Ферментные препараты в...
Transcript of Ферментные препараты в...
-
Иван Зоров МГУ 1
ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ
Области применения и методы анализа
Иван ЗОРОВ
Московский Государственный
Университет им. М.В Ломоносова
Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН
МИНСК, 9 СЕНТЯБРЯ, 2015
-
Иван Зоров МГУ 2
Механико-математический факультет
Ф-т вычислительной математики и кибернетики
Физический факультет
Химический факультет Факультет наук о материалах
Биологический факультет
Факультет фундаментальной медицины
Факультет почвоведения
Геологический факультет
Географический факультет
Исторический факультет
Филологический факультет
Философский факультет
Экономический факультет
Социологический факультет …
Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова
Химический факультет
17 кафедр, включая:
Кафедра химической энзимологии
Химии природных соединений
Физической химии
Аналитической химии
Химической технологии …
-
Иван Зоров МГУ 3
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. Баха РАН Старейший Российский институт в области наук о жизни
Около 25 лабораторий и исследовательских групп
Более 300 человек, из них 206 научных сотрудников, 175 докторов и кандидатов наук
>30 аспирантов
>180 студентов
>80 федеральных и международных программ и грантов
Июль 2015 года
ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР
БИОТЕХНОЛОГИИ РАН
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ
ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ ЦЕНТР БИОИНЖЕНЕРИИ
-
Иван Зоров МГУ 4
ПРОМЫШЛЕННАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ лаборатория биотехнологии ферментов
Целлюлозо-бумажная промышленность:
Биоотбеливание бумаги, удаление красок и тонеров, рефайнинг целлюлозы, наноцеллюлоза, переработка целлюлозосодержащих отходов .
Пищевая и кормовая промышленность:
Ферменты для обработки кормов на основе зерновых, сои, кукурузы;
ферменты для получения спиртов;
ферменты в хлебопечении;
ферменты для получения соков;
ферменты в производстве вин;
ферменты для переработки белковых отходов.
Ферменты для моющих средств.
Ферменты для получения жидкого топлива и продуктов тонкой химии на основе растительной биомассы.
-
Иван Зоров МГУ 5
Создание штаммов микроорганизов - продуцентов ферментов
Скрининг диких
микроорганизмов
Мутагенез
и селекция мутантов
Генетическая инженерия
штаммов
-
Иван Зоров МГУ 6
Лабораторные исследования
- Изучение каталитических свойств ферментных препаратов;
- Хроматографическое выделение индивидуальных ферментов и
определение их биохимических, адсорбционных, каталитических и
прочих характеристик с использованием современных
аналитических методов;
- Оптимизация условий получения и использования ферментов;
- Разработка, оптимизация и миниатюризация методов скрининга;
- Моделирование / имитация стадий технологических процессов в
лабораторных масштабах.
Прикладные испытания
- Оптимизация дозировок, условий, схем применения ферментных
препаратов в производственных условиях
Исследование свойств и функций ферментов
-
Иван Зоров МГУ 7
Питательные вещества кормов
Белки растительного и животного происхождения – источник аминокислот, строительного материала для организма;
Жиры (преимущественно растительные) – источник энергии и базовые элементы для синтеза многих гормонов;
Сахара и растительные полисахариды в т.ч. - простые сахара (глюкоза, галактоза и пр., а также сахароза) - крахмал и амилопектин – источники энергии для функционирования клеток организма
-
Иван Зоров МГУ 8
Антипитательные факторы кормов
Ингибиторы протеаз растительного
происхождения (напр. соевый ингибитор)
Ингибиторы карбогидраз (ингибиторы
ячменя, ржи, кукурузы)
Некрахмальные полисахариды в т.ч.
- целлюлоза
- ксиланы, маннаны и b-глюканы, частично
пектины
Фитин
-
Иван Зоров МГУ 9
Структура некоторых НПС
Арабиноксилан
b-глюкан
O
H
OHH
H
O
OH
H H
OH
CH2OH
O
H
O
HH
OOH
H H
CH2OH
O
H
OHH
H
O
OH
H H
CH2OH
O
H
O
HH
O
OH
H H
CH2OH
O
H
OHH
H
OH
OH
H H
CH2OH
O
H
HH
OH
H
OH
H OH
CH2OH
O
H
HH
OH
H
OH
H OH
CH2OH
Галактоманнан
-
Иван Зоров МГУ 10
Некрахмальные полисахариды
Арабиноксилан b-глюкан Целлюлоза Пектин
Пшеница 6.0-6.6 0.7-0.8 ~2.5 -
Ячмень ~4.4 5.7-7.0 4.3 -
Рожь ~8.7 2.2-2.8 ~3.0
Соя 3.6 - 4.6 9.3-14.0
Кукуруза 4.9 - 2.6
Пшеничныеотруби
22.0-26.0 1.9-2.4 н/д н/д
Соеваяшелуха
~35.0 ~9 ~12 н/д
-
Иван Зоров МГУ 11
Типы и функции основных ферментов для использования в кормах
ПРОТЕАЗЫ – расщепление белков на полипептиды и аминокислоты
КАРБОГИДРАЗЫ
Целлюлазы – разрушение молекул целлюлозы
Гемицеллюлазы (ксиланазы, b-глюканазы, пектиназы)
расщепление ксилана, b-глюкана и пектина
соответственно
Амилазы – для расщепления крахмала
Фитаза – для высвобождения растительного фосфора,
связанного в фитине
-
Иван Зоров МГУ 12
отщепление по концевым связям
Механизмы ферментативного гидролиза
полисахаридов на примере гидролиза целлюлозы
ЭНДОДЕПОЛИМЕРАЗЫ
“статистическая” деполимеризация по внутренним связям
ЭКЗОДЕПОЛИМЕРАЗЫ
Субстраты: кристаллические и низкомолекулярные
(авицел, олигосахариды)
Эффект: образование простых сахаров – гексоз и пентоз
Субстраты: высокомолекулярные (КМЦ, b-глюкан, галактоманнан)
Эффект: снижение вязкости растворов полисахаридов
-
Иван Зоров МГУ 13
Ферментативный гидролиз полисахаридов клеточной стенки
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O O
O
OH
OH
OH
OHm (m
-
Иван Зоров МГУ 14
Метод определения активности ферментов в кормах при помощи окрашенных субстратов
-
Иван Зоров МГУ 15
Принцип метода измерения ферментативной активности по окрашенным субстратам
Окрашенный полисахарид, растворимый в буфере,
нерастворимый в органическом “осадителе”
Е
Олигосахарид, раство-
римый в “осадителе”
Полисахарид, нераство-
римый в “осадителе”
-
Иван Зоров МГУ 16
Окрашенные субстраты
Окрашенные
активным
оранжевым
карбоксиметилцеллюлоза
аморфная целлюлоза
арабиноксилан
галактоманнан
лихенан
Окрашенные
бриллиантовым
голубым
карбоксиметилцеллюлоза
арабиноксилан
b-глюкан
крахмал
-
Иван Зоров МГУ 17
Схема проведения эксперимента
Раствор окрашенного
субстрата
Измерение оптической
плотности супернатанта
Осаждение
Центрифугирование
Гидролиз окрашенного
субстрата экстрактом корма
Центрифугирование
Отбор супернатанта
Экстракция
Приготовление
суспензии корма
Условия: рН 5,0 ацетатный буфер,
температура 42оС,
перемешивание
-
Иван Зоров МГУ 18
Анализ активности ферментов в кормах
на примере ROD-КМЦ
Окрашенная КМЦ
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Соя 1 Соя 2 Корм №1 Корм №4 Корм №5 Корм №7 Корм №8 Корм
№10
А490
-
Иван Зоров МГУ 19
1 Премикс 1 с ФП1
2 Комбикорм с ФП1 престартер после
миксера
3 Комбикорм с ФП1 престартер в
гранулах
4 Премикс 2 в ФП2
5 Комбикорм Стартер с ФП2 до
гранулирования
6 Комбикорм Стартер с ФП2 крупка
7 Премикс 3 с ФП1
8 Комбикорм с ФП1 Стартер до
гранулирования
9 Комбикорм с ФП1 Стартер гранулы
ОБРАЗЦЫ ПРЕМИКСОВ И КОМБИКОРМА
ДО И ПОСЛЕ ГРАНУЛИРОВАНИЯ
Ксиланазная активность в кормах
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Образец
А485
Эндоглюканазная активность в кормах
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,3500
0,4000
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Образец
А4
85
-
Иван Зоров МГУ 20
Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа
Окрашенные субстраты
Корма чистые и с добавлением
ферментов для калибровки
Термостат (водяной или контактный)
Лабораторный фотометр
Центрифуга (или микроцентрифуга)
Лабораторная посуда (или микропосуда)
Мерные пипетки (или микропипетки)
-
Иван Зоров МГУ 21
Метод определения активности ферментов в кормах вискозиметрическим методом
-
Иван Зоров МГУ 22
Оборудование для определения вязкости
-
Иван Зоров МГУ 23
Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа
Корма, дающие высоковязкие экстракты
Водяной термостатируемый шейкер или
термостатируемая магнитная мешалка
Капиллярный вискозиметр
Секундомер
Центрифуга (или микроцентрифуга)
Лабораторная посуда (или микропосуда)
Мерные пипетки (или микропипетки)
-
Иван Зоров МГУ 24
Вязкость экстрактов муки (100 г/л)
Время
истечения, сек
Относительная
вязкость
Рожь, №1 155 6,3
Рожь, №2 127 5,2
Ячмень 97 4,0
Пшеница 33,5 1,4
Кукуруза 25 1,0
вода 24,5 1,0
Время истечения экстракта
Относительная вязкость =
Время истечения воды
-
Иван Зоров МГУ 25
Схема проведения эксперимента
ДОБАВЛЕНИЕ
ФЕРМЕНТА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАДЕНИЯ
ВЯЗКОСТИ ОТ ВРЕМЕНИ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЯЗКОСТИ
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
ОТБОР ЖИДКОЙ ФРАКЦИИ
ЭКСТРАКЦИЯ
ПРИГОТОВЛЕНИЕ
СУСПЕНЗИИ МУКИ
-
Иван Зоров МГУ 26
Анализ активности ферментов
на примере экстракта ржи
Г20Х
90
100
110
120
130
140
0 500 1000 1500
Г20Х
0,95
1,05
1,15
1,25
1,35
1,45
1,55
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750t'
Fr
t ист., сек
t реакции, сек
Пример высокой
активности и
стабильности
фермента
-
Иван Зоров МГУ 27
PentoХ
80
85
90
95
100
105
110
0 500 1000 1500
Анализ активности ферментов на примере экстракта ржи
t ист., сек
t реакции, сек
PentoХ
0,95
1,05
1,15
1,25
1,35
0 250 500 750 1000 1250t'
Fr
Пример высокой
активности фермента, но
малой стабильности
фермента
-
Иван Зоров МГУ 28
GrinХ
107
108
109
110
111
112
113
0 200 400 600 800 1000
Анализ активности ферментов на примере экстракта ржи
t ист., сек
t реакции, сек
0,95
1
1,05
1,1
1,15
1,2
1,25
1,3
0 200 400 600 800 1000
Пример низкой
активности фермента
-
Иван Зоров МГУ 29
Ингибирование ксиланаз экстрактами зерновых культур
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
бо
лее,
чем
на
90%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
на 5
0%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
бо
лее,
чем
на
90%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
на 5
0%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
бо
лее,
чем
на
90%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
на 5
0%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
бо
лее,
чем
на
90%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
на 5
0%
Кси
лан
азн
ая
акти
вн
ость
,
Ед
/мг
Bio ACE Dyadic 0.95
ЦелловиридинАрсенал
Гольджи +- +- +- +- 1.9
Cellustar XL Dyadic X + X + + X + 36
Xylanase 2 XP Dyadic X + X + + X + 63
Cellustar XL Dyadic X + X + + X + 36
NCE L600 Dyadic + X + + 5.4
C1, dry Dyadic + X + + 4.6
Pentopan, Mono BG Novozymes X + + X + + 129
Econase HCP 4000 AB Enzymes X + + + X + 164
Provimi feed enzyme Provimi X + + +- 52
Avizyme 1200 Finnfeeds X + X + + X + 12
Porzyme PT 100 Finnfeeds X + X + + X + 60
Rovabio Excel, UF Aventis + 19
Allzyme PT , A.niger, Alltech X + + + +- 6
Sumizyme X, dryShin-Nihon
(Bioshigen) X + +- + + 92
Genencor Xylanase Genencor X + X + + + 134
Endopower, dryHyndaifeed
(Eazy
Biosystems)X + + + 7
Рожь КукурузаЯчменьПшеница
-
Иван Зоров МГУ 30
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!
ЗОРОВ Иван Никитич