PCD (2) 04.07.2016.ppt [Kompatibilit tsmodus]) · 3 Cytochrom c-Freisetzung Durch...

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1 Programmierter Zelltod (Programmed Cell Death, PCD) „can‘t live with it, can‘t live without it“ programmed cell death“ (PCD) Apoptose bei Tieren (phagocytotischer Zelltod) Autophagocytotischer Zelltod (vorherrschend bei Pflanzen, selten bei Tieren) „Hypersensitiver Zelltod“ (HR) bei der pflanzlicher Abwehr „unkontrollierter“ Zelltod nekrotischer Zelltod Formen des Zelltods Vorlesung E. Weis Kein festgelegte zelluläres oder genetisches Programm weder eigene noch fremde Lysosomen treten in Aktion Ausgelöst durch Hitze oder andere extreme abiotische Stress- Einwirkungen. Zellmembranen werden undicht, die Zelle läuft aus! (messbar durch „ion leakage“) Nekrotischer Zelltod Vorlesung E. Weis Programmierter Zelltod (PCD) Zellulärer Suizid (bei allen Eukaryoten!) kommt bereits bei Einzellern vor (z.B. Protozoen) komplexere Formen bei Metazoen Energie-abhängig & genetisch programmiert ausgelöst durch spez. intra- und extrazelluläre Signale Vorlesung E. Weis Zell-Differenzierung (z.B. Xylem- und Aerenchym-Bildung) Organbildung - Beseitigung überschüssiger Zellen, z.B. Suspensor (Embryonalentwicklung), Calyptra (Wurzelspitze), Trichome (Blatt) Beseitigung geschädigter Zellen z.B. bei Mitose oder nach Stress Seneszenz Abwehr Pflanzliche Prozesse, bei denen PCD eine Rolle spielt Vorlesung E. Weis, Abb. aus Buchanan ed. Biochem Mol. Biology of Plants Externe vs. interne Induktion der Apoptose Vereinfacht & verändert nach Ashkenazi A. (2002) Nat. Rev. Can. 2:420–430. Caspase 3, 6, 7 Apoptosis Pro-apoptotischer Ligand (tumor necrosis factors Cytokine) Caspase 9 Caspase 8, 10 p53 Mitochondria Cytochrome c DNA damage FADD DR5 DR4 Extrinsischer Weg nach extrazellulärer Liganden-Bindung Pro-caspase 8, 10 Intrinsischer Weg schließt p53 (Kern) und Cytochrom c (Mitochondrien) ein (Death cell receptors) MERKE: Beide Induktionswege münden in einer Caspase-Kaskade Tnf- β Nucleus

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Programmierter Zelltod (Programmed Cell Death, PCD)

„can‘t live with it,

can‘t live without it“

„programmed cell

death“ (PCD)

� Apoptose bei Tieren (phagocytotischer Zelltod)

� AutophagocytotischerZelltod (vorherrschend bei Pflanzen, selten bei Tieren)

� „Hypersensitiver Zelltod“ (HR) bei der pflanzlicher Abwehr

„unkontrollierter“

Zelltod

� nekrotischer Zelltod

Formen des Zelltods

Vorlesung E. Weis

� Kein festgelegte zelluläres oder genetisches Programm

� weder eigene noch fremde Lysosomen treten in Aktion

� Ausgelöst durch Hitze oder andere extreme abiotische Stress-

Einwirkungen.

� Zellmembranen werden undicht, die Zelle läuft aus!

(messbar durch „ion leakage“)

Nekrotischer Zelltod

Vorlesung E. Weis

Programmierter Zelltod (PCD)

� Zellulärer Suizid (bei allen Eukaryoten!)

kommt bereits bei Einzellern vor (z.B. Protozoen)

komplexere Formen bei Metazoen

� Energie-abhängig & genetisch programmiert

ausgelöst durch spez. intra- und extrazelluläre Signale

Vorlesung E. Weis

� Zell-Differenzierung (z.B. Xylem- und Aerenchym-Bildung)

� Organbildung - Beseitigung überschüssiger Zellen, z.B. Suspensor

(Embryonalentwicklung), Calyptra (Wurzelspitze), Trichome (Blatt)

� Beseitigung geschädigter Zellen

z.B. bei Mitose oder nach Stress

� Seneszenz

� Abwehr

Pflanzliche Prozesse, bei denen PCD eine

Rolle spielt

Vorlesung E. Weis, Abb. aus Buchanan ed. Biochem Mol. Biology of Plants

Externe vs. interne Induktion der Apoptose

Vereinfacht & verändert nach Ashkenazi A. (2002) Nat. Rev. Can. 2:420–430.

Caspase 3, 6, 7

Apoptosis

Pro-apoptotischer Ligand (tumor necrosis factors � Cytokine)

Caspase 9

Caspase 8, 10

p53

Mitochondria

Cytochrome c

DNA damage

FADD

DR5

DR4

Extrinsischer Weg

nach extrazellulärer

Liganden-Bindung

Pro-caspase 8, 10

Intrinsischer Weg

schließt p53 (Kern)

und Cytochrom c

(Mitochondrien) ein

(Death cell receptors)

MERKE: Beide Induktionswege münden in einer Caspase-Kaskade

Tnf-β

Nucleus

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Caspasen vermitteln beim apoptotischen Zelltod

Caspases: cysteine aspartate-specific proteases

� Konservierte Cystein-Protease-Familie

� Proteolytische Aktivierung aus inaktiven Vorläufern

(Pro-Caspasen)

� Caspase-Kaskade

� schneiden von Ziel-Proteinen an Asparaginsäure (Asp)-Resten

� dadurch werden Apoptose-relevante Proteine aktiviert

� „Caspase-like proteases“ auch in Pflanzen, Pilzen und Protozoen

http://www.biooncology.com/bioonc/images/apoptosis-image-lg.jpg

Drei Aktivierungsprinzipien:

1. Externe Aktivierung über

„cell-death receptors“

2. Interne Aktivierung durch

DNA-Schäden (vermittelt

durch p53 im Kern)

3. Aktivierung durch ROS

Vorlesung E. Weis

Apoptotischer Zelltod (in Tieren)

Rezeptor-abhängige Caspase-Aktivierung

Vorlesung E. Weis

Auf der cytosolischen Seite veranlassen

aktivierte “cell-death receptors”, dass

Pro-Caspase 8 und 10 in aktiveCaspasen umgewandelt werden.

Der mitochondriale Weg

Intrinsische Signale (p53) führen

zur Bildung von Poren in der

Mitochondrien-Hülle und

Freisetzung von Cytochrom c.

(aber auch extrinsiche Signalekönnen zur Freisetzung von

Cytochrom c führen).

Vorlesung E. Weis

Freigesetztes Cytochrom c aktiviert weitere Caspasen.

+ ATP

Aktivierung von Pro-Caspase 9:

� Cytochrom c bindet an Apaf-1 Proteine

� Apaf-1/Cyt. c- Komplexe bilden ein

„Apoptosom“, an welchem Pro-

Caspase 9 zu Caspase 9 aktiviert wird

(erfordert ATP!)

� Caspase 9 aktiviert weitere Caspasen

(3, 6 & 7) � Zelltod (Apoptose)

Der mitochondriale Weg

Vorlesung E. Weis

Merkmale der tierischen Apoptose

� Kern-Fragmentierung

� Ausbildung „apoptotischer Körper“ (→ Zelltod)

� Phagozytose durch Macrophagen (oder andere Zellen)

� Lysosomaler Verdau (hier: Fremdverdau!)

Vorlesung E. Weis;

Abb aus Lam E. (2004): Controlled cell death, plant survival and development. Mol. Cell Biology 5, 305-315.

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3

� Cytochrom c-Freisetzung

� Caspase-Aktivierung

� Aktivierung Apoptose-spezifischer Endonucleasen

Molekulare Merkmale der Apoptose

DNA-Leitern(im Agarose-Gel)

Vorlesung E. Weis

Nachweis von apoptotischem Zelltod

TUNEL-Nachweis

TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling

Durch apoptotische Endonukleasen enstehen

3´OH-Enden, die mithilfe der Terminal deoxy-

nucleotidyl-Transferase (TdT) markiert werden

können (Einbau von biotinylierten Nukleotiden).

Detektion im Gewebe mittels Fluoreszenz-Mikroskopie

http://www.nature.com/ki/journal/v65/n6/images/4494517f8.gif

Vorlesung E. Weis

DNA laddering

Durch apoptotische Endonukleasen entstehen Oligo-

nukeotid-Fragmente (oder Vielfache davon), die bei

Gelelektrophorese charakteristische Leitern erzeugen

(Regelmäßigkeit durch Besetzung mit Histonen).

Autophagozytotischer Zelltod in Pflanzen durch

Selbstverdau

� Verdau zellulärer Bestandteile/Organellen durch das zelleigene

System, lytische Vakuolen in Pflanzen (Lysosomen in Tieren)

� vakuoläre Cystein-Proteasen (Teil der „vacuole processing enzymes“, VPEs) mit Caspase-ähnlicher Wirkung („caspase-like proteases“), aber

unterschiedlicher Kompartimentierung („echte“ Caspasen im Cytosol).

� 3 Unterformen: „Mikro“-, „Makro“- und „Mega“-Autophagozytose

Vorlesung E. Weis; Abb. aus Lam E. (2004): Controlled cell death, plant survival and development. Mol. Cell Biology 5, 305-315.

„Mikro“-Autophagozytose

� Verdau kleiner Bestandteile des Cytosols

� Kommt bei Pflanzen und Tieren vor (Schutz vor Verhungern)

� Noch reversibel!

Lebende Zelle Zelltod

Zellkern Vakuole (Lysosom)Mitochondrium

ER

Golgi

Abb. aus: Doorn, van W. et al. (2005): Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in plant science 3, 117-122.

Bei Tieren kommt zwar auch Mikro-Autophagozytose vor, aber es wird keinAutophagozytotischerZelltod beobachtet!

„Makro“-Autophagozytose

� Verdau ganzer Organellen

� Einschluss der Organellen in Autophagosomen (mit Doppelmembran!)

� Fusion mit Vakuole(n)

� Irreversibel (→ Zelltod)

Lebende Zelle Zelltod

Autophagosom

Vakuole

Vorlesung E. Weis; Abb. aus: Doorn, van W. et al. (2005): Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in plant science 3, 117-122.

„Mega“-Autophagozytose

� Einschluss und Verdau des gesamten Cytoplasmas in der Vakuole

(Kollaps des Protoplasten)

� Typisch bei Entwicklung und Organdifferenzierungen

� Irreversibel (→ Zelltod)

Lebende Zelle Zelltod

Vorlesung E. Weis; Abb. aus: Doorn, van W. et al. (2005): Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in plant science 3, 117-122.

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Beispiele für autophagozytotischen Zelltod

in Pflanzen

Roberts and McCann, 2001Gunawardena et al., 2004

„leaf shaping“ Xylogenese � Differenzierung in männliche &

weibliche Blütenorgane

� Seneszenz

� Wurzelhaube (Verschleimen)

� ...

http://agritech.tnau.ac.in/seed/seedconcepts.html

http://virtualplant.ru.ac.za/Main/ANATOMY/onionrt.jpghttp://www.angenetik.fu-berlin.de/agkunze3/AGK3_research.html

Beispiele für autophagozytotischen Zelltod

in Pflanzen

Vorlesung E. Weis; Abb. aus: E. Lam 2004 Mol. Cell Biology (Nature Reviews) 5 (Controlled Cell death, Plant survival and Developement)

Hypersensitiver Zelltod in Pflanzen

� Noch einige apoptotische Merkmale, wie z.B.

- DNA-Spaltung in regelmäßige Fragmente (� laddering)

- Chromatin-Kondensation

- Cytochrom c-Freisetzung (aus Mitochondrien)

- Aktivierung von „Caspase-like“-Proteasen

� Schrumpfen von Vakuole und Protopast (aber keine apoptotischen Körper!)

� schnell (Minuten bis wenige Stunden)!

Vorkommen: z.B. bei der pflanzlichen Abwehr als „Hypersensitive Reaktion“ = HR

Nachweis mittels Propidium-Jodid ⇒ violett (rote Fluoreszenz: Chlorophyll).

3 hpi 6 hpi 9 hpi 12 hpicontrol

� Propidium-Jodid ist (wie Ethidium-Bromid) ein DNA-Farbstoff

� Über die desintegrierten Membranen gelangt es nur in tote Zellen

� Dort interkaliert der Farbstoff zwischen gestapelte Basen(paare)

Vorlesung E. Weis

Entwicklung des Hypersensitiven Zelltods (HR)

nach Infektion eines Tabakblattes

In den sterbenden Zellen ist das Schrumpfen des Cytosols zu erkennen (weißer Pfeil)(hpi : hours post infection)

„Cross talk“ bei Induktion von PCD in Pflanzen

„schnell“ versus „langsam“

ROS, SAROS, SAParasiten,

Infektion

Parasiten,

Infektion

z.B. Verwundung,

Entwicklung

(Seneszenz)

z.B. Verwundung,

Entwicklung

(Seneszenz)

EthylenEthylen

ROS, JAROS, JAAutophagozytotischer Zelltod

⇒ langsam!

Autophagozytotischer Zelltod

⇒ langsam!

Hypersensitiver Zelltod (HR)

⇒ schnell!Hypersensitiver Zelltod (HR)

⇒ schnell!

� Vergl. auch Vorlesung zur „Abwehr“

Apoptose-„like“

„Selbstverdau“