶剂的截止波长

光电二极管阵列光谱检测器

倒光学结构和多通道阵列检测

时间——波长——吸光度三维谱图

大量数据采集、贮存和计算的计算机技术

多波长检测—三维色谱图A

λ

t

二极管阵列检测器色谱图

常规色谱图

三维色谱图

光谱图

光电二极管阵列光谱检测器是 HPLC 检测技术的重大进展。采用这种检测器可以瞬间实时对流出液进行全光谱检测 , 使LC 能提供的信息量大幅度增加。换句话说 , 在一次色谱操作中 , 可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外 -可见光谱图在一起的三维谱图 , 提供既定量又定性的色谱信号。

性能 内容1 A() 固定测定波长色谱图（常规）

2 A1() A2() 固定测定双波长色谱图

3 3-Dim 三维空间的光谱色谱图

4 Spectrum 光谱的贮存和记录

5 S1 / S2 光谱比较6 Edit 贮存光谱数据

表 11.6 光电二极管阵列检测器的应用

荧光检测器和化学发光检测器 荧光检测器是一种高灵敏的 , 选择性检测器 , 其灵敏度比 UV 高 10-1000 倍 , 一般可测 ppb 级的化合物。它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测的物质：如某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生素、石油高沸点馏分、生物碱和甾族化合物等。 1 ．荧光检测器的结构* 激光诱导荧光检测器 (Laser inducted fluorescence detector, LIF)

2 ．色谱衍生技术

色谱衍生技术：在色谱过程中用特殊的化学试剂（衍生试剂），借助于化学反应给样品化合物接上某个特殊基团，使其转变成响应的衍生物之后进行分离检测和直接进行检测的技术。

OH'RCOOROH'RRCOOH2

O)COCF( 23

样品衍生的目的 /作用1 ）改善色谱分离性能，扩大应用范围。 如 GC 中增加样品的挥发度和稳定性：例 1 ， 3 ， 5- 三甲基苯甲酸与 1 ， 3 ， 5- 三甲基酚的酯化反应：

2 ）提高检测的灵敏度和特异性。如有些化合物既没有紫外吸收又不发荧光 , 这类样品可以用衍生的方法 , 将待测物转变为具有紫外吸收或发荧光的物质进行检测。例如邻苯二甲醛 (OPA) 是最通用的伯胺氨基酸衍生剂 , 柱前柱后衍生均可， ODS 柱分离。

    紫外检测： UV 的测定灵敏度可达 10 － 12 mol /

L

    荧光检测：检测范围在 10 － 12 ~ 10 － 15 mol / L

    安培检测：灵敏度可达 10 － 13 mol / L

衍生方式1 ）柱前衍生：分离与检测2 ）柱后衍生：检测，如氨基酸仪分析

HH3C

C

O

HO OH Cl+

H3CH

O

C O O

O

C

由于 2-甲基丁基 -1 ， 4- 二醇不仅缺乏必要的吸收基团，而且不能在 OB柱拆分，应采用苯甲酰氯将其衍生为 2-甲基丁基 -1 ， 4- 二醇二苯甲酸酯后才能进行分离测定。

所有合成产物均经柱层析纯化和结构分析。

图 2- 甲基丁基 -1 ， 4- 二醇二苯甲酸酯色谱拆分图色谱柱： Chiralcel OB 流动相：正己烷 -异丙醇 (93:7) 检测： 254nm/275nm 流速： 0.75mL/min

(S)-(-) (R)-(+)

OO

O O

O

O

n

三苯甲酸酯纤维素固定相

蒸发光散射质量检测器(Evaporative Light-Scatting Mass Detector, ELSD)

HPLC 的发展中受到限制的一个原因 , 就是缺少象 GC中的 FID 一样的灵敏、通用型的检测器。 20世纪 80年代后研制的蒸发散射质量检测器给这一领域带来希望，并向具有真正通用型意义的检测器方向发展。这就是：样品结构不需要具备紫外发色团和合适的折射率；对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不敏感；对各种物质的响应因子很接近；在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质。

1 ） 工作原理 在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为

I = k mb

式中， m为微粒质量， k、 b为实验条件（如温度、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。

散射质量检测和电导测定一样，电导是所有离子的通用性质，光散射是所有粒子的通用性质。对于色谱法来说，溶质已经分离，关键的问题是如何除去流动相和保证检测条件的一致性。

雾化

蒸发

检测

流动相

雾化气体

雾化器

漂移管

Step 1: Nebulization

Column effluent passes through nebulizer needle

Mixes with nitrogen gas

Forms dispersion of droplets

Step 2: Mobile Phase Evaporation Droplets pass through a heated zone Mobile phase evaporates from the sample particle Dried sample particles remain

Step 3: Detection Sample particles pass through an optical cell Sample particles interrupt laser beam and

scatter light Photodiode detects the scattered light

ELSD 的工作原理：经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器，被高速的载气流（氦气和空气）喷成一种薄雾。这些雾粒进入可控制温度的蒸发器（漂移管）中，使流动相气化蒸发，溶剂蒸发后剩下的不挥发组分成为微小的雾状颗粒，进入光散射室进行检测。光源光线经准直后成直角方向通过气流，然后被光阱捕集，以防止反射。蒸气状态溶剂通过光路时，光线反射到检测器上成为稳定的基线信号。云雾状溶质颗粒通过光路时，被位于入射光束 1200 角的检测器收集。 检测器参数：    雾化载气流流速： 2 ~ 5 L / min

    蒸发器温度： 100 ~ 180 ℃

2 ）  蒸发散射质量检测器的优缺点 与示差折光检测器相比： 灵敏度高 对流动相系统温度变化不敏感 可进行梯度洗脱 与光吸收检测器相比： 能解决最困难的 HPLC 检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检测 减低流动相溶剂的纯度要求 无需测定定量校正因子

高效液相色谱的主要分离方法

根据溶质的不同保留机理或色谱分离过程的物理化学原理，液相色谱的分离模式可分为 ：● 吸附色谱 (Adsorption Chromatography)

● 分配色谱（ Partition Chromatography ） ● 离子交换色谱（ Ion Exchanger Chromatog

r. ） ● 空间排阻色谱（ Size Exclusion Chromatog

r. ） ● 亲合色谱（ Affinity Chromatography ）

吸附色谱

Flow流动相

活性吸附点

固定相

液固吸附色谱

用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各组分依据它们在吸附剂上吸附力的大小来进行分离的色谱方法。

分配色谱

液液分配色谱

用涂渍在基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各组分依据它们在固定液中溶解能力大小，即在固定相和流动相间的分配系数大小来进行分离的色谱方法。

离子交换色谱

离子交换色谱

用离子交换剂作固定相，以具有一定 pH 值的缓冲溶液作流动相，样品中各离子组分依据它们与离子交换剂上荷电交换基团的交换能力大小来进行分离的色谱方法。

排阻色谱

排阻色谱

用化学惰性多孔物质作固定相，样品中各组分依据它们在流动相的分子体积大小来进行分离的色谱方法。以水溶液作流动相的排阻色谱称为凝胶过滤色谱（ GFC ）；以有机溶剂作流动相的排阻色谱称为凝胶渗透色谱（ G

PC ）。

亲合色谱

亲合色谱

在基体上固载化生物特异性吸附的配位体作固定相，以具有一定 pH 值的缓冲溶液作流动相，样品中各生物活性分子组分依据它们与固相基体上固载的配位体之间的特异亲合力大小来进行分离的色谱方法。

正相色谱（ Normal Phase Chromatograph

y ） 正相色谱采用硅胶、氧化铝或带有氰基、二醇基和氨基的极性固定相，非极性流动相操作模式，依据溶质分子的极性大小进行分离。溶质分子与固定相的硅醇基等极性基团产生特异的极性相互作用，极性相互作用大的保留时间大，反之保留时间小。 ◆ 硅胶吸附色谱（液固色谱） ◆键合相正相色谱（氰基和氨基柱）

正相色谱中色谱柱强度：硅胶柱 ≈ 氧化铝柱 > 氨基柱 > 二醇基柱 > 氰基柱

液固吸附色谱 液固色谱的分离基础是样品组分分子与固体吸附剂表面活性点上的竞争吸附以及组分分子与流动相分子的相互作用。 液固吸附色谱适合分离那些能溶于有机溶剂、具有中等分子量的组分 , 它能分离不同类型的化合物 , 如具有不同取代基 , 或取代基相同但其数目不同的化合物。 对于异构体的分离 , 液固吸附色谱比其它液相色谱有更高的选择性。如反相色谱中双键位置不同的异构体不能理想分离时 , 可选用硅胶吸附或涂渍银离子的硅胶吸附色谱分离。

一、原理 在吸附色谱过程中 , 样品分子通过色谱柱时 , 溶质的保留受到固定相的吸附力和流动相的溶解力 /“拉力”的竞争作用。对于硅胶极性吸附剂 , 诱导、氢键这样等是强烈的 , 为主要作用力 , 而色散力是微不足道的。

根据吸附顶替模型 , 在进行色谱分离时 , 吸附剂表面首先被溶剂分子覆盖形成一单分子层。当溶质分子从流动相引入后 , 则会顶替掉吸附剂表面上原来覆盖的溶剂分子而被吸附。

S E E

吸附色谱保留值的图解表示

X XXY YXX Y

A A A A A

取代苯样品在吸附点 A 上的定位

吸附剂表面被认为是均匀的，被吸附的分子是平躺在表面上的，所以每个吸附分子所需要的吸附面积可以从它的分子尺寸计算出来。因为溶质和溶剂分子的体积不一样 , 一般说来前者大于后者 , 因此溶质分子 (E) 与溶剂分子 (S) 在吸附剂表面上进行竞争吸附的吸附平衡过程为： EM ＋ nSS ES ＋ nSM

n = AS / AM

AE ：组分分子吸附在固定相表面上所需的吸附剂面积 ; AM：流动相分子吸附所需的吸附剂面积； n ：每吸附一个溶质分子需要顶替下来的溶剂分子数。

吸附过程的净吸附自由能： G = GE,S ＋ nGS,M － GE,M － nGS,S

右端的四个 G 分别表示溶质和溶剂在固定相和流动相的无量纲摩尔自由能。 在大多数吸附系统中 , 流动相的自由能项 GS,M和

GE,M 远小于吸附相的自由能项 GS,S 和 GE,S 。若不考虑流动相的影响 , 则 G = GE,S － nGS,S = S－ AE 容量因子 k’ 与单位重量吸附剂上被单分子层溶剂覆盖时的吸附体积 VS(系吸附剂比表面积的函数 ) 和 G 之间有如下关系

ln k’ = lg VS＋ G 为吸附剂的活性系数 , 取决于吸附剂的化学性质和水的覆盖量。不随实验条件变化而变化。所以 , ln k’ = lg VS＋ S－ AE 这说明液固吸附色谱中溶质的保留值与吸附剂的表面积 , 溶质的吸附能和溶剂强度 ( 按定义 , 单位活性吸附剂表面上溶剂的吸附能 , 即溶剂强度 )等有关。 考虑到溶质和溶剂间的相互作用 , Snyder 后来又在上式中加入一个二级溶剂效应修正项 , 以弥补忽略溶剂效应之不足。

二、流动相的选择

在硅胶吸附色谱中 , 对相对保留值和分离选择性起主导作用的是溶质与固定相的作用 , 流动相主要是调节溶质的保留值在适当范围内 , 对选择性的影响一般较小。 液固吸附色谱的流动相值要适当，常用正己烷、正庚烷为主 , 添加少量 CH2Cl2 、 CHCl3 、 CH3CN和 C

H3OH 。 值得注意的是，有机溶剂中的少量水对分离的影响。

三、样品分子结构对保留的影响 样品分子的结构决定它们在色谱柱上保留。而对于吸附色谱来说 , 主要取决于样品分子所含的官能团的类型及其数目。一些常见官能团的吸附强度大致如下：● 不吸附：烷烃● 弱吸附：烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳烃、卤代芳烃● 中等吸附：多环芳烃、醚、腈、硝基物、大多数羰基化合物● 强吸附：醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多官能团化合物 样品分子的保留还取决于溶质是否能与吸附剂取得最大程度的作用 , 即分子空间效应。例如：● 与官能团相邻的大烷基可能降低保留能力；（位阻效应）● 顺式化合物的保留能力可能比反式化合物强；● 对位化合物的保留能力可能比邻位化合物强等等。

四、应用举例 液固色谱的应用特点：● 液固色谱对具有不同极性取代基的化合物表现出较高的选择性，但对同系物的分离能力较差● 对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆吸附，液固色谱常不能获得满意的分离习惯。● 吸附剂的含水量对吸附剂活性、样品容量和保留值有较大影响 液固吸附色谱主要用于异构体的分离、族分离和制备色谱。 1 ．苯二胺异构体的分离 2 ．部分氢化菲的分离

NH2

NH2

NH2NH2

NH2 NH2

OH OH

H2N

NH2

习题 1 设计一液相色谱法分离苯二胺异构体（色谱类型、色谱柱、流动相、检测条件和出峰顺序等）习题 2 在液固色谱中，以硅胶为固定相，对以下四组分进行分离，最后流出色谱柱的可能是： a. 苯酚 b. 对羟基苯胺 c. 苯胺 d. 苯

1

2

10.6 反相键合相色谱

R R=H, CH3, (CH2)nCH3 n=1, 2, 3...

键合相色谱是目前 HPLC 中最常见的分离模式 , 约 80%的 HPLC 是采用键合相色谱柱完成的。 ● 烷基苯同系物分离分析 ● 多环芳烃分离分析

一、原理和分离对象1 ．正相色谱和反相色谱 键合相的种类比较多 , 有非极性、极性和离子交换基团 , 可使用于正相、反相和离子交换色谱。如氰基柱 , 即可用作正相色谱 , 又可用作反相色谱。2．反相键合相色谱的优缺点（ 1）反相键合相色谱的优点① 样品极性范围宽 , 有多种键合相可供选择；② 使用的溶剂相对便宜 , 平衡速度快；③ 离子或离解化合物可用离子对或离子抑制技术分析；④ 容易操作 , 分析速度更快 , 重现性更好。

（ 2）键合相的使用极限① 对于硅基键合相 , mp 的 pH 应控制在 2.5-7.5 ：pH<2.5, 键合相易脱落 ; pH>7.5, 硅胶可能溶解。② 残留的硅羟键可能吸附样品分子或杂质 , 引起拖尾 , 或 tR发生变化；3 ．反相键合相色谱的主要特点 ★ 柱稳定高、寿命长 ★ 溶剂相对便宜 ★ 流动相可控制条件较多，如溶剂强度范围大（从纯水到非极性溶剂，如 Hex），调整 pH 和 I等 ★ 含水体系有利于生物样品分析

二、流动相的选择 对于正相色谱 , 采用弱极性流动相 , 极性最弱的组分最先流出 , 增加流动相的极性将减少组分的保留。

根据流动相，反相色谱能区别为纯水溶液、混合水溶液和非水反相系统。 反相色谱中常用洗脱剂包括水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等，流动相的洗脱强度由有机溶剂浓度及其类型共同决定，这种影响见反相色谱溶剂强度图。 对于溶质在反相色谱中的保留值与强溶剂浓度的关系， Snyder认为 lgk与 %B 之间呈线行关系： lgk = lgkw-SØ

三、反相色谱的保留机理● 疏溶剂理论 ● 溶质保留值公式的讨论

正相色谱 反相色谱固定相 极性 非极性

流动相 非极性 极性

溶质分子与固定相作用力

极性作用力（偶极、氢键）“强烈”

色散力（非选择性）“微弱”

溶质分子与流动相作用力

色散力（非选择性）

极性作用力（偶极、氢键）

极性溶质 保留时间随极性增大而增大

小或难保留

非极性溶质 小或难保留 可保留，保留时间随极性减少而增大

（ 1 ）疏溶剂理论背景：单从溶质与固定相的非极性与非极性作用力是不能解释反相色谱的保留值大小的，因为这种作用力太弱了。相反，利用疏溶剂效应可以较好地解释反相色谱中关于保留值和选择性的规律。

疏溶剂理论的主要意思是：当一个非极性溶质或分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时 , 会相互产生斥力 , 自由能 (G)增加 , 这是一个熵减少过程。为了弥补熵的损失 , 溶剂分子中的非极性部分的结构取向将导致在极性溶剂中形成一个“空腔”。这种效应称为疏溶剂效应。

《结构化学基础》指出：疏水基团相互作用和氢键密切相关，是指极性基团间的静电力和氢键力使极性基团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，使疏水基团互相聚集所产生的能量效应和熵效应。在蛋白质分子中，疏水侧链基团如：苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等较大的疏水基团通常聚集在一起，形成疏水区，大部分存在于分子的内部，这种聚集在一起的作用力即为疏水基团相互作用。

+ +

疏水基团相互作用示意图

上图表示Ⅰ和Ⅱ两个疏水基团在水中相互结合后，从Ⅰ···Ⅱ间非极性面置换出来的水分子成无序状态，使体系的熵增加，减少自由焓 (-TΔS)，使两个非极性区域间的接触稳定化，这种缔合就是疏水相互作用的结果，每个亚甲基之间的作用能约达 3 kJ·mol 。

●“吸力是主动的”，如 GC 中烃类在非极性固定相上的保留大小与色散力有关，尽管它是微弱的，但它又是唯一的● 在极性溶剂中的两个非极性溶质的聚集在一起并非是它们之间的色散力起主导作用，换句话说，这种聚集并非是主动的，而是被迫的，是它们受到更大的极性溶剂作用（斥）力而被迫聚集在一起。

Horvath等人将疏水作用原理应用于反相高效液相色谱。 根据溶质、溶剂和固定相之间的能量平衡 , 导出了利用物质的一般物理化学性质预测反相色谱过程中溶质的保留值公式。基于这一模型 , 反相键合相表面被视为一层均匀的非极性烷基链配位基 , 溶质在反相色谱过程的保留主要不是由于溶质分子与键合相之间弱的非极性相互作用 , 而是由于溶质与极性溶剂之间的排斥力 , 促使溶质与键合相烃基发生疏水缔合。 非离子型溶质与键合相的非极性配位基之间的疏溶剂缔合是可逆的： S ＋ L SL

疏水作用力，缔合

极性作用力，解缔力

缔合作用强度和色谱保留取决于三方面因素： ★ 溶质分子中非极性部分的总表面积 ★ 键合相上烃基的总表面积 ★ 流动相的表面张力等性质 G = － RTln K ; k’ = KVS÷VM ; = VM÷VS ln k’ = － ln － G/RT 按疏溶剂理论，将来自假想气相中的溶质引入溶剂的溶解过程所需能量（自由能变化）包括两部分： 第一部分是相应于在溶剂中形成一个其大小和形状与溶质相适应的空腔所需要的能量 Gc；

第二部分是溶质进入空腔后与周围溶剂之间的相互作用能 Gint, 同时伴随有“自由体积”变化 RTln(RT/P0V), 即 G = Gc ＋ Gint＋ RT ln (RT/P0V) 其中 Gc = － AN － NAs(e － 1) 而 A = AS＋ AL－ ASL AS 、 AL 、 ASL ：分别为溶质、配位基和缔合物的表面积； A： S 和 L缔合时的表面积变化；：溶剂的表面张力： e ：把宏观表面张力转换成为微观的一个因子。 Gint包括两项 , 分子间范德华能对缔合的贡献和(Gv)和静电能的贡献 (Ge)：

Gint = Gv ＋ Ge Gv = － w－ a A Ge = Z / w和 a ：与溶剂有关的参数：：溶剂的介电常数 , 而 Z = ZSL－ ZS－ ZL Z：溶质、溶剂和缔合物的偶极距、电荷分布及分子大小等静电因素对缔合的综合贡献。合并 , 得 反相色谱溶质保留值公式： ln k’ = － ln ＋ 1/RT×[A(N＋a) ＋ NAs(e－ 1) ＋ W－ Z/]＋ ln (RT/P0

V) 这是 RPLC 中的重要推导公式，是否正确，要看它是否与实验事实相吻合？

（ 2）影响溶质保留的因素① 流动相 (项 ) 从疏溶剂理论得知 , 组分的保留随流动相表面张力的减少而减少 , 水的表面张力最大。 ln k’ H2O % , 或者有机溶剂 %增大 , 表面张力下降 , k’值随之下降。

在 ODS 柱上，用 70%甲醇 /水或 60%甲醇 /水洗脱苯系物，哪一种流动相的保留值大，为什么？

碳链增大 疏水性增大 保留越大

表面张力（极性）增大，保留增大

② 键合相 (A项 )： 烷基链长增加 , k’值随之增大。 同样是 70%甲醇流动相，苯在 C18或 C8柱上的保留值大，为什么？

③ 溶质● 离子化合物不被保留，如苯甲酸钠● 非离子化合物：极性大 , k’值小● 非极性化合物：分子表面积大 , k’值大● 同系物：链长增大 , k’值增大● 苯系物：环数增大 , k’值增大 ;● 若化合物的非极性部分相同 , 极性官能团增加 , 则 k’值下降● 几何异构体：能形成内氢键的异构体的化合物k’值大。

R R=H, CH3, (CH2)nCH3 n=1, 2, 3...

• 烷基苯同系物分离分析• 多环芳烃分离分析

出峰顺序？

如何选择色谱条件？

如何优化分离？

自学 “疏水效应和液相色谱中的计量置换保留机理”讨论题

耿信笃著，《现代分离科学理论导引》，高等教育出版社， 2001

1.疏水作用与溶剂化2.双组分流动相体系中的强溶剂和弱溶剂3. RPLC 、 NPC 、 IEC 、 HIC 和 AFC 中的溶质与固

定相间的相互作用4. lg I 、 Z 、 j和 Ø参数的意义 。。。。。。。