03 Amino Asitler, Peptitler Ve Proteinler II

7/29/2019 03 Amino Asitler, Peptitler Ve Proteinler II

1/35

AMNO ASTLER, PEPTTLER VE PROTENLER II:

Peptitler ve Proteinler

1


2/35

Peptitler amino asitlerden olumu zincirlerdir.

ki amino asit molekl bir amit ba ile kovalent olarak

birbirine balandklarnda bir dipeptit oluur.

Bu ban oluumu iin bir amino asidin -karboksi grubundanve dier bir amino asidin -amino grubundan bir molekl suyunayrlmas gerekir.

2


3/35

Peptit ba oluumu bir kondensasyon reaksiyonudur.

Biyokimyasal artlar altnda bu reaksiyonun dengesi amino asitoluumu ynndedir.

Reaksiyonun termodinamik olarak tercih edilir hale gelmesi iinkarboksil gruplar kimyasal olarak aktive edilmelidir.

amino asit iki peptit ba ile birbirlerine balandklarnda bir

tripeptit ve benzer ekilde drt amino asitten tetrapeptit ve be aminoasitten pentapeptit oluur.

Genellikle 8 ve zeri amino asitten oluan peptitler oligopeptit olarakisimlendirilirler.

20 ve zeri amino asitten oluan peptitler ise polipeptit olarakadlandrlrlar.

boyutlu yapya katlanarak bir fonksiyon gsteren polipeptitlereprotein ad verilir. 3


4/35

Peptit yapsnda yer alan bir amino asit birimi (amino grubundan birhidrojen atomu ve karboksi grubundan bir hidroksil moleklkaybetmi olan ksm) genellikle amino asit kalnts olarak adlandrlr.

Uta serbest bir -amino grubu tayan amino asit kalnts aminoterminali veya N-terminali olarak, serbest bir -karboksil grubu tayanamino asit kalntsna karboksi terminali veya C-terminali denir.

4


5/35

5

Peptitler zincirin her iki ucunda

serbest bir amino ve serbest bir

karboksil grubu tarlar.

Bu gruplar pKa deerlerinin altndave stnde farkl yklenirler.

Ayrca zincir iindeki iyonlaabilen

yan gruplara sahip amino asitkalntlar da pKa deerlerinin altndave stnde farkl yklenirler.

Peptit ba oluumuna katlanamino ve karboksil gruplar ise ykalamazlar.


6/35

6

Kk peptitler olduka dk hcresel konsantrasyonlarda etkilerinigsterirler.

Nonapeptit oksitosin ve bradykinin vcutta hormon olarak grev alr.

Pek ok antibiyotik peptit yapldr, ayrca amanitin gibi mantarzehirleri de kk peptitlerdir.

Daha fazla amino asit saysna sahip olan insulin ve glukagonpolipeptit hormonlardr.

Proteinlerin amino asit saylar son derece farkllk gsterebilir.

Baz proteinler tek polipeptitten oluurken (oklu alt niteli),dierleri bir veya daha fazla polipeptidin kovalent olmayan balarla bir

araya gelmesiyle olumutur.

Bir oklu alt niteli proteini oluturan polipeptit zincirlerinden her

birine alt nite ad verilir.


7/35

7

Baz proteinler birbirlerine kovalent balarla (genellikle dislfit)balanm polipeptit zincirlerinden olumutur.

Bu durumda proteini oluturan her bir polipeptit alt nite olarak

deil zincir olarak isimlendirilir.

Polipeptitler kuvvetli asitlerle stlmak suretiyle tamamenkendilerini oluturan amino asitlere hidrolizlenebilirler.

Her bir polipeptit iin elde edilen amino asitlerin bileimikarakteristiktir.

Ancak hidroliz tek bana yeterli deildir, baz yan reaksiyonlar

nedeniyle baz amino asitlerin tayini zordur.

Asparajin ve glutamin ilem srasnda aspartat ve glutamatadnrken, triptofann yan zinciri tamamen degrade olur. Serin,treonin ve tirozinin kk bir ksm ise paralanr.


8/35

8

Pek ok protein sadece amino asit kalntlarndan olumutur.Byle proteinlere basit proteinler denir.

Ancak, baz proteinler kalc olarak baka molekllerlebirlemilerdir. Bu tr proteinlere konjuge proteinler ad verilir.

Konjuge amino asitler alanm olan gruba bal olaraklipoproteinler, glikoproteinler ve metaloproteinler gibi gruplara

ayrlabilirler.

Proteinler grevlerini yerine getirebilmeleri iin boyutlu

yapya katlanmak zorundadr.

Proteinler, boyutlu yaplarnn incelenebilmesi amacyla drttemel yapya ayrlrlar.


9/35

9

Bir polipeptit zincirinde birbirine kovalent ba ile balanmamino asit kalntlar o polipeptidin primer yapsn oluturur.

Primer (birincil) yap iin en nemli ge o polipeptidin amino

asit dizilimidir (sekuansdr).

Sekonder (ikincil) yap amino asitlerin birbirini tekrar edenkararl dzenlenmelere sahip olmasyla ortaya kar.


10/35

10

Tersiyer yap proteinlerin boyutlu yapya naslkatlandklarnn bilgisini verir.

Bir protein birden fazla alt birimden oluuyorsa bu altbirimlerin boluktaki yerleimleri kuaterner yapy oluturur.

Protein yap ve fonksiyonu hakkndaki bilgilerimiz ayr ayr

proteinler zerinde yaplan almalardan elde edilmitir.

Bir proteini ayrntl olarak alabilmek iinaratrmaclarn bu proteini dier proteinlerden

ayrabilmeleri gereklidir.

Proteinleri ayrmak iin boyut, yk ve balanmaspesifiklii gibi proteinlerin farkl zelliklere sahip

olmasndan yararlanlr.


11/35

11

Protein kayna genellikle bir doku veya hcredir.

Protein saflatrma yntemlerinin ilk basama hcrelerinparalanarak almas ve ilerindeki proteinlerin zeltiye

alnmasdr.

Bu zeltiye ham ekstrakt ad verilir.

Fraksiyonlama yapmak veya spesifik organelleri izole etmek

amacyla kademeli (diferansiyel) santrifj uygulanabilir.

Dokular izotonik bir skroz zeltisi iinde mekanik olarakhomojenize edilir.

Kk ve byk molekller farkl hzlarda santrifj uygulanarakbirbirinden ayrlabilir.

Farkl younluktaki moleklleri birbirinden ayrmak iin farkl

younluk gradyenti oluturularak izopiknik santrifj uygulanr


12/35

12


13/35

13

Ekstrakt veya organel hazr olduunda ierdii proteinlerdenbir veya daha fazlasn saflatrmak zere fraksiyonasyon ielmleriuygulanr.

Bu amala pH, scaklk, tuz konsatrasyonu ve iyonik iddetin birfonksiyonu olan protein znrlnden yararlanlarak tuzlafraksiyonlu ktrme kullanlr.

Genellikle amonyum slfat kullanlarak proteinler fraksiyonluolarak ktrlrler.

Bu amala protein ieren zeltiye belli bir yzde iin

hesaplanm olan amonyum slfat miktar kat olarak eklenir.

Farkl amonyum slfat doygunluklarnda farkl proteinler ker.


14/35

14

Eer amonyum slfat ile ktrme ile fraksiyonlama yaplmsadaha sonraki ilemleri bozaca iin tuzun uzaklatrlmas gerekir.

Bu amala diyaliz ileminden yararlanlr. Yar geirgen bir zarkullanlarak proteinler tuz ve dier kk molekllerdenkurtarlabilir.


15/35

15

Proteinleri fraksiyonlamak iin kullanlan en gl yntemkolon kromotografisidir.

Uygun kimyasal zelliklere sahip porlu kat bir madde (sabitfaz) kolona doldurulur ve tamponlanm bir zelti (hareketli faz)sabit fazn iinden geer.

rnei ieren zelti kolonun yzeyinden tatbik edilir ve mobil

fazla tanarak kolonun iine doru ilerler.

Kimyasal ve fiziksel zelliklerine gre sabit fazla en fazlaetkileen molekller en yava olarak ilerlerken, sabit fazla en az

etkileen molekller en hzl olarak ilerler.

Benzer ekilde hareketli fazla etkileimler de ilerlemnin hzntayin eder.

Bu ekilde farkl proteinler bantlar halinde elde edilir


16/35

16


17/35

17


18/35

18

yon deiim kromatografisinde belirli bir pHda proteinlerinfarkl net elektrik ykne sahip olmalar esasna dayanarakayrma yapar.

Ayrmay optimize etmek iin mobil fazn iyonik gc kademeliolarak arttrlr.

Jel geirgenlik (molekler elek) kromatografisinde proteinler

boyutlarna gre ayrlrlar.

Bu amala genellikle Sephadex olarak bilinen belirli byklkteporlara sahip boncuklar sabit faz olarak kullanlr.

Affinite (ilgi) kromatografisi proteinleri balanma zelliklerinegre ayrr.

lgilenilen proteine spesifik olarak balanabilecek doru dolgu

maddesinin seimi son derece nemlidir.


19/35

19

En gelimi kromatografikyntemlerden birisi de

yksek-perfromans svkromatografisidir (HPLC).

HPLC ynteminde yksekbasnl pomplar ve elik

kolonlar kullanlarakdeneme sresini ve deneysonunda elde edilen

znrl nemli lde

arttrr


20/35

20

Proteinlerin ayrlmasnda kullanlan bir baka nemli teknik,ykl proteinlerin bir elektrik alanda g etmesi esasna dayananelektroforezdir.

Elektroforez, daha basit metotlar mevcut olduundan dolaygenellikle byk lekli protein saflatrlmasnda kullanlmaz.

Ancak proteinlerin bir arada grnr hale getirilmesini veayrlmasn saladndan son derece nemli bir analitikmetottur.

En yaygn olarak kullanlan protein elektroforez metotu

Sodyum dodesilslfat- Poliakrilamit jel elektroforezidir (SDS-PAGE).

Bu yntemde proteinler SDS tarafndan eksi ykle kaplandklar

iin ayrm sadece proteinin molekl arlna gre olur.


21/35

21

ki boyutlu SDS-PAGE ynteminde ise proteinler nceizoelektrik noktalarna daha sonra ise molekl arlklarna greayrldklar iin znrlk ve hassasiyet ok daha yksektir.


22/35

22

Eer bir enzim saflatrlyorsa, her bir saflatrmabasamandan sonra, enzim aktivitesi ve toplam protein miktarbelirlenir.

Bu iki miktar arasndaki oran spesifik aktiviteyi belirler.

Genellikle her bir saflatrma admnda aktivite azalrkenspesifik aktivite artar.


23/35

23

Bir proteinin saflatrlmas, yap ve fonksiyon aratrmalar iin ilk

basama tekil eder.

Bir proteinin primer yaps o protein hakknda nemli bilgiler tar.

Primer yap bir proteinin kendisine zg boyutlu yapya naslkatlanacann bilgisini tar ve bu boyutlu yap proteininfonksiyonunu belirler.

Farkl fonksiyonlara sahip olan proteinler farkl amino asitdizilimlerine sahiptir.

nsanlarda grlen binlerce genetik rahatszlk hatal proteinlerin

olumasyla etkilerini gsterir. Bu hatal proteinlerin te birinde aminoasit diziliminde sadece tek bir deiiklik vardr.

Farkl trlerdeki benzer grevli proteinlerin yaplar incelendiindebu proteinlerin benzer amino asit dizilimlerine sahip olduklar grlr.


24/35

24

Bununla birlikte amino asit dizilimi her protein iin sabitdeildir.

nsanlardaki proteinlerin %20 ila %30unun polimorfik olduutahmin edilmektedir.

Polimorfik proteinler insandan insana farkl amino asitdizilimlerine sahip olabilirler.

Polimorfik proteinlerde grlen sekuans farkllklar genellikleproteinin grevini yerine getirmesinde bir sorun tekil etmezler.

Protein yapsnda baz blgeler o proteinin boyutlu yapyakatlanmasnda ok nemli grevler aldklarndan korunmulardr.

Bi t i i i it di ili i ki l l k t i dil bildii ibi


25/35

25

Bir proteinin amino asit dizilimi kimyasal olarak tayin edilebildii gibikendisine karlk gelen genin nkleotid dizilimi kullanlarak daaydnlatlabilir.

Gnmzde pek ok tre ait binlerce proteinin amino asit dizilimiaydnlatlmtr.

Amino terminal amino asidini tanmlanmas iin 1-floro-2,4-dinitrobenzen (dinitroflorobenzen, DNFB, Sanger Reaktifi), dansil klorr

ve dabsil klorr gibi farkl reaktifler gelitirilmitir.

Amino terminali reaktif ile iaretlendikten sonra peptit hidrolizlenirve iaretli olan amino asit tanmlanr.

Ancak bu yntemlerle sekuans tayini yaplamaz nk hidrolizbasama peptidi paralar.


26/35

26

T bi li tidi di i li i i l i i Ed


27/35

27

Tm bir polipeptidin dizi analizinin yaplmas iin Edmandegradasyonu metodu kullanlr.

Edman yntemimde sadece N-terminal amino asidi koparlr ve

analiz edilir. Peptidin geri kalan ise aynen korunur.

Peptit bir polimere tutturularak Edman sekuans analizinin

tamamen otomatik bir ekilde yaplmas salanabilir.

Ancak yapsnda 50dan fazla amino asit ieren peptitlerin buyntemle tayin edilmesi mmkn deildir.

Bu nedenle daha byk proteinlerin yaps aydnlatlmakisteniyorsa, Edman degradasyonundan nce protein zelyntemlerle daha kk paralara ayrlr.

Bu amala ncelikle dislfit balar krlr, daha sonra spesifik

proteazlarla protein paralanr.


28/35

28


29/35

29


30/35

30

Proteazlar arasnda sindirim sistemi enzimi tripsin polipeptitbalarn lizin ve arjinin amino asitlerinden keser.

Bu sebeple tripsin ile muamele edilmi olan polipeptittenolumu olan paralar tahmin edilebilirler.

Tripsin veya baka ajanlarca olumu olan peptit paralar

kromatografik veya elektroforetik yntemlerle tayin edilebilirler.

lk olarak tripsinle paralama yapldysa farkl bir proteazkullanlarak ayr bir paralama denemesi gerekletirilerek peptitparalarnn nasl birletikleri bulunur.

Eer primer yapda dislfit balar ieren bir peptit sz konusuise bu dislfit balarnn yerlerinin bulunabilmesi iin dislfitbalar krlmadan tripsin ile muamele edilir.


31/35

31


32/35

32

Bir polipeptitin dizilimini bulmak iin farkl yntemler dekullanlabilir.

Ktle spektrometreleri kullanlarak 20-30 amino asitten oluanpeptitler 20-30 saniye gibi bir srede analiz edilebilirler.

Hzl DNA sekuans analizrlerinin geliimi ile sz konusu

proteinin sentezlendii genin analizi ile de protein dizilimibelirlenebilir.

Ancak bu yntemlerin uygulanabilir olmas iin ilgili proteininveya genin dizi analizinin daha nceden yaplm olmasgereklidir.

Bu sebeple yeni kefedilmi bir proteinin analizinde dorudananaliz metotlar kullanlmaldr.


33/35

33

Bir organizmann DNAsnn dizilimine o canlnn genomu adverilir.

Farl organizmalara ait genom bilgileri veri tabanlarnda

mevcuttur.

Belirli bir organizmann belirli bir zamanda sentezlediiproteinlerin tamamna ise proteom ad verilir.

Proteom analizi genom analizine gre ok byk zorluklar tarancak bir organizmann proteomunun aydnlatlmas ile oknemli bilgiler elde edilebilir.


34/35

34

Pek ok peptit farmakolojik olarak nem tar ve retimleriticari bir neme sahiptir.

Bu amala 3 farkl yntem kullanlabilir.

Dokulardan peptitler izole edilebilir,

Genetik mhendislii kullanlarak eitli bakterilere

rettirilebilir veya,

dorudan kimyasal sentezleri gerekletirilebilir.

Her yntemin kendine gre avantaj ve dezavantajlar vardrancak gnmzde kullanlan gl teknikler nedeniyle dorudankimyasal sentez yntemi nem kazanmaktadr.


35/35

35

03 Amino Asitler, Peptitler Ve Proteinler II

Documents

Transcript of 03 Amino Asitler, Peptitler Ve Proteinler II