10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 1

Cytochrom P450, Polymorphismus, Transporter

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 2

Cytochrom P450, Polymorphismus, Transporter

Vom Dünndarm (small intesitine) aus gelangen aufgenom-mene Xenobiotica über die Pfort Ader (portal vein) in die Leber. Hier finden eine ganze Reihe von biochemischen Modifikationen statt.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 3

Cytochrom P450 Metabolismus (I)Zuerst: First pass effectVorwiedend lipophile oder schwere (MW >500) Verbindungen werden ekzessiv metabolisiert

Diese werden dadurch hydrophiler und damit leichter ausscheidbar gemacht.

CH3 COOHO N

H

COOH

phase I phase II

Verantwortlich für die als Phase I bezeichneten Reaktionen sind hauptsächlich eine Gruppe von Cytochrom P450 Enzymen (CYP).

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 4

Cytochrom P450 Metabolismus (II)Die Monooxygenierung der Substrate erfolgt in einem katalytischen Zyklus an einem Hämoglobin-Eisen (Fe)

Drug-RCYP

+ O2Drug-OR + H2O

NADPH NADP

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 5

Cytochrom P450 Metabolismus (III)

Die am Metabolismus beteiligten Cytochrome sind überwiegend Monooxygenasen, die evolutionär von der Steroid- und Fettsäuren-biosynthese stammen

Im Menschen wurden bisher 17 CYP-Familien mit ungefähr 50 Isoformen charakterisiert

Nomenklatur: CYP 3 A 4

Familie>40% Sequenz-homolgie Unterfamilie

>55% Sequenz-homolgie

Isoenzym

*15 A-B

Allel

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 6

Cytochrom P450 Gene families

CYP450

Human 14+

Plants 22

Insects 3

Fungi 11 Yeasts 2 Nematodes 3

Bacteria 18

Molluscs 1

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 7

Human cytochrome P450 family

Aus der Superfamilie der Cytochrome kommen folgende Familien im Menschen vor:

CYP 1-5, 7, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, 27, 39, 46, 51

CYP 1, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3 Metabolismus von Xenobiotica

CYP 2G1, 7, 8B1, 11, 17, 19, 21, 27A1, 46, 51 Steroid Metabolismus

CYP 2J2, 4, 5, 8A1 Fettsäuren Metabolismus

CYP 24 (Vitamin D), 26 (retinoic acid), 27B1 (Vitamin D), ...

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 8

Cytochrom P450 Enzyme (I)

Flavin Monooxygenase Isoenzyme

Alkohol Dehydrogenase

Aldehyd Oxidase

Monoamin Dehydrogenase (MAO)

Die Redoxaktivität wird durch ein Eisenporphyrin im aktiven Zentrum ermöglicht

Drug-RCYP

+ O2Drug-OR + H2O

NADPH NADP

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 9

Cytochrom P450 Enzyme (II)Trotz der niedrigen Sequenzidentität von CYP aus unterschiedlichen Organismen,ist die Tertiärstruktur hochkonserviert.

Gegenüber den bakteriellen CYP besitzen die microsomalen mammalian CYP eine zusätzliche Transmembranhelix als Membrananker

Überlagerung vonhCYP 2C9 (1OG5.pdb) undCYP 450 BM3 (2BMH.pdb) Bacillus megaterium

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 10

CYP distribution

CYP 2C1116%CYP 2E1

13%

CYP 2C66%

CYP 1A68%

CYP 1A213%

CYP 2A64%

CYP 2D62% other

7%

CYP 331%

CYP 3

CYP 2C11

CYP 2E1

CYP 2C6

CYP 1A6

CYP 1A2

CYP 2A6

CYP 2D6

other

Cytochrom P450 Enzyme (III)Die überwiegende Menge an CYP befindet sich in der Leber, aber auch in der Dünndarmwand kommen bestimmte vor.

Die mammalian CYP sind an das endoplasmatische Reticulum gebunden, also membranständig.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 11

Cytochrom P450 Enzyme (IV)Am Metabolismus von endogenden Stoffen sind vor allem CYP 3A4, CYP 2D6, und CYP 2C9 beteiligt.

Metabolic Contribution

CYP 2D630%

CYP 1A22%CYP 2C9

10%

other3%

CYP 3A455%

CYP 3A4

CYP 2D6

CYP 2C9

CYP 1A2

other

hepatic only

also small intestine

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 12

Substratspezifität der CYP (I)

Spezifische Substrate der einzelnen human CYP

CYP 1A2 verapamil, imipramine, amitryptiline,caffeine (arylamine N-oxidation)

siehe http://medicine.iupui.edu/flockhart/

CYP 2A6 nicotine

CYP 2C9 diclofenac, naproxen, piroxicam, warfarin

CYP 2C19 diazepam, omeprazole, propanolol

CYP 2D6 amitryptiline, captopril, codeine, mianserin, chlorpromazine

CYP 2E1 dapsone, ethanol, halothane, paracetamol

CYP 2B6 cyclophosphamid

CYP 3A4 alprazolam, cisapride, terfenadine, ...

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 13

Substratspezifität der CYP (II) Decision tree for human P450 substrates

CYP 1A2, CYP 2A-E, CYP 3A4

Lit: D.F.V. Lewis Biochem. Pharmacol. 60 (2000) 293

Volumelow high

CYP 3A4CYP 2E1

medium

pKaacidic

CYP 2C9basic

CYP 2D6

neutral

CYP 1A2, CYP 2A, 2B

planaritylow

CYP 2B6high

CYP 1A2

medium

CYP 2A6

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 14

Cytochrom P450 Metabolismus (IV)

Im Rahmen der präklinischen Entwicklung ist auch die Erfassung der Metabolite von Wirkstoffen notwendig, da diese u.U. toxisch sein können.

Dazu exprimiert man die entsprechenden CYP Enzymedurch Klonierung in E. coli, und verfolgt die Umsetzung der Wirkstoffe mittels Gaschromatographie und Massenspektroskopie.

Dies ermöglicht die selektive Bestimmung von Metaboliten durch einzelne Cytochrom P450 Enzyme, bzw. deren genetische Varianten.

Diese Ergebnisse werden dann mit den analogen in vivo Ergebnissen aus Tiermodellen verglichen.

Lit. zum Klonieren:R.Knippers, Molekulare Genetik 8.Auflage, Kapitel 10

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 15

Cytochrom P450 Polymorphismus

„Jeder Mensch ist (mehr oder minder) anderst“

D.h. der gleiche Genotyp läßt verschiedene Phänotypen zu(Diploider Satz an Chromosomen, differentielle Expression)

Der Genotyp widerum ist durch die individuelle DNA Sequenz bestimmt.

Der Phänotyp läßt sich anhand der tatsächlichen Aktivität oder der Menge des exprimierten Enzyms unterscheiden.

Entsprechend der metabolischen Aktivität unterscheidet man bei CYP normale (extensive metabolizer), schwache (poor metabolizer), und verstärkte (ultra-rapid metabolizer) Umsetzer.

Lit: K. Nagata et al. Drug Metabol. Pharmacokin 3 (2002) 167

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 16

Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

SNPs sind Unterschiede einer einzelnen Base in der DNA die innerhalb einer Population auftauchen.

Als Polymorphismus bezeichnet man Allele die bei mindestens 1% der Population auftreten. D.h. diese Genotypen sind regulär.

Im Gegensatz dazu bezeichnet man Veränderungen des Genoms die seltener als 1% auftauchen nur als Mutationen.

Typischerweise werden bei seltenen, ererbten Krankheiten Mutationen im kodierenden Bereich von DNA-Abschnitten festgestellt.

Lit: A.D. Rose Nature 405 (2000) 857.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 17

CYP 2D6 Polymorphismus (I)Am besten untersucht ist der Polymorphismus von CYP 2D6(Debrisoquine 4-hydroxylase)

Siehe: D.B.Goldstein et al. Nature Rev. Genetics 4 (2003) 937.

Lokalisiert auf Chromosom 22Von den 75 Allelen exprimieren 26 Proteine

siehe http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2d6.htm

Zuerst für die Umsetzung von debrisoquine und sparteine (Antipsychotica) beschrieben

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 18

CYP 2D6 Polymorphismus (II)

Lit: J. van der Weide et al. Ann. Clin. Biochem 36 (1999) 722

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 19

MGLEALVPLAVIVAIFLLLVDLMHRRQRWAARYPPGPLPLPGLGNLLHVDFQNTPYCFDQ

LRRRFGDVFSLQLAWTPVVVLNGLAAVREALVTHGEDTADRPPVPITQILGFGPRSQGVF

LARYGPAWREQRRFSVSTLRNLGLGKKSLEQWVTEEAACLCAAFANHSGRPFRPNGLLDK

AVSNVIASLTCGRRFEYDDPRFLRLLDLAQEGLKEESGFLREVLNAVPVLLHIPALAGKV

LRFQKAFLTQLDELLTEHRMTWDPAQPPRDLTEAFLAEMEKAKGNPESSFNDENLRIVVA

DLFSAGMVTTSTTLAWGLLLMILHPDVQRRVQQEIDDVIGQVRRPEMGDQAHMPYTTAVI

HEVQRFGDIVPLGMTHMTSRDIEVQGFRIPKGTTLITNLSSVLKDEAVWEKPFRFHPEHF

LDAQGHFVKPEAFLPFSAGRRACLGEPLARMELFLFFTSLLQHFSFSVPTGQPRPSHHGV

FAFLVSPSPYELCAVPR

CYP 2D6 Polymorphismus (III)

siehe http://www.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pl?P10635

poor debrisoquine metabolism S R impaired mechanism of sparteine

poor debrisoquine metabolism I

poor debrisoquine metabolism R

missing in CYP2D6*9 allele

P loss of activity in CYP2D6*7

T impaired metabolism of sparteine in alleles 2, 10, 12, 14 and 17 of CYP2D6

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 20

CYP 2D6 Polymorphismus (III) Variabilität der Debrisoquine-4-Hydroxylierung

N

NH

NH2 N

NH

NH2

HOH

CYP2D6

homocygote extensive metabolizers

= metabolic rate

= number of individuals (european population)

heterocygote extensive metabolizers

homocygote poor metabolizers

Lit: T. Winkler Deutsche Apothekerzeitung 140 (2000) 38

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 21

CYP 2D6 Polymorphismus (IV)

Der poor metabolizer Phänotyp hat Auswirkungen auf den Metabolismus von mehr als 25% aller gängigen Medikamente, da er zu einer erhöhten Konzentration nicht umgesetzer Xenobiotika führt.

Lit: M.P.Murphy et al. Pharmacogenetics 10 (2000) 583.

Deshalb wurde CYP2D6 Genotypisierung bereits zur Auswahl geeigneter Testpersonen für die Phase III in klinischen Studien eingesetzt:

Lamotrigine, Desipramine (Antidepressiva)

Lit: H.K.Kroemer & M.Eichelbaum. Life Sci. 56 (1995) 2285.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 22

Polymorphismus weiterer CYPs CYP 1A2 individuell; hohe, mittlere und langsame Umsetzung von caffeine

CYP 2B6 fehlt in 3-4 % der kaukasischen Bevölkerung

CYP 2C9 Defizit bei 1-3 % der kaukasischen Bev.

CYP 2C19 Individuen mit inaktivem Enzym (3-6 % der kaukasischen und 15-20 % der asiatischen Bevölkerung)

CYP 2D6 schwache Metabolisierer bei 5-8 % der europäischen, 10 % der kaukasischen und <1% der japanischen Bevölkerung. Überexpression (doppeltes Gen) bei Teilen der afrikanischen und orientalischen Bev.

CYP 3A4 nur geringe Mutationen im Zusammenhang mit dem Polymorphismus des MDR1 Transporter Gen

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 23

Genotypisierung von CYP P450 AllelenDie Firma Affymetrix (USA) hat unter Verwendung von immobilisierten synthetischen Kopien von P450 Nukleotiden Microarrays (Gen Chips) entwickelt, die die Indentifizierung aller klinisch relevanten Allele erlauben.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 24

Induktion und Regelung von CYP3A (I)

Man hat eine ganze Reihe von Xenobiotica gefunden die zur verstärkter Exprimierung von Enzymen der CYP3A Familie führen.

indinavir Antiviralefavirenz Antiviralcyclosporin Immunosuppressantcarbamazepine Anticonvulsantatorvastatin HMG CoA Reductase Inhibitor tamoxifen Antineoplastic, Anti-hormone

Diese binden an den pregnane X receptor (PXR)der als Transkriptionsfaktor die expression von des CYP3A Genes reguliert.

Lit: T.M. Wilson et al. Nature Rev. Drug Disc. 1 (2002) 259

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 25

Induktion und Regelung von CYP3A (II)

Der PXR Rezeptor wirkt als Heterodimer zusammen mit dem retinoid X receptor (RXR)

Als Folge der Induktion von CYP3A kommt es zu verstärktem Metabolismus der aufgenommenen Substanz.Im ungünstigsten Fall kommt es dadurch zu Nebenwirkungen, wie etwa Leberentzündung.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 26

RXR und weitere nukleare Rezeptoren (I)

Als spezifischen, endogenen Aktivator von RXR hat man 5-pregnane-3,20-dione gefunden.

Im Gegensatz dazu ist PXR sehr viel weniger spezifisch und wird sowohl von Glucocorticoiden als auch von Anti-Glucocorticoiden aktiviert.

Der unspezifische constitutive androgen receptor (CAR) findet sich dagegen im Cytoplasma und dimerisiert erst im Nucleus mit RXR. Analog zu PXR wird hier das CYP2B Gen reguliert.

Ebenfalls hohe Sequenzhomologie wurde für den vitamin D receptor (VDR) der CYP27 reguliert, und für den arylhydrocarbon receptor (AHR) (Dioxin Rezeptor) gefunden.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 27

RXR und weitere nukleare Rezeptoren (II)

Diese nuklearen Rezeptoren gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren. Jeder besitzt eine doppelte Zink-Finger DNA-Bindungsdomäne (DBD), sowie eine größere Carboxy-terminale Ligandenbindungsdomäne (LBD).

Da ihre Liganden erst später gefunden wurden, werden sie als orphan nuclear receptors bezeichnet.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 28

Human Orphan Nuclear Receptors

Receptor (Gene ID) Natural ligand (synthetic ligand)

CAR (NR1I3) 3,5-AndrostanolCOUP (NR2F1) –ERR (NR3B1) (4-Hydroxytamoxifen)FXR (NR1H4) Chenodeoxycholic acidHNF4 (NR2A1) Palmitic acidLRH (NR5A2) – PPAR (NR1C1) Eicosapentaenoic acidPXR (NR1I2) 5-Pregnane-3,20-dione, (Rifampicin)ROR (NR1F1) Stearic acidRXR (NR2B1) 9-cis-RNA

Auswahl, mehr in der angebenen Literatur

Lit: T.M.Wilson & J.T. Moore Mol. Endocrin. 16 (2002) 1135.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 29

Induktion und Regelung von CYP3A (III)

Hyperforin, der natürliche Bestandteil des St. John‘s wort (Johanniskraut, Hypericum performatum) zeigt die bisher höchste gemessene Affinität zu PXR (Kd = 27 nM)

O

O

OH

O

Anwendung: Heilmittel gegen Gallestauung (cholestasis) sowie als mildes Antidepressivuum

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 30

Induktion und Regelung von CYP3A (IV)Struktur von PXR mit Hyperforin (1M13.pdb)

Lit: R.E. Watkins et al. Biochemistry 42 (2003) 1430

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 31

Induktion weiterer CYP

CYP 1A2 omeprazole, insulin, aromatic hydrocarbons (cigarette smoking, charbroiled meat)

CYP 2C9 rifampicin, secobarbital

CYP 2C19 carbamazepine, prednisone

CYP 2D6 dexamethason

CYP 2E1 ethanol, isoniazid

CYP 3A4 glucocorticoide, phenobarbitone, rifampicin, nevirapine,

sulfadimindine, nevirapine, sulfinpyrazone, troglitazone

Führt zu erhöhter Coffein-Konzentration im Plasma wenn man aufhört zu Rauchen

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 32

Typische Inhibitoren von CYP (I)

CYP 1A2 cimetidine, ciprofloxacine, enoxacine...grapefruit juice (naringin, 6‘,7‘-dihydroxy-bergamottin)

CYP 2C9 chloramphenicol, amiodarone, omeprazole,...

CYP 2C19 fluoxetine, fluvastatin, sertraline,...

CYP 2D6 fluoxetine, paroxetine, quinidine, haloperidol, ritonavir,...

CYP 2E1 disulfiram, cimetidine,...

CYP 3A4 cannabinoids, erythromycin, ritonavir, ketokonazole, grapefruit juice

siehe http://medicine.iupui.edu/flockhart/

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 33

Transporter (I)Im Gegensatz zur passiven Diffusion durch Membranen, bewirken Transporter verstärkten influx in, oder efflux aus Kompartimenten, wobei ATP verbraucht wird.

Lit: A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001) 469

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 34

Transporter (II)Membranständige Transporter die an der Pharmakokinetik von endogenden Stoffen beteiligt sind

Lit: M.K.Leabman et al. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100 (2003) 5896

Superfamilien:

solute carriers (SLC)

ATP-binding cassette (ABC)

P-type ATPase

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 35

Struktur von Membrantransportern

Membrantransporter sind Proteine mit teilweise über 12 Transmembranhelices die über Loops verbunden sind. Bisher gelang die Strukturaufklärung mittelsX-ray noch bei keinem Transporter.

Lit: M.K.Leabman et al. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100 (2003) 5896

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 36

P-glycoprotein

P-gp gehört zur Familie der multidrug resistant proteins (MDR) und wird von dem MDR1 Gen kodiert.

Insbesondere die Bioverfügbarkeit von Psychopharmaka wird limitiert durch den Rücktransport aus dem Gehirn in den Blutkreislauf.

Transport von Stoffen aus der Leber in den gastrointestinalen Trakt (bilary excretion) z.B. vonIndinavir

Die Überexpression von P-gp führt bei Krebszellen zu Resistenz gegen Antineoplastica.

Lit: A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001) 469.A.Seelig Eur.J.Biochem. 251 (1998) 252.

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 37

Transportproteine für Organische Ionen

Dazu gehören die Familien der

Organic Anion Transporter (OAT) und der

Organic Cation Transporter (OCT)

Diese sind vor allem an der Ausscheidung hydrophiler Katabolite beteiligt

Lit: A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001) 469

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 38

Transportproteine für influx

Es gibt aber auch Transporter für die aktive Aufnahme von Stoffen aus dem Dünndarm

Pept1 (intestinal peptide transporter) Transmembranprotein mit 12 TM-HelicesVerantwortlich für Stickstoffaufnahme !

Substrate: kleine Peptide (Di- und Tripeptide, sowie Verbindungen mit Peptidcharakter, z.B. Captopril)

N

OH

O

O

SHCH3

10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 39

Polymorphismus bei TransporternAuch Transporter weisen erhebliche genetische Variationen auf:

Gen Protein / Funktion

ABCB1 (ATP-binding cassette subfamily B member 1) P-gp efflux

SLC6A3 (Dopamine Transporter) Neurotransmitter

SLC6A4 (Serotonin Transporter) Neurotransmitter

ADRB2 (-adrenergic receptor) Rezeptor für Betablocker

ALOX5 (Arachidonate 5-lipoxygenase) Biosynthese von Leukotrienen

Siehe: D.B.Goldstein et al. Nature Rev. Genetics 4 (2003) 937.