На правах рукописи

Птицын Андрей Владимирович

Технология выделения флавоновдов винограда Vitis vinifera сорта

"Изабелла" для косметики и изучение их свойств

03 00 23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва - 2007

Работа вьшолнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии имени М В Ломоносова и в научно-производственном объединении «Техкон»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор доктор химических наук, профессор

Василенко Иван Александрович Шишкина Людмила Николаевна

Ведущая организация: ГУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений

Защита диссертации состоится " 12 " ноября года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212 120 01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М В Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, 86 С авторефератом диссертации можно ознакомится на сайте МИТХТ им MB Ломоносова www mitht ru

Автореферат разослан года

Учёный секретарь диссертационного совета к х н ст н с

- / / ; И Лютик

&иЪ^~Сис*,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В настоящее время доказано разрушительное действие АФК* как на организм в целом, так и на кожу в частности, поэтому ведется активный поиск и исследование веществ с антиоксидантным действием, богатейшим источником которых оказались растения Флавоноиды, вторичные метаболиты растений, представляют собой широкий спектр ароматических соединений, подразделяющихся на несколько групп структурно-сходных полифенолов и насчитывающих более 5000 индивидуальных веществ Особый интерес представляют полифенолы красного винограда, обладающие наиболее высокой биологической активностью Флавоноиды в значительных количествах содержатся во всех органах виноградной лозы ягоде (кожица, косточка, сок), а также в стебле и гребне

Использование в косметике сырья, сочетающего в себе антиоксидантные, капилляропротекторные и УФ-защитные свойства, требовало создания технологии выделения и исследование свойств получаемых продуктов

Существует мнение, что для косметики более перспективным является использование очищенных флавоноидов, так как цельные растительные экстракты по уровню физиологической активности флавоноидов не отвечают требованиям, предъявляемым к косметическим препаратам Однако, поскольку из литературных данных известно о синергизме антиоксидантов, при разработке наших продуктов, представлялось целесообразным сравнивать активность суммы выделенных флавоноидов с активностями индивидуальных веществ Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ им М В Ломоносова в рамках госбюджетной темы №1 Б-5-356, а также по грантам президента РФ по поддержке ведущих научных школ № НШ-2329 2003 4 и НРИ-112/001/ 609 Цель и задачи исследования

* Список сокращений АФК - активные формы кислорода, БУВ - бутанол-уксусная кислота-вода, БХ - бумажная хроматография, ДФПГ - 1,1-дифенил-пикрил-гидразил, МА - малоновый альдегид, М-З-г - мальвидин-3-глкжозид, ПАК - пальмитат аскорбиновой кислоты, ПОЛ - перекисное окисление липидов, ТБК - тиобарбитуровая кислота, ТП - технологический процесс, ТХУ - трихлоруксусная кислота, ЭУВ -этилацетат-уксусная кислота-вода

3

ч

Цель работы заключается в разработке технологии выделения флавоноидов винограда Vitis vimfera сорта "Изабелла", обладающих наибольшей биологической, в том числе антиоксидантной и антирадикальной активностью для использования в косметике Основные задачи, поставленные при выполнении работы • Подобрать наиболее эффективный экстрагент и оптимальные условия для получения экстракта жмыха красного винограда Vitis vimfera сорта "Изабелла"

• Выделить главные флавоноиды жмыха красного винограда Vitts vimfera сорта "Изабелла"

• Разработать технологичный метод выделения флавоноидов, в том числе антоцианов и их эфиров из жмыха красного винограда Vitis vimfera сорта "Изабелла"

• Исследовать биологические и физико-химические свойства флавоноидов красного винограда Vitis vimfera, определяющие их применение в косметике, такие как антиоксидантные, антирадикальные, УФ-протекторные Изучить влияние флавоноидов на спонтанную сократительную активность кровеносных сосудов кожи и набухание эпидермиса

« Определить влияние структуры полифенолов на антирадикальную активность Сравнить свойства экстракта красного винограда со свойствами индивидуальных полифенолов для определения наиболее эффективных для косметики компонентов

• Определить время окисления флавоноидов в кремовой основе и устойчивость индивидуальных полифенолов при различных значениях рН и во времени

Научная новизна работы

• Показано, что антоцианы красного винограда Vitis vimfera сорта Изабелла

представлены в основном глюкозидами мальвидина 3-0-Р-В-глюкозилокси-4',5,7-

тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлоридом, 3-0-р-0-глюкозилокси-(б-0-(4-

гидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3',5*-диметоксифлавилиум хлоридом, 3-0-0-

В-глюкозилокси-(6-0-(3,4-дигидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3',5'-

диметоксифяавилиум хлоридом

• Разработан метод очистки смеси антоцианов флэш-хроматографией на тальке, позволяющий на 15-20% сократить потери антоцианов на стадии очистки от примесей Найдена хроматографическая система ЭУВ в соотношении 55 25 25 оптимальная для разделения антоцианов с помощью флэш-хроматографии

• Определены антиоксидантные и антирадикальные активности индивидуальных полифенолов красного винограда и его экстракта, которые были сопоставлены по

4

активности с, широко применяемыми в промышленности, антиоксидантами Определен вклад основных структурных единиц (количество фенольных гидрокси-групп, наличие оксо-группы в С4 положении, наличие двойной С2-Сз связи) полифенолов в антирадикальную активность Показано, что экстракт красного винограда Vitis vmifera проявляет более высокие антиоксидантную и антирадикальную активность, чем индивидуальные полифенолы

• Показано, что смесь М-З-г и его эфиров более чем на 70% ингибирует рост Sacharomyces cerevisiae расы 14 уже при концентрации антоцианов - 0,3 мг/мл

• Показана способность выделенных флавоноидов, обладающих антиоксидантными и антирадикальными свойствами, увеличивать спонтанную сократительную активность кровеносных сосудов кожи после гипоксии и препятствовать набуханию эпидермиса, вызванному действием прооксидантов Также показано наличие прямой зависимости, с коэффициентом корреляции г2 = 0,71 между антирадикальной активностью флавоноидов и спонтанной сократительной активностью кровеносных сосудов кожи

• Показана близкая к линейной зависимость УФ-протекторных свойств антоцианов, введенных в кремовую основу, от их концентрации при их содержании от 0,16 до 0,72 мг/мл

Практическая значимость работы

• Найдены оптимальные условия экстракции жмыха красного винограда, подобран наиболее эффективный экстрагент и температура экстракции Получаемый экстракт бьш внедрен на предприятии "Биотех-М" и производится под названием "комплекс биофлавоноидов красного винограда" ТУ 915412-025-05850619-2006

• Разработана технология выделения М-З-г, кумарового эфира М-З-г и кофейного эфира М-З-г из жмыха красного винограда

• Показано, что экстракт красного винограда, введенный в косметические композиции, обладает на 59% большей устойчивостью при хранении, чем смесь антоцианов

Положения, выносимые на защиту

1 Способ выделения М-З-г, кумарового эфира М-З-г и кофейного эфира М-З-г, мальвидина

5

2 Исследование антиоксидантной, антирадикальной и УФ-протекторной активности флавоноидов винограда

3 Определение влияния структуры полифенолов на антирадикальную активность

4 Определение зависимости между антирадикальной активностью и спонтанной сократительной активностью кровеносных сосудов кожи и набуханием эпидермиса

Публикации

По материалам работы опубликованы 4 статьи, 8 сообщений на конференциях и 1 патент

Апробация работы

Материалы диссертации были изложены на IX Международной научно-практической конференции "Косметические средства и сырье безопасность и эффективность", Москва, 2004, Научно-практической конференции "Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем", Калининград, 2005, международном форуме "Биотехнология и современность", Санкт-Петербург 2005, международной конференции кожа и окружающая среда", 2005, Третьем съезде общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова 2005, на Международной конференции "Формулэкшн 2005" Москва Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы Работа изложена на 130 страницах, содержит 4J5 рисунков и 23 таблицы Список литературы включает 163 источника

Основные результаты

1. Идентификация веществ

В ходе работы из жмыха красного винограда нами были выделены и охарактеризованы следующие соединения 3-0-(5-П-глюкозилокси-4',5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид - М-З-г (I), его кумаровый - З-О-р-О-глюкозилокси-(б-0-(4-гидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3 ',5 '-диметоксифлавилиум хлорид (П) и кофейный - 3-0-р-В-глюкозилокси-(6-0-(3,4-дигидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид (III) эфиры (рис 1), катехин - 3',4'-дигидроксифенил-3,4-дигидрохромен-3,5,7-триол, (V) (рис 2), а также агликоны, полученные кислотным гидролизом, - мальвидин - 4',3,5,7-тетрадрокси-3',5'-

6

диметоксифлавилиум хлорид (IV) и кверцетин - 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавон. (VI) (рис. 2).

\ 3 - 2"

5" б" Д н Я '

1 ш R-OH

Рис. 1. Антоцианы, выделенные из винограда Vitis vinifera в ходе данной работы

оси,

OCHj *ра он

он МО

Г/ V VI

Рис. 2. Агликоны и катехин, выделенные из винограда Vitis vinifera Данные УФ-, масс-, и Н-ЯМР спектров полученных нами веществ совпадали с

литературными данными. 2. Технология получения антоцианов из виноградного жмыха

2.1. Подбор экстрагента

Поскольку физико-химические свойства (влажность, исходное содержание полифенолов, содержание углеводов и.т.д.) нашего сырья имели отличия от примеров, описанных в литературе из-за характеристик данного сорта винограда, времени сбора, места произрастания и используемого нами метода получения жмыха, возникла необходимость отработать стадию экстракции. Для оптимального проведения экстракции необходимо было провести подбор наиболее подходящего экстрагента и температуры экстракции. Использовали следующие растворители: спирт, глицерин, пропиленгликоль, ацетон и их смеси с водой (табл. 1).

7

Таблица 1 Эффективность экстракции различными растворителями Название и концентрация растворителя

Спирт

95% 70% 50% 30% Пропилен-гликоль 95% 70% 50% 30% Глицерин 95% 70% 50% 30% Ацетон 95% 70% 50% 30% Вода

Сухой вес экстракта, %

Концентрация антоцианов, мг/мл

Концентрация общих полифенолов, мг/мл

3,31 3,73 4,35 4,61

0,89 0,95 1,02 0,85

1,93 2,13 2,35 1,95

Массовая доля антоцианов и общих пояифенолов в экстракте по сухому весу,%

анто­цианов 2,67 2,55 2,35 1,83

2,74 3,52 4,13 4,53

0,84 1 0,90 1,03 0,94

1,72 2,06 2,37 2,15

3,08 2,55 2,49 2,07

2,65 3,01 3,72 4,18

0,68 0,86 0,97 0,89

1,55 1,98 2,22 2,04

2,55 2,85 2,59 2,12

2,78 2,96 3,45 3,91 4,89

0,48 0,57 0,68 0,78 0,72

1,10 1,30 1,56 1,79 1,17

1,72 1,91 1,97 1,99 1,47

общих полифе­нолов 5,83 5,72 5,40 4,22

6,29 5,87 5,74 4,76

5,86 6,56 5,97 4,89

3,96 4,39 4,52 4,58 2,39

Из таблицы 1 видно, что содержание воды в экстрагенте имеет оптимум по отношению к эффективности экстракции при использовании 50% растворов спирта и пропиленгликоля Также показано, что при увеличении доли воды в экстрагенте массовая доля полифенолов в экстракте уменьшается, тк при добавлении воды увеличивается не только концентрация антоцианов в экстракте, но также растет и концентрация примесей Из полученных данных мы делаем вывод, что при получении экстракта для косметики, целесообразно использовать 50%, а для выделения индивидуальных флавоноидов или их смесей лучше использовать 50-70% раствор этанола, что применено нами в ТП 1 технологической схемы рис б Поиск оптимального температурного режима

На рис 3 видна довольно слабая зависимость эффективности экстракции от температуры при экстракции спиртом, объяснимая высокой растворимостью антоцианов

8

в спирте. Эффективность экстракции 50% водным пропиленгликолем, в значительной степени, зависит от температуры, т.к. по нашему предположению, скорость достижения равновесия лимитируется не растворимостью, а скоростью диффузии, связанной с

Поскольку 50% водным

вязкостью. экстракция пропиленгликолем при температуре 50СС была признана нами наиболее эффективной, то она легла в основу технологии получения "Комплекса

биофлавоноидов красного

0 J-

0 20 40 60 80 Температура, °С

— 50% пропиленгликоль Ш— 50% спирт — * — вода винограда внедренного нами на

предприятии ООО "Биотех-М". Рис. 3. Зависимость эффективности экстракции фракции антоцианов от температуры Дробная экстракция виноградного жмыха

С целью разделения антоцианов на этапе экстракции мы провели дробную экстракцию жмыха растворителями с градиентом полярности (рис. 4). Нами не ставилось технологической задачи вьщеления с помощью дробной экстракции

индивидуальных антоцианов,

F s

о

0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 u

1 V . ' - . • ' • - •

л \ _ 1 - - '

LkcL.„.

. . - . ->^V y &V•;?

' I 1

Hi 3 4 5 6 7

N экстрагента 8 9 10

• Эфир кумаровой кислоты М-З-г D Эфир кофейной кислоты M-3-r • М-З-г

однако в результате мы смогли оценить полярность антоцианов, что пригодилось при разработке метода

последовательного осаждения антоцианов (ТП 4А технологической схемы рис. 6).

Перечень экстрагентов: 1 - этилацетат - ацетон 4 : 1 2 - этилацетат - ацетон 2 : I 3 - этилацетат - ацетон 3 : 2 4 - этилацетат - ацетон 2 : 3 5 - ацетон

6 - ацетон - спирт 3 : 1 7 - ацетон - спирт 1 : 1 8 - спирт 9 - спирт - вода 2 : 1 10-спирт - вода 1 : 1

Рис. 4. Содержание антоцианов в экстракте в зависимости от экстрагента, анализ антоцианов вели методом ТСХ и денситометрии

Из рис. 4 видно, что с помощью увеличения полярности экстрагента во время дробной экстракции виноградного жмыха можно разделить антоцианы. Разная полярность производных мальвидина объясняется этерификацией М-З-г производными коричной кислоты с различным количеством гидроксильных групп.

2.2. Флэш-хроматография антоцианов на тальке

Для очистки антоцианов мы остановились на методе сорбции их тальком, позволяющем получить значительно более высокую степень чистоты, чем очистка с помощью, обычно применяемой, экстракции примесей этилацетатом. Так, сорбция

антоцианов тальком, согласно

о £ х х S >. .

х S

f i II

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

£ , .. • < ' ' • ' • . • • • ' ' • •

/ - . . . - . • . : . . . . . , '

-л / / ш

ffli

1 II Ш

—-_

Шк исходная

смесь 1

Количество операций

9 Экстракция этилацетатом • Сорбция на тальке |

нашим данным, позволяет добиться чистоты не менее 82% за одну стадию, в то время как 4-х кратная экстракция примесей этилацетатом (известный метод отделения примесей от антоцианов) позволила обогатить смесь антоцианов до 43% (рис. 5).

Рис. 5. Сопоставление чистоты препаратов антоцианов, получаемых после экстракции антоцианов этилацетатом и очистки сорбцией на тальке

Сорбцию на тальке мы совместили с флэш-хроматографией. Основное отличие нашего метода от прототипа состоит в том, что водный раствор антоцианов после суспендировання с тальком, фильтровали через тонкий слой талька, который позволяет избежать преждевременного удаления антоцианов, сорбируя их на себе во время элюции танинов водой. Эта модернизация сорбции на тальке позволяет избежать потерь, которые составляли, по нашим данным 15-20%. Очищенные от примесей антоцианы элюировали 70% раствором подкисленного соляной кислотой спирта (ТП ЗА).

2.3. Колоночная хроматография полифенолов на силикагеле

Перед нами стояла задача разработать простой способ разделения антоцианов. Необходимым условием для этого являлся поиск хроматографической системы, хорошо растворяющей антоцианы и обеспечивающей их разделение. Качественное разделение обеспечивала система БУВ, применяемая в БХ антоцианов, однако использование ее

10

было связано с энергоемким процессом удаления бутанола из элюата При подборе системы за основу взяли систему этилацетат-муравьиная кислота-вода с соотношением растворителей 70 15 15, известную из литературы Муравьиную кислоту (ПДК воздуха рабочей зоны - 1,0 мг/м3) заменили на менее токсичную, уксусную (ПДК воздуха рабочей зоны - 5,0 мг/м3) Однако из-за малой растворимости и небольшой хроматографической подвижности антоцианов в системе ЭУВ 70 15 15 необходимо было изменить соотношение компонентов Для выделения антоцианов нами были опробованы несколько систем с этими растворителями в соотношениях 60 15 15, 60 20 20, 55 20 20, 55 22,5 22,5, 55 25 25, 50 30 30 (табл 2)

Таблица 2 Растворимость и относительная хроматографическая подвижность кумарового эфира М-З-г, кофейного эфира-3-глюкозида и М-З-г в различных смесях Соотношение компонентов смеси ЭУВ

70 15 15 60 15 15 60 20 20 55 20 20 55 22,5 22,5 55 25 25 50 30 30 БУВ 4 1 1

Относительная хроматографическая подвижность компонентов смеси

Кумаровый эфир М-З-г 10,6 6,4 3,7 2,8 2,1 1,9 1,3 1,8

Кофейный эфир М-З-г

3,5 2,8 2,3 1,9 1,6 1,5 1,2 1,5

М-З-г

1 \

Растворимость антоцианов в хроматографи­ческой смеси, мг/мл

0,17 ±0,02 0,36 ± 0,03 0,56 ± 0,04 0,74 ± 0,05 0,87 + 0,05 0,96 ± 0,06 1,17 ±0,06 0,83 ± 0,05

Из данных таблицы 2 видно, что, выбранная нами, смесь ЭУВ 55 25 25 обеспечивает достаточно хорошее разделение антоцианов Кроме того, в этой системе антоцианы лучше растворимы, чем в системе БУВ Также к достоинствам хроматографической системы ЭУВ можно отнести хорошее разделение зон антоцианов от танинов и катехинов Так Rf смеси танинов и катехинов в системе ЭУВ 55 25 25 находятся в пределах от 0,76 до 0,91, a Rf антоцианов - от 0,39 до 0,74

2.4. Выделение кофейного эфира М-З-г

Из предварительно очищенного от примесей с помощью флэш-хроматографии на тальке раствора антоцианов сначала при охлаждении спиртового раствора осаждали наиболее полярный, водорастворимый М-З-г Затем добавляли хлористый метилен и выделяли из смеси кофейный эфир М-З-г с выходом до 65% Чистота получаемого препарата составляла не менее 84% по данным УФ-спектроскопии

И

Виноградный

ТП 1 Экстракция виноградного жмыха подкисленным этанолом

ТП 2 Упаривание водно-спиртового экстракта

Пастообразный экстракт

ТП ЗА Отделение антоцианов на тальке сорбцией совмещен­ной с флэш-хроматографией

ТПЗВ Хроматографическое разделение антоцианов в системе ЭУВ 55 25 25

ТП4Б Упаривание водного фильтрата

ТП 5Б Экстракция танинов этилацетатом из водного раствора

ТП4А Осаждение Кофейного эфира M-3-r хлористым метиленом

М-З-г, кумаровый эфир М-З-г и кофейный эфир М-3-г

Раствор фракции танинов

ТП6Б Упаривание этилацетатного раствора танинов

ТПЗГ Хроматографическое разделение агликонов в системе ЭУВ 84 6 6

ТП 7Б Хроматография в системе ЭУВ 70 15 15

Рис 6 Технологическая схема выделения флавоноидов красного винограда

12

Первоначально для выделения всех флавоноидов использовали наиболее широко применяемую экстракцию подкисленной водно-спиртовой смесью (ТП 1) В дальнейшем использовали различные, оптимальные для выделения определенного вида флавоноидов технологические способы Для получения индивидуальных антоцианов водно-спиртовой экстракт упаривали, полученную массу растворяли в системе ЭУВ 55 25 25 и хроматографировали в ней на колонке с силикагелем 0,04-0,063 мкм (ТП ЗВ) Фракцию антоцианов выделяли флэш-хроматографией на тальке (ТП ЗА) В дальнейшем кофейный эфир М-З-г осаждали из фракции антоцианов при добавлении хлористого метилена и охлаждении (ТП 4А) Водную фракцию, смытую с талька, экстрагировали этилацетатом (ТП 5Б), хроматографировали в системе ЭУВ 70 15 15 (ТП 7Б) и выделяли катехин Хроматографическое разделение (ТП ЗГ) флавоноидов экстракта винограда, предварительно гидролизованного в течении 2 ч соляной кислотой (ТП 2Г), позволяло получить наиболее распространенные агликоны красного винограда мальвидин и кверцетин

Из технологической схемы (рис 6) видно, что возможно применение нескольких путей ведущих к получению различных продуктов схема "А" служит для выделения фракции антоцианов и последующего осаждения кофейного эфира М-З-г, схема "Б" предполагает хроматографическое выделение катехина; согласно схеме "В" предполагается хроматографическое разделение М-З-г, кумарового эфира М-З-г, кофейного эфира М-З-г, схема "Г" - гидролиз экстракта красного винограда и последующее хроматографическое разделение мальвидина и кверцетина

3. Исследование свойств выделенных флавоноидов

3.1. Определение антиокспдантной активности регистрацией МА

Антиоксидантную активность исследовали по торможению окисления фосфолипидов в присутствии полифенолов ПОЛ в фосфолипидных мембранах индуцировали системой Fe2+ (0,02 мМ) + аскорбат (0,5 мМ) Для определения интенсивности перекисного окисления использовали спектрофотометрический метод определения МА (продукта ПОЛ) МА определяли по его реакции с ТБК с образованием окрашенного в розовый цвет триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм Для оценки эффективности антиоксидантных свойств антоцианов их сравнивали с экстрактом винограда, содержащим сумму флавоноидов, и ионолом Эффективность антоцианов и экстракта винограда в качестве антиоксидантов оказалась ниже ионола, но

13

уже при концентрации 0,05 мг/мл оказалось возможным уменьшить количество

образующегося МА на 70,5% (рис. 7).

Дальнейшее увеличение концентрации антоцианов до 0,1 мг/мл нивелировало разницу

между ионолом,

экстрактом красного

винограда и фракцией

антоцианов. Показана

линейная зависимость

антиоксидантного эффекта

от содержания антоцианов 0,025 0,05 0,1 0,2

, и общих полифенолов Концентрация антиоксидантов, мг/мл

Jионол Пэкстракт виноградарсмесьантоцианов! к " грзД •

Рис. 7. Накопление МА в дисперсии фосфолипидов в присутствии антиоксидантов

В дальнейшем мы проводили эксперименты при эквимолярных концентрациях

антиоксидантов равных 0,2 мМ (рис. 8). В экспериментах мы использовали также

выделенный нами из зеленого чая кофеин. В качестве стандартных антиоксидантов нами

был использован ряд веществ: дигидрокверцетин (Merck, Германия), байкалин (ООО

«Реликт», Россия), галловая кислота, ионол, гесперетин (Sigma-Aldrich, Германия) и

ПАК (Flucka, Германия).

8

ж м <$ <?

^ <г° / : * с> J .* <?J>

Рис. 8. Концентрация МА в зависимости от используемого антиоксиданта (концентрация

антиоксидантов 0,2 мМ)

14

i — '

Поскольку в экстракте красного винограда содержится смесь различных

полифенолов, то мы брали количество экстракта красного винограда эквивалентное 0,2

мМ галловой кислоты, которое определяли по методу Фолин-Чокальтеу.

Из рис. 8 видно, что большинство индивидуальных полифенолов, за исключением

кверцетина, мальвидина и дигидрокверцетина обладают меньшей, ингибирующей

способностью к образованию МА, чем экстракт красного винограда.

3.2. Определение антирадикальной активности по скорости восстановления ДФПГ

Наряду с методом определения МА, определяли антирадикальную активность по

скорости восстановления спиртового раствора ДФПГ. Скорость убыли ДФПГ-радикалов

определяли спектрофотометрически, при длине волны 519 нм. Для измерения

использовали 0,02 мМ растворы антиоксидантов.

Скорость изменения

концентрации ДФПГ

регистрировали по

изменению оптической

плотности и определяли

по формуле: AC=Di-

D2/0,00969 мкМ/с.

" ^ — = - £ = = —

Ъ 4? А?

I / / / / / / / / / / / * * / ё

Рис. 9. Скорость восстановления ДФПГ мкМ/мин. различными антиоксидантами

(концентрация антиоксидантов 0,02 мМ)

Мы проанализировали антирадикальную способность выделенных нами

соединений в присутствии известных антиоксидантов, в качестве контроля, таких как

ионол, ПАК, галловая кислота, байкалин, дигидрокверцетин и кофеин (рис. 9).

Как видно из рис. 9 наибольшей активностью обладают экстракт красного винограда,

выделенные из него антоцианы и кверцетин.

3.3. Связь структуры и антирадикальной активности Также представляло интерес сопоставление антирадикальной активности со

структурой изучаемых соединений (метод QSAR). Исследование связи структура -

активность проводили по данным антирадикальных свойств полифенолов.

15

Для этого мы обобщили необходимые данные структурные особенности полифенолов существенные для проявления антирадикальной активности в табл 3

Таблица 3 Особенности структуры и антирадикальная активность полифенолов

винограда

Название

Ионол

Мальвидин

М-З-г

Кумаровый эфир М-З-г

Кофейный эфир М-З-г

Галловая кислота

Структура

* $ < OCHj

CI ^ Ц / О К

OH

OCH3

но. -fs^ot ̂ L JL

ОН СН-ЮН |

ci" + f Н О > ^ ч ч , ( Х _ Д

он

CI +

OH

но ^_ ^

OH 1

i V - ^ O C H ,

5 о й о

H

HO

Скорость восстановления ДФПГ, мкМ/мин

3,02

10,11

6,81

9,56

11,36

8,78

Структурные особенности

Один фенольный гидроксил

Четыре фенольных гидроксила (3, 5, 7, 4')

Три фенольных гидроксила (5, 7, 4')

Четыре фенольных гидроксила (5, 7, 4', 4")

Пять фенольных гидроксилов (5, 7, 4', 3", 4")

Три фенольных гидроксилов (3,4,5)

16

Катехин

Кверцетин

Дигидро-кверцетин

Гесперетин

Ан о он

|"^||~"он

l!)H О

5,51

10,9

6,95

6,54

Пять фенольных гидроксилов (3, 5, 7, 3", 4 ' ) Восстановленная С2-С3 двойная связь

Пять фенольных гидроксилов (3, 5, 7, 3", 4") оксо-группа в С4 положении

Пять фенольных гидроксилов (3, 5, 7, 3", 4") оксо-группа в С4 положении Восстановленная С2-С3 двойная связь

Три фенольных гидроксила (5, 7, 3') оксо-группа в С4, Восстановленная Сг-Сз двойная связь

Сопоставив данные антирадикальной активности со структурными компонентами

полифенолов (количество фенольных гидроксилов, наличие оксо-группы в С4

положении, наличие двойной С2-С3 связи) мы рассчитали вклад каждого структурного

компонента в антирадикальную активность полифенола Для этого мы использовали

программный пакет Microsoft Excel Составили систему линейных уравнений и

подобрали коэффициенты а, Ь, с, где а, Ь, с, - коэффициенты, определенные

регрессионным анализом по методу наименьших квадратов, определяющие вклад

каждого структурного элемента в антирадикальную активность

АО = a*nOH + b*nO + c*nDb, где

пОН - количество фенольных гидроксилов

О - наличие оксо-группы (п = 1 при наличии оксо-группы и п = 0 при отсутствии)

Db - наличие двойной связи (п = 1 при наличии двойной связи и п = 0 при ее

отсутствии)

а = 1,30, Ь = 1,65, с = 2,65 Подставив полученные коэффициенты в систему

линейных уравнений, мы вычислили следующие значения антирадикальной активности,

которые указаны в последнем столбце табл 4

17

Таблица 4. Экспериментальная и вычисленная антирадикальная активность исследуемых антиоксидантов Название

Ионол Мальвидин М-З-г Кумаровый эфир М-З-г Кофейный эфир М-З-г Галловая кислота Катехин Кверцетин Дигидрокверце-тин

Гесперетин

Байкалин Экстракт красного винограда

Антирадикальная активность определенная экспериментально

3,02

10,11 6,81

9,56

11,36

8,78

5,51 10,9

6,95

6,54

6,12

16,81

Количество фенольных гидроксилов

1

4 3

4

5

3

5 5

5

3

2

-

Наличие оксо-группы

0

0 0

0

0

0

0 1

1

1

1

-

Наличие двойной связи

1

1 1

1

1

1

0 1

0

0

1

-

Антиради­кальная активность вычислен­ная

3,94 7,83 6,54

7,83

9,13

6,54 6,48

10,78

8,13

5,54 6,89

-

Для проверки полученных коэффициентов корреляции мы сначала рассчитали по ним антирадикальную активность байкалина, затем провели экспериментальное измерение антирадикальной активности, ошибка составила 13% (табл. 4.) Коэффициент корреляции R2

является относительным 0 2 4 6 8 10 12

показателем качества (рис. 10) Экспериментально определенная скорость

восстановления ДФПГ, мкМАшн

а© » 5 s

чита

нная

та

новл

ен

мкМ

/м

Расе

во

сс

12.00 10,00 8,00 6,00 4,00

2,00 0,00

— , - • —

у = 0,6199х +2,3438 R' = 0,7337 . ^ ^ - ^

• -J<iriZ$K ' сг^^ ' "'. ] •

• " ) '

Рис. 10. Рис. Корреляция измеренной и рассчитанной, скорости восстановления ДФПГ, мкМ/мин

18

Из наших данных следует, что увеличение антирадикальной активности пропорционально количеству фенольньгх гидроксилов Также очевидно положительное влияние на антирадикальную активность Сг-Сз двойной связи Так, например, кверцетин на 57% превосходит дигидрокверцетин по скорости восстановления ДФПГ Исходя из полученных нами данных видно, что существенно антирадикальную активность увеличивает С4 оксо-группа, сопряженная с С2-Сз двойной связью, однако несопряженные оксо-группы дигидрокверцетина и гесперетина, по-видимому, мало влияют на антирадикальную активность

Интерес представляет практически полное отсутствие антиоксидантного и антирадикального действия у кофеина, поскольку в многочисленных публикациях он характеризуется высокой антиоксидантной активностью в отношении радикала гидроксила образующегося в реакции Фентона и пероксильных радикалов, генерируемых 2,2'-азобис(2-амидинопролан)дигидрохлоридом

Также нами не замечено проявления прооксидантного эффекта ни у одного из исследованных полифенолов Экстракт красного винограда показал антирадикальную активность значительно более высокую, чем выделенные из него полифенолы в отдельности, и был одним из наиболее эффективных антиоксидантов по тесту с МА, несмотря на относительно высокую полярность его компонентов, что является, по нашему мнению, примером синергизма, входящих в его состав, антиоксидантов

3.4 Способность антоцианов к ингибированию Sacharomyces cerevisiae

Способность к ингибированию Sacharomyces cerevisiae определяли совместно с лабораторией микробиологии ЗАО НПО "Техкон" по уменьшению массы культуральной жидкости в процессе ферментации, показателю, характеризующему интенсивность жизнедеятельности микроорганизмов Культура Sacharomyces cerevisiae расы 14 была выбрана в качестве модельной культуры, как наиболее удобный объект для исследования ингибирующей активности в отношении дрожжей Выбор растворителя для антоцианов остановили на 30% растворе пропиленгликоля в воде -распространенном экстрагенте для ингредиентов, применяемых в косметике

Показано, что добавление антоциановой фракции до конечной концентрации 0,3 мг/мл на 70% ингибировало рост культуры Sacharomyces cerevisiae расы 14 Эксперимент проводили при содержании дрожжевой культуры в растворе 22*103 кл /мл и 1,3*103 кл/мл Действие антоциановой фракции, при добавлении к Sacharomyces cerevisiae с меньшим количеством клеток (1,3*103 кл/мл) позволило почти полностью подавить развитие микроорганизмов, на 96% уменьшив рост биомассы

19

3.5. Зашита кожи от УФ- излучения

УФ-протекторное действие флавоноидов определяли совместно с лабораторией

биофизики ЗАО НПО "Техкон". В эксперименте приняли участие 8 добровольцев в

возрасте 25-50 лет. Интенсивность эритем после нанесения образцов крема с

добавлением антиоксидантов, сравнивали с эритемами в контроле (кремовой основе не

содержащей антиоксидантов).

Сравнение интенсивности эритем с предварительным нанесением крема,

содержащего антоцианы, и нанесением того же крема после облучения позволило

оценить вклад двух составляющих факторов: эффекта УФ-фильтра и антиоксидантной

активности. Показано, что различие защитного действия невелико и составляет, при

разных концентрациях

антоцианов, от 4 до 20%,

что позволяет отнести

УФ-защитный эффект, в

большей степени, к их

высокой

антиоксидантной

активности (рис. 11). 0,16 0,32 0,45 0,72

Концентрация антоцианов, мг/мл Ш Облучение после нанесения крема с фракцией антоцианов D Облучение до нанесения крема с фракцией антоцианов

Рис. 11. Зависимость интенсивности эритемы кожи от концентрации и времени

нанесения фракции антоцианов по сравнению с контролем

3.6. Влияние экстракта красного винограда на набухание эпидермиса

Набухание эпидермиса под действием флавоноидов определяли совместно с

лабораторией биофизики ЗАО НПО "Техкон". Скорость набухания эпидермиса зависит

от содержания в нем веществ, связывающих воду, и от проницаемости липидного

барьера кожи.

В нашей работе показано, что нанесение на кожу жидкостей, содержащих

окислители (препарат "озонид", перекись водорода, или ионы двухвалентного железа),

ведет к увеличению интенсивности набухания и росту упругости эпидермиса. Мы

предполагаем, что увеличение интенсивности набухания связано с повышением

проницаемости эпидермиса вследствие повреждения липидного барьера кожи,

вызванного активацией перекисного окисления липидов. Жидкости, содержащие

природные антиоксиданты: флавоноиды, экстрагированные из красного винограда,

ПАК, наоборот, уменьшают интенсивность набухания и рост упругости эпидермиса.

20

Вероятнее всего, антиоксиданты защищают липидный барьер кожи от повреждения, тем самым, уменьшая его проницаемость для воды.

3.7. Влияние экстракта красного винограда на спонтанную сократительную активность кровеносных сосудов кожи и связь ее с антиоксидантной активностью

Изменение спонтанной сократительной активности кровеносных сосудов кожи определяли совместно с лабораторией биофизики ЗАО НПО "Техкон". Периодические сокращения гладкой мускулатуры сосудов называют вазомоциями. Отсутствие вазомоций связывают с угнетением синтеза основного сосудорасширяющего фактора -оксида азота NO, который образуется в результате активности фермента NO-синтазы, расположенного в клетках эндотелия. Интенсивность вазомоций измеряли с помощью прибора "Ландыш", который позволяет определить частоту резонанса гладкой мускулатурой кожи, а повышение частоты резонанса подтверждает увеличение спонтанной сократительной активности кровеносных сосудов кожи.

Название антиоксиданта

Рис. 12. Спонтанная сократительная активность кровеносных сосудов кожи после нанесения на нее экстракта красного винограда и его компонентов в концентрации 1 мМ и дозе 25 мкл/см2

Как показали результаты настоящего исследования (рис. 12) под влиянием большинства полифенолов красного винограда спонтанная сократительная активность кровеносных сосудов кожи в диапазоне частот 0,8-2 Гц резко возрастает.

21

8 * л а S в 8.«

20

15

10

5

0

у = 8,7923х +0,1667 R2 -0,7118

• " 5

j ^ '

Щ . -. • ~ • • -

0,5 1 1,5 2 Частота резонанса, Гц

2,5

Также нами показано,

что антирадикальная

активность экстракта и

индивидуальных веществ

коррелирует (рис. 13) с

частотой резонанса спонтан­

ной сократительной активнос­

ти кровеносных сосудов кожи.

Рис. 13. Корреляция между антирадикальной активностью экстракта красного винограда

и его компонентов и спонтанной сократительной активностью кровеносных сосудов

кожи

Мы пришли к выводу, что возрастание частоты резонанса спонтанной

сократительной активности кровеносных сосудов кожи является прямым проявлением

антиоксидантной активности, наносимых на нее препаратов.

3.8. Устойчивость антоцианов к окислению в косметических композициях

Нами показано, что скорость деградации очищенной фракции антоцианов

смешанной с кремом на

59% выше, чем экстракта

красного винограда (рис.

14), что объясняется

восстановлением анто­

цианов прочими полифе­

нолами виноградного

экстракта. О 5 10 15 20 25 30

Время, дни -•-экстракт красного винограда -*- фракция антоцианов,

Рис. 14. Изменение содержания антоцианов в кремовой основе при нагревании

Постепенное окисление лейкоцианидинов до антоцианов мы исключали.

поскольку не обнаружили на хроматограммах антоцианов с отличной, от выделенных

ранее, подвижностью.

22

3 9. Устойчивость флавоноидов красного винограда к окислению при различных рН

Мы измеряли время окисления до половинной концентрации полифенолов при различных значениях рН (табл 5) В полученных нами данных прослеживается взаимосвязь увеличения скорости окисления при наличии восстановленной двойной связи Сг-Сз и фенольного гидроксила в 3-ем положении кольца С Таблица 5 Время окисления до половинной концентрации полифенолов

Наименование вещества

Кумаровый эфир М-3- г М-З-г Кофейный эфир М-3- г Катехин Мальвидин Кверцетин Дигидрокверцетин Галловая кислота

Время окисления до половинной концентрации, ч рН = 3

. * -------

рН = 5,5 ---

8 ±2,4 ----

рН = 7,4

36 ±8 48 + 9 J 24 ±6,1 1 ±0,5 3 ± 1 24±6 8 ± 4

72 ±11

рН = 9

4±2 8±3 3±1

0,3 ± 0,2 1+0,5 6±2

1 ±0,5 4 ±1,3

*- не отмечено уменьшения концентрации в течение недели Из литературы известно, что скорость окисления полифенолов взаимосвязана с

их антиоксидантной активностью Однако в нашей работе не было установлено прямой зависимости между антиоксидантной, антирадикальной активностями и скоростью окисления полифенолов

3.10. Статистическая обработка результатов Аналитические, физико-химические биологические эксперименты проводили в

трех повторностях Эксперименты m vivo проводили на добровольцах в количестве от 8 до 20 человек Все результаты были обработаны статистически

Выводы

1 Подобран наиболее эффективный экстрагент и оптимальный температурный режим для получения водно-пропиленгликолевого экстракта жмыха красного винограда Vitis vimfera сорта "Изабелла" для последующего применения в косметике Найдены условия разделения антоцианов с помощью дробной экстракции

2 Разработана технологическая схема выделения как смеси, гак отдельных антоцианов красного винограда с использованием внедренных нами методов.

23

А) Очистка смеси антоцианов сорбцией совмещенной с флэш-хроматографией на тальке позволяет на 15-20% сократить потери антоцианов по сравнению с применением сорбции на тальке Б) Хроматографическое разделение антоцианов колоночной и флэш-хроматографией на силикагеле в системах бутанол-уксусная кислота-вода и этилацетат-уксусная кислота-вода, отличающиеся от предшествующих методов простотой процесса и тем, что постоянный состав элюирующей системы облегчает регенерацию смеси растворителей В) Осаждение эфира кофейной кислоты М-З-г хлористым метиленом из спиртовых растворов

3 Исследован состав флавоноидов красного винограда Vitts vinifera сорта Изабелла Выделены и идентифицированы индивидуальные флавоноиды этого сорта винограда 3-0-р-В-глюкозилокси-4',5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид, З-0-p-D-глюкозилокси-(б-0-(4-гидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид, 3-0-Р-0-глюкозилокси-(6-0-(3,4-дигидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид, 3',4'-дигидроксифенил-3,4-дигидро-2Н-хромен-3,5,7-триол, 4',3,5,7-тетрагидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид и 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавон

4 Дополнены известные ранее данные об антиоксидантной и антирадикальной активности полифенолов и флавоноидов красного винограда Определен вклад основных структурных единиц (количество фенольных гидроксилов, наличие оксо-группы в С4 положении, наличие двойной Сг-Сз связи) на антирадикальную активность Показано, что экстракт красного винограда Vitos vinifera проявляет более высокие антиоксидантную и антирадикальную активность, чем индивидуальные вещества

5 Показано, что полифенолы, обладающие антиоксидантными и антирадикальными свойствами, повышают спонтанную сократительную активность кровеносных сосудов кожи после гипоксии и препятствуют набуханию эпидермиса вызванного действием прооксидантов Также показано наличие прямой зависимости между антирадикальной активностью флавоноидов и увеличением спонтанной сократительной активностью кровеносных сосудов кожи с коэффициентом корреляции г2 = 0,71

6 Показано, что УФ-протекторные свойства антоцианов, введенных в кремовую основу, вызваны их антиоксидантным действием, а не способностью поглощать УФ Также показано наличие прямой зависимости УФ-протекторных свойств от концентрации при их содержании от 0,16 до 0,72 мг/мл

24

7 Для подтверждения устойчивости флавоноидов в косметических композициях и хранении были определены периоды окисления до половинной концентрации флавоноидов при различных значениях рН и показана динамика окисления при нагревании до 40°С в течении месяца Показано, что экстракт красного винограда, введенный в косметические композиции, обладает на 59% большей устойчивостью при хранении, чем смесь антоцианов

8 Показано, что смесь М-З-г и его эфиров более чем на 70% ингибирует рост Sacharomyces cerevisiae расы 14 22*103 кл /мл при концентрации антоцианов - 0,3 мг/мл в культуральной среде

Список публикаций

1 Птицын А В , Каплун А П, Мухтаров Э И, Швец В И Выделение и очистка антоцианов винограда Vitis vimfera сорта Изабелла // Биотехнология 2007 №2 С 22-28

2 Тимофеев А Б , Тимофеев Г А, Птицын А В , Фаустова Е Е , Федорова В Н Резонансная реоластография - новый метод исследования вазомоций в коже человека // Медицинская техника - 2006 - №5 - С 32-36

3 Птицын А В , Каплун А П , Пичугина Т В , Тимофеев А Б , Мухтаров Э И, Мухтарова С Э Антоцианы красного винограда Vitis vimfera антиоксидантная активность, антимикробное и солнцезащитное действие- // Ученые записки МИТХТ 2005 Вып 13 -С 58-64

4 Птицын А В, Мухтаров Э И , Каплун А П , Мухтарова С Э Способ выделения биологически активных антоцианов Патент РФ № 2302423,2007

5 Птицын А В , Мухтаров Э И , Каплун А П, Мухтарова С Э Флавоноиды красного винограда Vitis vimfera - перспективы применения в медицине и косметике Косметика и медицина//2005 - № - 3 -С 18-23

6 Птицын А В , Каплун А П , Пичугина Т В , Тимофеев А Б , Мухтаров Э И Антоциановый комплекс экстракта винограда - перспективы применения в косметологии антиоксидантное, антимикробное и солнцезащитное действие Тезисы IX Международной научно-практической конференции "Косметические средства и сырье безопасность и эффективность", Москва, 2004, С 52

7 Птицын А В , Каплун А П, Мухтаров Э И, Мухтарова С Э Экстракты красного винограда и зеленого чая - перспективные ингредиенты для создания биологически активных добавок Тезисы Научно-практической конференции "Значение

25

биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем", Калининград, 2005, С 74

8 Птицын А В , Каплун А П, Мухтаров Э И, Мухтарова С Э , Михайлова Н А , Иванова Г Л Вьаделение и очистка антоцианов красного винограда Vitis vimfera Тезисы Международного форума "Биотехнология и современность" 2005, Санкт Петербург, С 52

9 Птицын А В , Каплун А П , Мухтаров Э И , Тимофеев А Б , Мухтарова С Э, Тимофеев Г А Зависимость биологической активности экстрактов красного винограда Vitis vimfera от содержания полифенолов Тезисы Международной конференции "Кожа и окружающая среда", 2005, Москва - Санкт Петербург 73

10 Птицын А В , Тимофеев А Б , Михайлова Н А, Каплун А П Влияние растительных экстрактов содержащих антиоксиданты на спонтанную сократительную активность кровеносных сосудов кожи Тезисы сообщений Третьего съезда общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова 2005, С 69

11 Птицын А В, Мухтаров Э И, Мухтарова С Э, Каплун А П Зависимость избирательности экстракции флавоноидов красного винограда Vitis vmifera от содержания воды в используемом экстрагенте Тезисы X Международной научно-практической конференции "Косметические средства и сырье безопасность и эффективность", Москва, 2005, С 70

12 Птицын А В , Тимофеев А Б , Каплун А П, Мухтаров Э И, Мухтарова С Э Связь УФ-защитного действия экстракта красного винограда Vitis vmifera с его антиоксидантной активностью Тезисы X Международной научно-практической конференции "Косметические средства и сырье безопасность и эффективность", Москва, 2005, С 71 13 Тимофеев А Б , Мухтарова С Э , Каплун А П , Михайлова Н А , Птицын А В , Семейкин А В , Стволинский С Л, Тимофеев Г А Влияние активных антиоксидантных комплексов на набухание и упругость эпидермиса Тезисы X Международной научно-практической конференции "Косметические средства и сырье безопасность и эффективность", Москва, 2005, С 72

26

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г Подписано в печать 11 10.07. Тираж 80 экз. Усл. п.л 1,63

Печать авторефератов (495) 730-47-74, 778-45-60