熊本大学学術リポジトリ

Kumamoto University Repository System

Title 口腔扁平上皮癌における新規腫瘍マーカーの開発と病態

解析 : 早期診断および予後予測因子としてのミッドカイ

ン

Author(s) 太田, 和俊

Citation

Issue date 2009-02-20

Type Thesis or Dissertation

URL http://hdl.handle.net/2298/15254

Right

　　学位論文

Doctor’s　Thesis

　口腔扁平上皮癌における新規腫瘍マーカーの開発と病態解析

　　　一早期診断および予後予測因子としてのミッドカインー

（Development　of　a　novel　tumor　marker　and　pathological　analyses　in　oral

squamous　cell　carcinoma：　Midkine　as　a　promising　tumor　marker　to　screen

　　　the　carcinoma　at　the　early　stage　and　to　predict　its　prognosis）

　　　　　　　　　太田　和俊

　　　　　　　　Kazutoshi　Ota

熊本大学大学院医学教育部臨床医科学専攻顎口腔病態学

指導教員

　　　　　　　　篠原　正徳　教授：

熊本大学大学院医学教育部臨床医科学専攻顎口腔病態学

　　　　　　　　安東由喜雄教学

熊本大学大学院医学教育部病態制御学専攻病態情報解析学

　　　　　　　　　　2008年度

目　次

1霞要旨・…・………・・…・・・・・……・・………・・………・・………1

2．発表論文リスト・…………・……・……………・・………・・……3

3．謝辞・………・……・……………・・…・………・…・……・・…4

4．略語一覧…　…………………　………・…・・…・・……・……・・5

5．研究の背景と目的

　5－1．口腔扁平上皮癌・…・…・・………………・・……・・…・……・・7

　　5－1－1．口腔扁平上皮癌の概要

　　5－1－2．口腔扁平上皮癌と腫瘍マーカー

　5－2．ミッドカインの生物学的意義・………・……・…………………・・9

　　5－2－1．ミッドカインの遺伝子と蛋白質としての特牲

　　5－2－2．ミッドカインの生物活性

　　5－2－3．ミッドカインの作用機構

　　5－2－4．ミッドカインと癌

　5－3．本研究の目的………・・………・…・…・…………・………15

6．実験方法

　6－L正常および患者検体・…・……・………・…・…………’●’●●’●16

　6－2．抗体および試薬………・………・・…………・……・・…・…16

　6－3．培養i細胞…………・………　…………・・…・…　…………17

　6－4．実験動物・………………・…・・………・・………………・17

　6－5．Western　blotting法…………・・……・・………………・…　…18

　6－5．免疫組織化学染色……・・…………・…・……………・……19　6’7．　ELISA　’’’’’’’””’””””’’’’’’’”・’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’”　20

　6－8．　EIA　’’’’’’’’’’’’’’”””’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’’”・　20

　6－9．RNA抽出およびRT－PCR・…・…・………・…・………・・’．’●●●●●21

　6－10．遺伝子導入（DNA　Transfection）●●’’”●●●●．●”●”●’●●”●●●．’●’’”●●23

　6－11．RNA干渉（siRNA）………・……………………・・………・・23

6－12．統計学的解析∵………………・…・………・……・・……・23

7．実験結果

　7－1．口腔扁平上皮癌におけるミッドカイン発現………・……・…………24

　　7－1－1．ミッドカインの遺伝子発現………・……・…・・……………・24

　　　7－1－1－1．ミッドカインの遺伝子発現

　　　7－1－1－2．短縮型ミッドカインの遺伝子発現

　　7－1－2．ミッドカインの蛋白質発現・……………・…・………・……・28

　　　7－1－2－1．Western　blotting解析

　　　7－1－2－2．免疫組織化学染色

　7－2．ミッドカインの腫瘍マーカーとしての検討………・・………・………32

　　7－2－1．血液検体の違いによるミッドカイン測定・……・…………・……32

　　7－2－2．ELISAと免疫蛍光分析装置を用いたEIAの比較……・…………・33

　　7－2－3．臨床病理学的因子との比較検討………………・…・………34

　7－3．ミッドカインとp53…・……………・……………・……　…・…39

　　7－3－1．免疫組織染色によるp53とミッドカインの比較・………・……・…・39

　　7－3－2．p53（＋／＋），（＋／一），（一／一）マウスにおけるミッドカイン発現…　…………41

　　7－3－3．p53（＋／＋），（一／一）大腸癌細胞株におけるミッドカイン発現・・…………42

　　7－3－4．p53（一／一）大腸癌細胞株への野生型p53の遺伝子導入……………43

　　7－3－5．siRNAを用いたp53（＋／＋）大腸癌細胞株でのp53発現抑制・……・…44

　　7－3－6．口腔扁平上皮癌細胞株への野生型p53の遺伝子導入・・…………45

8．考察

1．口腔扁平上皮癌におけるミッドカインの発現と腫瘍マーカーとしての検討・・…46

11．p53の動態に着目したミッドカインの発現動態に関する検討……・………49

9．今後の展望・………・………・…・…・…・…・・…・・……・…・…51

10．結語…・・……………・…・…………・…・・…………・……・52

11．参考文献…・…………・…・・……・…………・…・・…………53

1．要旨

（目的】口腔癌の生存率は、近年の診断能力の向上や治療法の多様化にもかかわらず、

劇的な向上は得られていない。特に進行癌での予後は悪く、各施設での平均5年生存率

は50－60％程度に止まる。そのため、口腔癌の予後向上には早期発見が重要であり、鋭

敏な腫瘍マーカーの開発や予後予測因子の同定が待たれている。ミッドカインは、細胞の

増殖、生存、移動を促進するなどの性質を持つ塩基性のヘパリン結合性蛋白質で、近年

では様々な癌組織での発現が報告されている。そこで今回われわれは、口腔癌で最も多

い口腔扁平上皮癌におけるミッドカインの発現確認をした後に、ミッドカインの口腔癌腫瘍

マーカーへとしての可能性、さらにはミッドカインの本腫瘍に対するメカニズムを解析する

ことを本研究の目的とした。

【方法】正常粘膜と口腔癌組織でのミッドカインmRNAの発現比較、免疫組織学的染色、

Western　blotting法による、口腔癌組織でのミッドカイン蛋白の発現確認を行った。次に、

正常人血清と口腔癌患者血清中のミッドカイン濃度を測定し比較検討すると共に、臨床病

期や病理学的分化度、5年生存率などの臨床病理学的因子との関係についても検討した。

さらに口腔扁平上皮癌に対するメカニズムを解析する一環として、p53との関連性につい

ても着目し、マウスや細胞を用いて実験を行った。

【結果】口腔扁平上皮癌におけるミッドカインmRNAの発現は正常粘膜に比べて有意に

上昇していた（P＜0．05）。さらにミッドカイン蛋白質の発現はウエスタンプロット法および免

疫組織化学染色で確認された。免疫組織化学染色では口腔癌組織の約90％が陽性を示

し、Nドメインにエピトープを持つ抗ミッドカイン抗体で染色性が強いことが確認できた。血

中ミッドカイン濃度の検討は最も特異度が優れていた抗ミッドカインSC抗体によるEIAで

検討を行ったところ、口腔扁平rti皮癌患者血清中のミッドカイン濃度は健常人と比較し有

意に高値を示し、特に口腔癌初期の段階でも高値を示していた（P〈0．005）。また、血清

1

ミッドカイン高値群は低値群と比較し明らかに5年生存率の減少が認められた（P〈

o．os）．

ミッドカインとp53の相互作用を検討した実験からは、野生型p53の遺伝子導入によりミ

ッドカイン発現は低下し、p53発現の抑制により、ミッドカインが増加することが確認された。

【考察】ミッドカインは口腔扁平上皮癌組織において高発現し、血中でも正常人と比べ

口腔癌患者の初期段階から高値を示していたことから、血清ミッドカイン値が口腔癌の早

期発見マーカーとして有用であると考えられた。また、5年生存率に関する検討結果より、

血清ミッドカイン値は、口腔扁平上皮癌の予後を予測する上でも重要な腫瘍マーカーと成

りうることが示唆された。これまでミッドカインとp53は、アポトーシス関連因子であり薬剤耐

性にも関与することがそれぞれ報告されていたが、今回の研究ではp53がミッドカインの上

流でその発現を制御していることが推測された。

【結論】L血清ミッドカイン値は口腔扁平上皮癌の早期診断、予後予測マーカーとして

有用である。

2．p53はミッドカインの上流でその発現を制御している可能性が示された。

2

2．発表論文リスト

①関．連論．文

　　　1．　一〇一t／q－K．，　Fujimori　H，　Ueda　M，　Shinriki　S，　Kudou　M，　Jono　H，　Fukuyoshi　Y，

　　　　　　Yamamoto　Y，　Sugiuchi　H，　lwase　H，　Shinohara　M，　Ando　Y．

　　　　　　Midkine　as　a　prognostic　b．iomarker　in　oral　squameus　cell　carcinoma．

　　　　　　British／burnal　Of（池πoθr　99：655－662，2008

②その他の論文

　　　1．　Shinriki　S，　Ueda　M，　Ota　K，　Nakamura　M，　Kudo　M，　lbusuki　M，　Kim　J，　Yoshitake　Y，

　　　　　　Fukuma　D，　Jono　J，　Kuratsu　j，　Shinohara　M，　Ando　Y．

　　　　　　Aberrant　Expression　of　Serum　Amyloid　A　in　Head　and　Neck　Squamous　Cell

　　　　　　Carcinoma．　／　Oral　Pa　thol　Med　2009　in　press

　　　2．　Kim　J，　Motomiya　Y，　Ueda　M，　Nakamura　M，　Misumi　Y，　Saito　S，　lkemizu　S，　Misumi

　　　　　　S，　Ota　K，　Shinriki　S，　Kai　H，　Ando　Y．

　　　　　　Role　of　conformational　c．hange　in　the　Crmterminus　of　B　2’M．　icroglobuliR　in

　　　　　　dialysis－related　amyloidosis，　Ann　Cfin　Bioehem　45：489－495　2008．

　　　3．　Takamune　Y，　lkebe　T，　Nagano　O，　Nakayama　H，　Qttg一1Sa　K，　Obayashi　T，　Saya　H，

　　　　　　Shinohara　M．

　　　　　　ADAM－17　associated　with　CD44　cleavage　and　metastasis　in　oral　squamous　cell

　　　　　　carcinoma．　VL　cho」vs　Arch　450：169－177　2007．

　　　4．　Murakami　R，　Uozumi　H，　Hirai　T，　Nishimura　R，　Shiraishi　S，　Q．”t－a．”　K．．　，　Murakami　D，

　　　　　　Tomiguchi　S，　Oya　N，　Katsuragawa　S，　Yamashita　Y．

　　　　　　Impact　of　FDG－PET／CT　i’maging　on　nodal　staging　for　head－andntneck　squamous

　　　　　　cell　carcinoma．　lnt　I　Radiat　Oncol　Biol　Phys．　68：377－82　2007．

　　　5．　lkebe　T，　一〇ta　K，　Maki　M，　Nomura　T，　Shinohara　M．

　　　　　　Secondary　reconstruction　of　mandibular　depression　deformity　with　pedicled

　　　　　　latissimus　dorsi　myocutaneous　fiap．　Oral　Science　lnternatfollal　2：64－68　2005．

3

3．謝辞

本研究を行うにあたり、御懇篤なる御指導と御校閲を賜りました熊本大学大学院医学教

育部総合医薬科学部門外科再建医学講座、顎口腔病態学分野教授、篠原正徳先生

に深謝いたします。

また、研究に対する姿勢から研究手法に至るまで御指導、御鞭捷いただきました熊本大

学大学院医学教育部総合医薬科学部門病態制御学講座、病態情報解析学分野教授、

安東由喜雄先生に厚くお礼申し上げます。

本研究では熊本大学大学院医学薬学研究部先端生命医療科学部門分子機能薬学講

座、遺伝子機能応用学分野教授甲斐広文先生より実験動物や細胞を御供与いた

だきました。深く感謝いたします。

本研究を行うに際し、多大なご協力を頂きました病態情報解析学分野講師、城野博文

先生、同助教、植田光晴先生に厚く感謝の意を表します。他にも、病態情報解析学分

野、顎口腔病態学分野、遺伝子機能応用学分野の皆様には有形無形のご協力をいただ

きました。心より感謝いたします。

4

4．略語一覧

ALK：　Anaplastic　leukemia　kinase

ANOVA：　Analysis　of　variance

B　2M：　B　2’microgloblin

CA19－9：　Carbohydrate　antigen　19mg

CA125：　Carbohydrate　antigen　125

cDNA：　complementary　DNA

CEA：　Carcinoembryonic　antigen

CHRM4：　Cholinergic　receptor　muscarinic　4

DGKz：　Diacylglycerol　kinase　zeta

DMEM：　Dulbecco’s　modified　eagle　medium

DNA：　Deoxyribonucleic　acid

EIA：　Enzymemlinked　immunoassay

ELISA：　Enzyme－linked　immunosorbent　assay

ERK：　Extracellular　signal－regulated　protein　ki’nase

FBS：　Fetal　bovine　serum

GAPDH：　Glyceraldehyde　3－phosphate　dehydrogenase

LRP：　Low　densitylipoprotein　receptor’related　protein

MAPK：　Mitogen－actiated　protein　kinase

MK：．　Midkine

MRI：　Magnetic　resonance　imaging

mRNA：　Messenger　Ribonucleic　acid

NF一　K　B：　Nuclear　factor－kappa　B

OSCC：　Oral　squamous　cell　carcinoma

PBS：　Phosphate　buffer　saline

PET：　Positron　emission　tomography

PI3K：　Phosphoinositide　3－kinase

PPI’：　4－a－rninom5”（4－methylphenyl＞一7一（tmbutyl）一　pyrazolo－3，4－D’pyrimidine

PTP　4　：　Protein　tyrosine　phosphatase　4

ROC　curves：　Receiver　operating　characteristic　curves

RPMI：　Roswell’　park　memorial　institute

5

RT－PCR：　Reverse　transcriptase－polymerase　chain　reaction

SCC：　Squarnous　cell　carcinoma

siRNA：　small　interfering　RNA

t－MK：　truncated　MK

VEGF：　Vascular　endothelial　growth　factor

6

5．研究の背景と目的

5－1．口腔扁平上皮癌

5－1－1．口腔扁平上皮癌の概要

　口腔癌は口腔領域に発生する悪性腫瘍であり、全癌の約1～3％、頭頸部癌の約60％

を占める疾患である。なかでも口腔扁平上皮癌は口腔の被覆粘膜が重層扁平上皮である

ことに由来し、口腔癌の約90％以上を構成している。発生部位としては舌が最も多く、約

45％を占め、次いで歯肉30％、口底10％、頬粘膜8％、口蓋3％と続いている（Saikawa，

2007）。治癒率は発生部位によりわずかに異なるが、全ての口腔癌の5年累積生存率は概

ね60～70％である。しかし、病期別に見ると、Stage　1　85－95％、　Stage　ll　80－95％、Stage皿

60－75％、StagelV40－600／・と、癌の進行に伴い予後は急激に悪化する。進行癌において

は、救済された患者でも程度の差はあれ、摂食、嚥下および構音など日常生活の根本に

係わる口腔機能障害を後遺する。そのため、生命予後、QOLの両面から、早期発見・早

期治療の重要性が示唆される。

近年、口腔癌の診断はMRIやPETなどの画像診断機器の開発や技術の向上により、確

実に進歩してきた。さらに治療においても、再建技術の進歩に伴う手術範囲の拡大や新

規抗癌剤の認可により治療法の選択肢は確実に広がっている。しかし、これらの進歩にも

かかわらず、口腔癌の予後は劇的に向上しているとは言い難い（JeMalθt　a！，2006）。その

原因としては、進行癌の制御困難、抗癌剤耐性や放射線耐性などの難治性癌の存在が

指摘される。こうした問題点を解決するためには、癌の早期発見、難治性癌に起因する予

後予測因子の発見、難治性癌に対する新たな治療法などが不可欠である。

とりわけ口腔癌の大半を占める口腔扁平上皮癌において、早期診断および予後予測因

子となりうる新規腫瘍マーカーを開発することは、口腔癌の新たな治療戦略を策定する上

で極めて重要であると考えられる。

7

5－1－2．口腔扁平上皮癌と腫瘍マーカー

腫瘍マーカーとは癌の進行とともに増加する生体因子のことで、主に血液中に遊離する

因子を抗体により検出する臨床検査法のひとつである。そのため、腫瘍マーカーは癌の発

生臓器と強い関連性を持ち、臓器別に腫瘍マーカーの種類は異なっている。しかし、前立

腺癌におけるPSAのような一部の腫瘍を除いて、そのほとんどは腫瘍の増大や転移に伴

い発現が上昇するため、早期診断に使用できるものはなく、治療効果の判定や術後の経

過観察目的でのみ臨床応用されている。

これまで口腔癌では、SCC抗原やCEA、　CA19－9、　CA125などの腫瘍マーカーが臨床応

用されてきたが、CEA、　CA19－9、　CA125の腫瘍マーカーとしての有効性は低く（Krimmelθ’

a！，1998）、唯一、口腔扁：平上皮癌に特異的なSCC抗原も感度は低く早期癌や転移の早

期には反応しない（Fischbach＆Rink，1988；Kurokawaθオ以1993）。さらに口腔癌は直視直

達が可能なことから、腫瘍マーカーを使用する意義は低いと考えられ、他の癌と比較し口

腔癌の腫瘍マーカー開発は遅れてきた。そのため、現在、特異度および鋭二度ともに優

れた口腔癌の腫瘍マーカーは存在しない。一方で口腔癌の早期発見・早期治療にむけて、

医師・歯科医師への講演会やマスコミによる啓発活動が行われてきたが、未だに進行癌の

割合は高く治癒率の向上には至っていない。そのため口腔癌に感度、特異度が優れた腫

瘍マーカーが開発されれば、検診における早期発見が可能となり、その意義は大きいと考

えられる。

8

5－2．ミッドカインの生物学的意義

5－2－1．ミッドカインの遺伝子と蛋白　としての特性

ミッドカインは塩基性アミノ酸とシステインに富む質量13kDaの分泌タンパク質であり、N

末端側とC末端側の2つのドメインから主として構成されている（Kadomatsu　et　al，1988）｝。

N末端側ドメインに3つのC末端側にドメインに2つのS－S結合が存在する（Fabri　et　al，

1993）。それぞれのドメインには3本の逆平行β一シートがある（図1）。主としてミッドカイン

の活性を担うのはC末端側のドメインであり、MKの強いヘパリン結合能や神経突起伸長、

神経細胞の移動などの活性に関与している。ミッドカインはトランスグルタミナーゼの作用

を受け二量体を形成するが、ミッドカイン活性の一部はこの二量体化を必要とし、この際に

はN末端側ドメインも関与する。

1KKKDKVKKGGPGSECAEWAWGPCTPSSKDCGVGFREG丁CG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Nドメイン

41　AQTQRIRCRVPCNWKKEFGADCKYKFENWGACDGGTGTKV

81　RQGTLKKARYNAQCQETIRVTKPCTPKTKAKAKAKKGKGKD　　　　　　　　　Cドメイン

　　　　　　　　　　cys30xitby．s2　Cystou“tX・n

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　il｛r’　’x

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，Cys48

＼

cys15　一　V：　cys3g

　　　　　　　Cyse2く》＝一

　　　　　：．，”ptStL

㎞　　　　　Cく㎞mio

図1ヒトミッドカインのドメイン構造と各ドメインの立体構造

　　（文献（Muramatsu，2002）より引用し、一部改変）

9

ヒトのミッドカイン遺伝子（MDK）は染色体11p11．2に存在し（Kanameθオ以1993）、その両

側にはジアシルグリセロキナー実写ータ（DGKz）とムスカリン性アセチルコリン受容体4

（CHRM4）がある。またマウスのミッドカイン遺伝子（Mdk）は第2染色体，　Hox4．1の近傍に

存在する。いずれの場合も、コーディング配列は4つのエクソンに分かれている（Matsubara

θオ鋤1990；Ueharaθご以1992）。ミッドカイン遺伝子の上流にはレチノイン酸応答性エレメ

ント（RARE）があり、ミッドカイン遺伝子の発現はレチノイン酸によって誘導される。本プロモ

ーターを連結した遺伝子は，EC細胞ではレチノイン酸応答性の発現上昇を示す

（Matsubaraθ’鋤1994）。また、ウィルムス腫瘍のがん抑制遺伝子WT　1の産物の結合部位

があり、ウィルムス腫瘍発症の時WT1が欠失すると、抑制が解かれミッドカインの発現が誘

導されると考えられる。

　　　　　　　　　MDK　　　　　　　　　　　　11臼112　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ノ　　　　　　　　　　　　　　　　　躍

　　　　　　　　　「　　　　　　　　　　　1　　　　．　一MDec一

　　　　　　　　購一一　　　　　　　　　　　一1　　　　　　　　　　0　　　　　　　　　　1　　　　　　　　　　2　　　　　　　　　　3眠b

図2ヒトミッドカイン遺伝子（MDK）の構造

　（文献（Muramatsu，2002）より引用）

また、ミッドカインには、第3エクソンが欠損した転写産物である短縮型ミッドカインの存在

が明らかとなっている（Kaname　et磁1996）。興味深いことに、これまでの研究では癌組織

に特異的に認められ、消化器癌リンパ節転移巣ではほぼ全例で認められたと報告されて

いる（Aridome説以1998）。

truncnted　MK

Exeu　1つ‘ 3 4

mo重ure　MK

　　　　　図3短縮型ミッドカインと成熟型ミッドカイン

ロはエクソンを示し、オレンジ着色部分は蛋白コード部分を示す。

因みに第3エクソンはミッドカイン蛋白のNドメインに相当するため

　　変異型ミッドカインはCドメインのみコードすることになる。

10

5－2－2．ミッドカインの生物活性

ミッドカインは胎児中期に広範囲に発現され，それ以後はしだいに発現が低下していく

（Kadomatsuθご以1990）。中でも上皮間葉相互作用をしている上皮組織、分化中の神経組

織、そしてリモデリング中の幼弱な結合組織が主な発現部位である。生後はミッドカインの

発現は血管内皮や腎臓などに限局され、それ以外では傷害を受けたあとの修復時（Ohta

θt　al，1999）や癌組織中（Tsutsuiθt　a／，1993）に弓虫く発現している。このように特異的な発現

をするミッドカインは多彩な生理活性を持っている（表1）。

まずは線維芽細胞、ケラチノサイトなどの増殖を促進する（Muramatsu＆Muramatsu，

1991）機能でWilms腫瘍細胞の増殖にも関与している。また、胎児の神経細胞（Owada　et

以1999）や心筋細胞（Obama　et　a！，　1998）などを標的細胞とした抗アポトv一一・Lシス作用をもち、

脳の神経細胞の生存にも寄与していると考えられている（Yoshidaθt　a！，1995）。さらにミッド

カインは神経細胞、炎症性細胞（マクロファージ，好中球）などの移動を促進する（Horiba　et

a！，　2000；Maeda　et　al，1999；Takadaθオ以1997）。神経細胞の突起伸長（Muramatsu　et　al，

1993）、繊維芽細胞へ作用してコラーゲンゲルの収縮の促進作用もあり、細胞移動の促進

と同様に細胞骨格への作用も持つ。そのうえミッドカインは転写レベルでも作用し、血管内

皮細胞の維溶系の促進（Kojima　et　a！，　1995）、尿細管細胞のケモカインの発現増強（Satoθオ

以2001）、繊維芽細胞のコラーゲンやグリコサミノグリカン合成の促進作用を持つ。

機能 標的細胞

細胞増殖

細胞移動

形態変化

抗アポトーシス

線溶系

ケモカイン発現

軟骨分化

血管新生

シナプス形成

繊維芽細胞、ケラチノサ■ト、腫瘍細胞

神経細胞、好中球、マクロファージ、骨芽細胞

胎児神経細胞、コラーゲン、ゲル収縮

神経細胞、腫瘍細胞、心筋細胞

血管内皮細胞

尿細管＝細胞、血管内皮細胞

軟骨細胞

腫瘍細胞

筋原細胞

表1ミッドカインの生物活性

11

5－2－3．ミッドカインの作用機構

MKの受容体はプロテオグリカンとlow　densitylipoprotein　receptor－related　protein（LRP）

ファミリーのメンバーからなる複合体を形成し、少なくとも4種類の受容体が関与していると

考えられている。第一はヘパリン結合性から推測されるようにヘパラン硫酸プロテオグリカ

ンであるシンデカンファミリーであり、現在までにシンデカン1、3、4との強い結合が確認さ

れている（Nakanishiθt　al，1997）。第二は受容体型タンパクチロシンフォスファターゼζ

（PTPζ）である（Maeda　et　a7，1999）。　PTPζは留山二型のコンドロイチン硫酸プロテオグリ

カンで細胞質側にボスファターゼドメインをもつ。ミッドカインとPTPζの結合には細胞外ド

メインに存在するコンドロイチン硫酸が強い親和性で結合し、蛋白質部位との親和性は弱

い。第三はLDL　receptor－related　protein（LRP）である（Muramatsu　et　al，2000）。この受容

体は元来アポリポタンパクEなど多種のリガンドのエンドサイトーシスを担うとされてきたが，

MKの抗アポトーシス活性に重要であることがわかってきた。第四には、anaplastic

leukemia　kinase（ALK）が同定されたが、この伝達にはinsulin　receptor　substrate－1のリク

ルートとNF一κBの活性化が必要とされている（Kuo　et　a！，　20e7）。ミッドカイン受容体はこれ

らの分子が会合した複合体であり、ミッドカイン結合により複合体形成が促進されると考え

られている。

細胞内でのミッドカインシグナル伝達系は、PTPζやALK受容体の下流でPI3キナーゼ

やMAPキナーゼ（ERK）の活性化を起こすことが報告されている（Qiθt　al，2001；Stoicaθt

磁2002）。ERKはPI3キナーゼの下流にあり、ミッドカインによりPI3キナーゼが活性化され

ると、ERKのリン酸化も促進されるのである。受容体からPI3キナーゼへ至るシグナルの流

れはよくわかっていないがミッドカインの活性をSrcの阻害剤であるPPIが抑えることより、

Srcが関与する可能性が高いと考えられている。

また、ミッドカインは細胞表面受容体を介する系とは別に、細胞内に直接とりこまれ、さら

に細胞の生存維持活性に必要な核への移行が判明している。その際には、細胞内への

取り込みにはLRPが作用し、核の移行にはヌクレオリンあるいはラミニン結合タンパク質前

駆体が関与していると報告されている（Shibataθ‘属2002）。

12

　　！

一嫡＿め　　　のロ　　　　　　　　　　　　　　　グ

＿孟誌峯置　　　　　　隔、　　　　　　　　　　　　　　　も

　甲馬　　　　　　　、　　　rb　　　　　　　　　　　　、　　　噺馬　　　　　　　　　　馬　　　　鞠ら　　　　　　　　、

　　　　　噂匂　　　　　　鯨鮨

鳳・極鵬

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濁ノ　　量　ハ　セロの　　　

　　ラ凹Aρ　klnese

図4ミッドカインのシグナル受容体複合体と下流のシグナル系

　　　　　　（文献（Muramatsu，2002）より引用）

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＼、旦　　　

陰

ぺ郷一91野宮驚鮮一　　　叫　　　　　　臨囎書1

図5細胞移動促進の時のミッドカイン受容体複合体モデル

　　　　　（http：／／www．midkine．orgより引用）

13

5－2－4．ミッドカインと癌

ミッドカインの持つ抗アポトーシス作用や細胞増殖能、細胞遊走、血管新生能などは、い

ずれも癌の生存・進展に有利に働く。実際に、ミッドカインの発現は多くのヒト癌組織で増

大するという報告がなされている（Aridome　et　al）1995；Kato　et　al，2000；Konishi　et以

1999；Nakagawaraθ‘以1995；Taoθご以2007；Tsutsui　et　al，1993；Yeθ’鋤1999）。本現

象は食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、

ウィルムス腫瘍、ホジキン病、神経芽細胞種、神経膠芽腫などで認められている。発現上

昇が起こる頻度は癌の種類により異なるが、全体では約80％の症例に認められている。

鱒繭一@　　」　　…＿＿＿⊥コ　CtotorectaI

p－sTr77一］

31

16

1　12

69

　　　　　o　’　’　’　’　50　一　L一　’loo（％1

　　図6ヒト癌におけるミッドカインの発生上昇

非癌部に比較して上昇しているケースをパーセント表示

　　　　（文献（Muramatsu，2002）より引用）

また、ミッドカインの発現と悪性度が相関し、ミッドカインの発現が強い患者では予後が悪

いという報告が、星細胞膠腫（Mishima　et以1997）、神経芽細胞種（Nakagawara　et鋤

1995）、膀胱癌（0’Brienθご磁1996）、膵臓頭部癌（Maedaθ’以2007）などでなされている。

さらに胃癌細胞株でDNAマイクロアレイ解析法を用いて行われた研究では、多剤の薬剤

耐性と最も関与していたのはミッドカインであるという報告（Kang　et　al，　2004）がなされ、抗癌

剤耐性とミッドカインについても注目されている（Mirkinθご鉱2005；Qi　et　al，　2000）。

このような癌とミッドカインの強い関連から、ミッドカインを標的とした癌の診断と治療につ

いても研究されてきた。診断の面からは、腫瘍マーカーとして神経芽細胞腫（Ikematsu　et

al，　2003）や食道癌（Shimada　et　al，　2003）、肝臓癌患者（Jiaθご鋤2007）での有用性が報告さ

れている。治療ではミッドカインアンチセンスDNAや抗ミッドカイン抗体を用いた研究が進

められ、大腸癌（Takeiθオ以2001）や骨肉腫細胞（Maeharaθご謡2007）で腫瘍細胞の増殖

抑制効果が証明されている。

14

5－3．本研究の目的

前述のように様々な癌におけるミッドカインの過剰発現を背景に、ミッドカインを標的とし

た診断や治療への応用が報告されてきたが、これまで口腔扁平上皮癌と血中のミッドカイ

ン濃度を研究した報告はない。

そこで本研究では口腔扁平上皮癌とミッドカインの発現関係を明らかにし、血中ミッドカイ

ン値が口腔癌の早期発見や予後予測因子のマーカーとなりうるかどうかを検討することで

新たな治療戦略への可能性を模索する。さらにミッドカインと薬剤耐性の病態解明にむけ

て、p53とミッドカインの関係に注目した病態解析を行うことを目的とする。

15

6．実験方法

6－1．正常および患者検体

患者検体は熊本大学医学部附属病院歯科口腔外科にて一次治療を行った口腔扁平

上皮癌患者の血清60検体と血漿54検体、および治療前の生検標本113症例を対象

とした。正常検体は同意の得られた臨床検査医学会会員や熊本大学病院職員およびそ

の家族より採取した血液サンプル（血清134検体および血漿92検体）と埋伏智歯抜歯時

に得られた正常口腔粘膜28症例を対象とした。

　全ての患者には十分なインフォームドコンセントを行った後に同意を得て検体を

使用し、健常人の検体採取に際しても同様にインフォームドコンセントを行った後

に同意の得られた場合にのみ検体を採取した。

6－2．抗体および試薬

ミッドカインのCドメインにエピトープを持つマウスモノクローナル抗体であるIP14、　Nドメ

インにエピトープを持つIP10は、株式会社セルシグナルズ（Yokohama，　Japan）より御供与

頂いた。また、免疫蛍光分析装置により使用したマウス由来の抗ミッドカインモノクローナ

ル抗体であるIP10とIP9、　SC2とSC4は東ソー株式会社（Tokyo，　Japan）より御供与頂いた。

抗p53抗体はウサギポリクu一ナル抗体RSP53（Histofine，　Tokyo，　Japan）を使用した。検出

システムは、EnVision　System　HPR（Dako，　Glostrup，　Denmark）を購入し実験を行った。

Western　Blotting法では一次抗体にウサギ抗ミッドカインモノクu一ナル抗体である

FEPI　143Y（EPITOMICS，　Burlingame，　CA）とマウス抗βアクチンモノクn一ナル抗体

AC－15（Sigma，　St．　Louis，　MO）を使用し、二次抗体にはHRP標識抗ウサギIgG抗体

（Dako）を使用した。

16

6－3．培養細胞

本研究で使用した細胞株はSAS細胞、　HSC－3細胞、　HSC－4細胞、　HCT116　p53（＋／＋）細

胞、HCT116　p53（一／一）細胞の5つである。培養に用いた全ての器具類はγ滅菌済みのも

のを使用し、全ての操作はタリー一・・ンベンチ内で無菌的に行った。また、全ての細胞は37℃、

5％CO2下で山地培養した。

ヒト舌扁平上皮癌由来のOSCC細胞株であるSAS細胞、　HSC－3細胞、　HSC－4細胞は東

北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター（仙台）より購入した。ヒト大腸癌細胞

株でp53野生型であるHCTI16　p53（＋／＋）細胞とp53をノックアウトしたHCT116　p53（一／一）

細胞は、慶慮義塾大学医学部先端医科学研究所遺伝子制御研究部門教授佐谷秀

行先生、Johns　Hopkins大学のDr．　Vogelsteinの許可を得て、熊本大学大学院医学薬学

研究部先端生命医療科学部門分子機能薬学講座遺伝子機能応用学分野教授甲斐

広文先生より御供与頂いた。SAS細胞、　HSC－3細胞、　HSC－4細胞は10％ウシ胎児血清

（FBS）（lnvitrogen，　Carlsbad，　CA）を加えたRPMI　1640（Roswell　Park　Memorial　Institute）

（lnvitrogen）を使用し、　HCT116　p53（＋／＋）細胞、　HCT116　p53（一／一）細胞はIOo／．FBSを加え

たDMEM（Dulbecco’s　Modified　Eagle　Medium）（lnvitrogen）で培養を行った。

実験に使用する際は細胞を培養ディッシュに約90％コンフルエントまで培養して使用し

た。培地上清を実験に使用する際には、FBSを含まないDMEMに交換した上で行った。

6－4．実験動物

本研究では、p53一／一マウスおよびコントロールとしてC57／BL6を用いた。使用した

p53一／一マウスは共同研究者である熊本大学大学院医学薬学研究部遺伝子機能応用

学分野教授甲斐広文先生を通して御供与頂いた。

8～12週齢のマウスをCO2暴露により窒息死させ、正中線より開腹し脾臓、小腸、肝臓

を切断、摘出した。摘出物はphosphate　buffer　saline（PBS）で洗浄後、液体窒素に沈め凍

結保存した。

17

6－5．Western　blotting法

使用した検体はインフォームドコンセントを行い、同意を得て埋伏抜歯時に採取した正常

口腔粘膜4症例と、生検時に採取した未治療の口腔扁平上皮癌組織5症例（舌癌2例、

上顎歯肉癌1例、下顎’歯肉癌2例）である。

本研究では蛋白質抽出の際に、前処理としてミッドカインのヘパリン結合性を利用し、組

織抽出液を一旦ヘパリンセファm一スと結合させた後に熱により分離した。具体的には摘

出組織20皿gを組織溶解バッファー〈M－PER　mammalian　Protein　Extraction　Regent

（PIRERCE，　Rockford，　IL）200μ1十プロテアーゼ阻害剤カクテル（Nacalai　Tesque，　Kyoto，

Japan）〉で処理し、13000　rpmで10分間遠心器にかけ不要物を除去した。その後、　BCA

Protein　assay　Kit（PIRERCE）で蛋白質の定量を行い、400μgの蛋白質に1mlのPBSと50

μ1の50％Heparin　sepharose（GE　Healthcare，　Buckinghamshire，　UK）を加えた。氷上で1

時間三二後に13000rpmで5分間遠心し、上清を除去した。沈殿物は遠心分離器を用い

てPBSで洗浄後、　SDSサンプルバッファーで調整し95℃で5分間加熱した。　SDSポリアク

リルアミドアシドゲル電気泳動（SDS－PAGE）は15％ゲルを使用し、ニトロセルロ・一ス膜に

100皿A、1時間で転写した。転写後の膜は10％スキムミルクをO．10／。Tweenを加えたPBS

（PBST）溶液で1時間ブロッキングを行った後に1次抗体（FEPI143Yは2000倍、　AC－15

は10000倍希釈）で4℃、over　nightで反応させた。　PBSTで洗浄後に2次抗体（0．1％

PBSTで2000倍希釈）を室温で1時間反応させ、再度PBSTで洗浄した。発色はECL　Plus

Western　Bl・tting　Detectlon　System（GE　Healthcare）を用いて行った。その結果得られた

バンドはLAS－4000　mini　EPUV（Fuji　Film，　Tokyo，　Japan）を用い、βアクチンで補正するこ

とで定量化し解析した。

18

6－6．免疫組織化学染色．

本研究では生検時もしくは腫瘍切除時に採取した未治療の口腔扁平上皮癌組織113例

を使用した。組織は4％パラホルムアルデヒドで固定後にパラフィン包埋して、厚さ4mに薄

切し、MASコートスライドグラス（Matsunami・Glass　lnd．，Ltd。，　Osaka，　Japan）に接着、固定し

た。切片はキシレンで脱パラフィン後、10mM’1クエン酸緩衝液を用いてミッドカインにはマイ

クロウェーブ（15分間）、p53にはオートクレーブ（121℃、20分間）で抗原の賦活化を行っ

た。その後0．3％H202含有メタノールにて30分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性の

除去を行った。非特異反応のブロッキングはnon・Speci丘。　Staining　Blocking　Reagent

（Dako）に15分間、室温で反応させた。1次抗体（IP10は25倍、　IP14は100倍、　RSP53

は1000倍希釈）は4℃、over　nightで反応させ、　Envision＋HRPで標職させた。発色はDAB

基質キット（Dako）で行い、ヘマトキシリンにて核染色を行った後に封入し標本を作製した。

ミッドカインの組織染色の評価は、200倍顕微鏡下で染色性の強い腫瘍部分を選定し、2

人の研究者により腫瘍細胞の陽性部位を4群に分類し点数化した。p53の評価は同様の

手法により、腫瘍細胞の5％以上が染色されていた場合を陽性、5％以下の場合を陰性と

した。

PQsi血ve蓋「諏te　of

cancer　tissues

　　　　　Imilnunoreactiye：Ev蹟IUa纐σn

　　　　　　　Po韮nt

lge一一7eOlo

70　・一3e　el．

3e　・一5　O／e

　s　Ne　o／o

st17emg

me（lerate

weak

neg恥日別

3

2

10

表2ミッドカイン発現評価法

Positive　rute　of

¢ancer髄鰐ues

leO　t一一K．　Ole

　．f　．yett

E▼罰1眠a樋on

1）GSitiye

neg；ltive

表3p53発現評価法

19

6－7．　ELISA

ELISAは口腔扁平上皮癌患者の血清60検体と血漿54検体、明らかな疾患を持たない

健康正常人血清134検体と血漿92検体を用いてMIDKINE　ELISA　KIT（Cell　Signals

IncりYokohama，　Japan）で血中ミッドカイン濃度測定を行った。

抗ヒトミッドカインIP10抗体を結合させた抗体固相プレートに検体25μ1およびビオチン

化工ヒトミッドカイン抗体を加え、室温で4時間反応させサンドイッチ複合体（固相抗体一二

原一ビオチン化抗体）を形成させた。洗浄後、増幅二二（ストレプトアビジンPOD）100μ1を

プレートに添加し、10分間、室温で反応させた。再度洗浄後、基質液（TMB試薬）IOO　pc　1

を追加し10分後に反応停止液（2M　HCI）50μ1を加えた。最終的には450　nmで吸光度変

化を測定し二二体中のミッドカイン量を測定した。

6－8．　EIA

　　ミッドカインの濃度測定は、ELISA以外に2種類の抗ミッドカインマウスモノクローナル

抗体を用いた1ステップサンドイッチEIA法で、全自動エンザイムイムノアッセイ装置

AIA－60011（東ソー株式会社）を用いて行った。対象はインフォームドコンセントを得られた

口腔扁平上皮癌患者の血清60検体、健康正常人血清134検体とした。

　具体的には磁性ビーズ固相抗ミッドカインマウスモノクm一ナル抗体とアルカリ性ホスフ

ァターゼ標識抗ミッドカインマウスモノクローナル抗体が凍結乾燥状態で封入してある試薬

カップに、分注水と血漿サンプル（50μ1）を添加し、ミッドカインと2種類の抗体による抗原

抗体反応を開始させた。37℃、10分間反応を行った後、洗浄水で洗浄し遊離の酵素標識

抗体と検体成分を除去した。その後、磁性ビーズに結合した酵素活性を測定するため、酵

素基質として4一メチルウンベリフェリルりん酸を添加して37℃、5分間酵素反応を行った。

ミッドカイン濃度に依存して増加する蛍光物質（4一メチルウンベリフェロン）の生成速度を

測定し、予め作成した検量線から血漿、血清中のミッドカイン濃度を算出した。本研究では

固相にSC－2抗体、標識にSC－4を用いた場合と、固相抗体にIP－10抗体、標識抗体にIP－9

抗体を使用した場合の2つの手法で検討を行った。

20

6－9．RNA抽出およびRT－PCR

本研究でRNAを抽出した検体は、インフォームドコンセントの得られた未治療の口腔扁

平上皮癌組織60症例と正常口腔粘膜28症例を用いた。組織からのRNA抽出は20mgを

Lysing　Matrix　D（Qbiogene，　Morgan　Irvine，　USA）中で、The　FastPrep⑪Instrument

（Qbiogene）を用いて破砕した後、　RNeasy　Mini　Kit（QIAGEN，　Hilden，　Germany）を用い

RNAを抽出した。また、　RNase－Free　DNase　Set（QIAGEN）を併用し、デオキシリボ核酸

（DNA）のコンタミネーションを排除した。摘出したマウスの臓器と細胞のRNA抽出は

Trizol（lnvitrogen）を用いて行った。抽出は500μ1のTrizolを細胞に加えた後、5分間室

温で反応させて融解した。その後、100μ1のクロロフォルムを添加し二二後、遠心分離

（12000rpm、12分間）により得られた水層を回収した。この水層に250μ1のisopropanolを

加えて撹絆後、isopropanol沈殿を得た。得られた沈殿を75％エタノールで洗浄しRNase

free　H20に溶解した。得られたRNAは、マイクロ分光光度計NanoDrop　ND－1000

（NanoDrop　Technologies，　Wilmington，　DE，　USA）で濃度の測定とA260／A280　nm比で純度

の測定を行った。

　抽出したRNAはExScript⑪RT　reagent　Kit（TAKARA　BIO　Inc．，　Shiga，　Japan）で

Random　6　mersを用いて、37℃で15分間、逆転写したものを、　Reverse　transcriptase

－polymerase　chain　reaction（RT－PCR）やreal－time　RT－PCRのテンプレートとして使用した。

RT－PCRはTaKaRa　Ex　Tag｝Hot　Start　Version（TAKARA　BIO　Inc）を用いてProgram

Te皿p　Control　Sys毛em　PC816（ASTEC，　Fukuoka，　Japan）で行った。　PCR条件は、初期変性

を94℃5分、1サイクル、PCR反応はtouch　down　PCRを行い、94℃35秒、72℃40

秒を5サイクル、94℃35秒、70℃45秒を5サイクル、94℃35秒、68℃40秒を30

サイクルとし、予備伸張を72℃10分で行った。PCR産物は4％アガロースゲルを作成し

Mupid－2（Cosmo　Bio　Co．，Tokyo，Japan）で電気泳動を行った。さらに日立マイクロチップ電

気泳動システムSV1210コスモアイ（Hitachi　Electronics　Engineering　Company，　Tokyo，

Japan）でPCR産物のサイズと発現確認を行った。

rea1－time　RT－PCRは検体に含まれる各mRNA量を、　LightCycler⑧480　SYBR　Green　l

Master（Roche　Diagnostics，　Base1，　Switzerland）を用いて、LightCycler⑱480（Roche

Diagnostics）で測定した。　PCR条件は、初期変性を95℃10秒、1サイクル、　PCR反応

は95℃5秒、60℃20秒を45サイクル、融解曲線分析を95℃5秒、65℃10秒、95℃

0秒（0．2℃／秒）で行った。解析で使用したプライマーの配列は表4の通りである。目的

遺伝子の相対定量値は、発現の確認されている検体を段階希釈し検量線を作成したうえ

21

でglyceraldehyde　3－phosphate　dehydrogenase（GAPDH）、β2Mとの比率で算出した。

ヒト

　　ミツドカイン

　　（Exon　1－2）

　　ミッドカイン

　　｛Exon　Z－5）

　　短縮型ミツドカイン

歴53

　　B2ミクログロブリン

　　（6　2M＞

マウス

　　ミツドカイン

響旗emMehy｛置e

3－Phos1蚤血漁

｛置e町｛置rog9．nase

（GAPDII）

fonyard

rever舶

feirw’ut一（1

1’evel’se

f（レlrrv’ar確

『¢ver謬e

『‘，牌職rd

1’evel’se

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fe　m’a　rd

rev｛｝『駅

feiasra　rd

1屯ever謬e

5’一　A（｝AT（Y（1－4NG（：A（T　CC．AC（S（rT　一3’

5’・一　CrrTCTTTTTGGCGACCG　一3’

5！一　一4．　TCCAGC．．．4CCIG．4．　CCCTTC（IT　一3’

5L　AT（rCr．AG－tGC．”GGCGTC，TA（［］；T　一3’

K．　S一　GTCGCCA．　．tM　一A．　一E4G．i．Xi4．4．　G（1（：G　d－3’

f　’一　TI’GG（1　（rTTTGCTTTGGTCI　T　一3’

K．　’一ACTAAGCG4GC．4（rT（　CC（：A．4C　一3，

5L（ICT（1．4．　TI”CAGCTCTCGG‘M（IAT（1　一3’

g．　’一CGGGCATTCCTG－L4CCTGA　一3’

：一’一GC　．ATG．G．．AT（；．r　AA．AL（rCC，4（　ACACATA（1　一3，

5’一．4．　GCG（I　GTCT（C．A．　ITT（！；C．iL4GGT　一3’

5　’　一一TTG　GTGC　（：f－4－GT（．［r　（：r　TC　CI　（1　一4T　一3　，

K．　’」一一NL4T（［1；CTG．．4L4GGTCGGTGTG　一3　’

f　，一TGMGGGGTCIGTTGATGG　一3’

表4プライマー一覧

22

6－10．遺伝子導入（DNA　Transfection）

本研究におけるTransfectionはTranslT－LT　1（Mirus，　Madison，　WI）を用いて行った．ま

ず，50μしのOpti－MEM（lnVitrogen）にTranlT－LT1を添加し撹愉した後，室温で15分間

反応させた。その後、目的遺伝子のプラスミドを添加し、さらに15分間反応させた後、細胞

に滴下した。実験にはTransfbction後42時間後の培養細胞を使用した。なお、

TransIT－LTIはDNA量との比が1：4となるように調整した。

6－11．RNA干渉（siRNA）

p53に対するsmall　inter艶ring　RNA（siRNA）はSilencer⑭　Validated　p53　siRNA（AppHed

Biosystems，　Foster　City，　CA）を用い、コントu一ルとしては既知の遺伝子転写産物の全て

をター一一・一デットにしないSilencer②Negative　Control＃1　siRNA（Applied　Biosystems）を使用し

た。配列は以下の通りである。

Sense　5’一　GGGUUAGUUUACAAUCAGCtt　一3’

Antisense　5’一GCUGAUUGUAAACUAACCCtt－3’

Transfectionには1ipofectamine2000（lnvitrogen）を使用し、約50％のコンフルエント状態

にある細胞に終濃度30nMになるようにsiRNAを調整し導入した。

6－12．統計学的解析

統計学的解析は、先ずデータの正規性についてShapiro－Wilks　tes七を行った。正規性が

あるものにはStudent’s　t－testとanalysis　of　variance（ANOVA）を使用し、正規分布が証

明できない場合にはKruskall－Wallis　testで解析を行った。変数問の相関係数は単回帰分

析により求めた。カットオフ値の設定はreceiver　operating　characteristic（ROC）カーブを

用いて行った。生存率の算定はKaplan－Meier法で行い、生存率の差の検定には

log－rank　testを使用した。全ての解析には統計学的ソフトJMP　5，1（SAS　Institute　Japan，

Tokyo，　Japan）を使用した。統計学的有意差はP高く0．05とした。

23

　　　　　　　　　　　　　　　7．実験結果

7－1．口腔扁平上皮癌におけるミッドカイン発現

7－1－1．ミッドカインの遺　子

7－1－H．ミッドカインの遺伝子発現

口腔扁平上皮癌におけるミッドカイン遺伝子の発現を検討するため、口腔扁平上皮癌組

織60例と正常口腔粘膜上皮28例からRNAを抽出し、　real－time　RT－PCRを用いて解析し

たところ、口腔扁平上皮癌組織に含まれるミッドカインmRNAは、正常口腔粘膜と比較して

有意に高いことがわかった（0．28v80．15　P〈0．05）。

　　　　　　　　　　　　　　　　P　〈O．05

　　　　守1．4　　　屋歪　　　霧日　1．2　　　2閣　　　島自1．0　　　のq職　　　龍・・8

　　　肇e．6

　　　8E　　　g．e　o．4　　　竃　　　　　　O．2

　　　　　　0

　　　　　　　　　　Healthy　OSCC　　　　　　　　　velunteers　patients　　　　　　　　　　（n＝28）　（n＝oo）

図7口腔扁平上皮癌組織と正常口腔粘膜におけるミッドカインmRNA発現

24

口腔扁平上皮癌細胞株におけるミッドカインmRNA発現についても検討し、各種細胞間

でミッドカインmRNAの発現には差があり、HSC4細胞で最もミッドカインmRNAが発現し

ていることがわかった。

』　　

ロ冷　　

〇四　

幽冷　　

〇四　　

ロ冷

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（イZ出唱二4囚気、イZ曽口国一色

　昌O咽霧窪畠回OくZ属目Φと〕儒［詣

　　　　　o

　　　　　　　　　】日lSC3　　　　HSC4　　　　　SAS

図8口腔扁平上皮癌細胞株におけるミッドカインmRNA発現

25

7－1－1－2．短縮型ミッドカインの遺伝子発現

口腔扁平上皮癌における短縮型ミッドカイン発現確認は、まずRT－PCRを行いアガロー

スゲルによる検出を試みた。扁平上皮癌組織の一部門明瞭なバンドが得られ短縮型ミッド

カインの存在が示されたが、多くの癌組織や細胞株ではバンドが薄く判定が困難であった。

そのためマイクロチップ電気泳動を行いPCR産物の確認を行ったところ、短縮型ミッドカイ

ンの発現は全長ミッドカインと比較して極めて発現量が少ないことが確認できた。

A

ンピ9島二〇『

ωンq励6①＝

一山の（一ム。①一一

出q駐（一匂60＝

上顎歯肉癌組織①

上顎肯肉癌組織④

下顎歯肉癌組織③

下顎爾肉癌組織②

血meng血Afidkine

truncated　Alidkine

B：itsl－L

truncatcd　“・lidkinc

　　　　　　×

N　Jn

」遊

八　tb。。一メ野｝＼　．　，孤＿

　　　図9短縮型ミッドカインの発現確認

A：アガロース電気泳動B：マイクロチップ電気泳動

　　　　　　　　ロリエ＼＿＿＿＿＿」＼＿，

〜

26

次に、短縮型ミッドカインはエクソン3の欠落したアイソフォームであることから、プライマ

ーをエクソン2から4にまたぐように設計しreal－time　PCRを用いて定量的解析を試みた。

しかし、発現量が少なく検量線による測定が困難なため、短縮型ミッドカインの発現は定

性のみ可能であった。その結果、短縮型ミッドカインは口腔扁平上皮癌組織93例中58例、

正常口腔粘膜の27例中2例で発現していた。アガロース電気泳動では確認できなかった

SAS細胞、　HSC3細胞、　HSC4細胞でも、短縮型ミッドカインの存在が確認できた。

MK’ t－rvlK

　g，As

HSC3

HSC4Nermalmucot　：｝

oscc

　　十

　　十

　　十

27／27　（100e／e）

93／93　（100e／G）

　　　十

　　　十

　　　十

2／27　（7．40／e）

58／93　（62．40／e）

表5口腔扁平上皮癌細胞および組織のミッドカインと短縮型ミッドカイン発現

27

7－1－2．ミッドカインの蛋白　発現

7－1－2－1．Western　blotting解析

Western　blotting法では口腔扁平上皮癌組織、正常口腔粘膜組織から抽出した蛋白質

を一旦ヘパリンセファロースと結合、分離することで明瞭なミッドカインのバンドが得られた。

βアクチンは45kDaでバンドを検出し、ミッドカインは13kDaでバンドを確認した。正常口

腔粘膜でも4例中3例で少量のミッドカイン発現が確認されたが、口腔扁平上皮癌組織に

比較すると発現量にはかなり差が見られた。口腔扁平上皮癌の中では舌癌に比べ下顎歯

肉癌で太いバンドが得られたが、部位別発現については更なる検討が必要である。

B　actin

Alidkine

章

Pee”h’eeept一

読 eeeaNDalD正常口腔粘膜②

正常口腔粘膜①

正常口腔粘膜④

正常口腔粘膜③

舌癌組織②

舌癌組織①

下顎歯肉癌組織⑤

下顎爾肉癌組織④

上顎粛肉癌組織③

7h乙嘗・ヌ葺匿

図10Western　blotting法におけるミッドカイン蛋白発現

28

以上得られた結果をβアクチンで補正しバンドの濃度と太さを定量化すると、ミッドカイン

発現量は正常口腔粘膜が0．0088±0．0027（平均値±SD）で、口腔扁平上皮癌組織が

0．0221±0．0034となり、後者が統計学的にも有意に高い結果となった。

p　〈o．oos

3．5

ao

ﾑ⑳怖旬α5

（ξり儒職、】巴

琴毯。』費。㊥唱峯》掴2

oHeanthv

volunteers

（n　＝　4）

osccpatients

（n　＝　5）

　（Akdti　Gaitge　Ver3．0）

図11正常口腔粘膜と口腔扁平上皮癌組織におけるミッドカイン蛋白発現の比較

29

7－1－2－2．免疫組織化学染色

免疫組織化学染色はNドメインと、Cドメインにエピトープを持つ2つの抗ミッドカイン抗

体で検討を行った。染色強度はミッドカインのN末端に反応部位を持つIPIO抗体が、　C

末端にエピトープを持つIP14抗体に比較し高い傾向が見られた。

A・引 Y∵　ず，丸’・1・’．・

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　　ロ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ヌ　く　　　ロぷ

　　　　　　　　　　　　　　　ヒヒ　ゆワ　　　　　　　　　　、　iぎ三瀬　し　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ず　コ　　　　　　　　　ド　　コじ

認＼壌；妻嚢

IP－10　IP－14∫説灘繋Bl難儀：

D

　図12口腔扁平上皮癌組織と腺組織の免疫組織染色写真

　　　　　（59歳、男性、T2N2bMO、下顎歯肉癌）

ω（C）：IP・10抗体．（B）（D）：IP－14抗体．ω～（D）：扁平上皮癌組織

　　（A）　（B）：　×　40，　bar　＝1　mm，　（C）　（D）：×　200，　bar　＝　200　pm，

30

ミッドカインの癌組織における染色範囲を点数化するとIP10抗体が2．06±0．93（平均値

±SD）で、　IP14が1．85±1．03と有意差はなく染色部位もほぼ一致していた。　IP10抗体と

IP14抗体の陽性率はそれぞれ、93．8％と86．7％であった。

A．

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IPIO

eg印“w｝　“▼eak　　　　　Llo⊂巴era愈e　　　　　　　S重70ng

r15 n＝24 r37 n胃37

属 r25 n＝35 n＝46

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3　

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Φ三。畠当遷ξ9§彗日三

MlO IPI　4

図13エピトープの違いによる抗ミッドカイン抗体の検討

A：抗体別ミッドカイン発現域B：各抗体での平均染色点数

31

7－2．ミッドカインの腫瘍マーカーとしての検討

7－2－1．血液　体の違いによるミッドカイン測定

血清、血漿中のミッドカイン濃度をELISAで比較検討した。まず血清ミッドカイン濃度は

健常者が75．7±14．9pg／m1（平均値±SD）で、口腔扁平上皮癌患者が354．5±256．8

pg／mlであり、有意に癌患者で高くなっていた。血漿ミッドカイン濃度でも同様に、健常者

が124．2±40．4pg／m1（平均値±SD）で、口腔扁平上皮癌患者が335．3±376．7　pg／m1と癌

患者のミッドカイン濃度が高かった。以上の結果より血清、血漿に関わらず、血中ミッドカイ

ン濃度は健康正常人より口腔扁平上皮癌患者で有意に高いことがわかった。

㎜　　

o　

珈　

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㎜　

㎜　

㎜

（窟葡島）雷●冒儒ち昌Oり雷Oリリ一一‘目5』O硫

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（一号◎ω畠）昌O三二』佃昌Oり昌Oリリ一日‘儒∈昌魂儒一山

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図14血清、血漿における健常人と口腔扁平上皮癌患者のミッドカイン濃度比較

32

7－2－2ELISAと免　”∠　’　を用いたEIAの比

血中ミッドカイン濃度の測定が腫瘍マーカーとして有用である可能性が示唆されたため、

ここではスクリーニングとしてより実用性をあげるためEIAによる免疫蛍光分析装置を用い

た検討を行った。EIAによる測定は血清を用いて行い、2種類の異なる抗体で比較検討し

た。免疫組織化学染色の結果を受け、ELISAも含めて全てNドメインにエピトープを持つ

抗体を使用した。

前項で示したようにELISAによる血清ミッドカイン濃度は、健常人が75．7±14．9　pg／ml、

口腔扁平上皮癌患者が354．5±256．8pg／mlであった。　IP抗体を用いたEIAによる測定で

は健常人が406．3±99．1pg／ml、口腔扁平上皮癌患者が539．9±327．5　pg／mlで、　SC抗体

を用いた場合にはそれぞれが419．1±97．9pg／m1、885．9±465．O　pg／lnlであった。全ての

測定法で、統計学的有意差を持って口腔扁平上皮癌患者で高値を示した。

そこで、より特異度が高い検査法を検討するためにP値を比較したところ、ELISA、　IP抗

体によるEIA、　SC抗体によるEIAの順に、　P値は5．80×10－23、2．97×10’3、1．76×10－22と

なった。本結果より、EIAによる免疫蛍光分析装置を用いた血清ミッドカイン検査法は有効

な検査法であり、特にSC抗体を使用した場合にはELISAと同等に特異度が高い腫瘍マ

ーカーになりうることが示唆された。

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鋤　

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o一　o－　o　　Heatthy　oscc　Healttry　oscc　Healthy　oscc　volunteers　patients　volunteers　pntients　N，olunteers　patients　　（n＝IN）　（n＝60）　（n＝134）　（n＝60）　（n＝13－D　（n＝60）　　　A．　ELISA　B．　EIA（IP　antigen）　C．　EIA（SC　anngen）

図15血清、血漿における健常人と口腔扁平上皮癌患者のミッドカイン値の比較

33

7－2－3．臨床病理学的因子との比較検討

更に臨床病理学的因子との比較検討を行うため、SC抗体を用いたEIAによる血清ミッド

カイン値による詳細な検討を行った。まずは健常人と口腔扁平上皮癌患者の臨床データ

を下記に示す。男女差、平均年齢、喫煙歴においては両群間に有意差は認められなかっ

たが、各項目において癌患者の血清ミッドカインは高値を示した。また、年齢では健常人、

癌患者共に60歳以上で血清ミッドカイン値は高くなっていたが、年齢にかかわらず（60歳

前後にかかわらず）健常人より癌患者で血清ミッドカイン値は高い結果となった。

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表6各因子における健常人と口腔扁平上皮癌患者の血清ミッドカイン値

34

次に口腔扁平上皮癌の臨床病理学的因子と血清ミッドカイン値について比較検討を行

った。臨床病期、腫瘍径、頸部リンパ節転移の有無、病理学的分化度、いずれにおいても

血清ミッドカイン値との相関関係は認められなかった。そこで、健常人と臨床病期別血清ミ

ッドカイン値を比較検討した。解析の結果、健常人のミッドカイン値が419．1±97．9pg／ml

であるのに対し、ステージ1では931．2±443．3pg／ml、ステs・・一一ジll　864．8±559．7　pg／ml、

ステージ皿839．8±317．O　pg／ml、ステージIV　900．5±464．2　pg／mlと、癌の早期段階より

血清ミッドカイン値は増加していた。

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図16健常人と口腔扁平上皮癌患者の臨床病期別血清ミッドカイン値

35

　カットオフ値はROC曲線を用いて650　pg／m1と設定した。下記には再度、健常人と口

腔扁平上皮癌患者の血清ミッドカイン値を示す。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　p　〈e．oo1

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　　　　　　　　　v・eltinteers　patients　　　　　　　　　（n＝134）　（n＝60）

図17健常人と口腔扁平上皮癌患者の血清ミッドカイン二

本カットオフ値を用いて血清ミッドカイン値を650pg／ml以上の高値群と三値群に分類し

たとき、高値群の5年累積生存率は56．6％で、即値群では82．9％であった。両群間にはロ

グランク検定で統計学的有意差が認められ、血清ミッドカイン値が口腔扁平上皮癌の予後

のマーカーとなりうる可能性があることが示唆された。

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　　　　　　　　　　　　　　　　　　ヨ　　　　　　　　　　　　ロ　　⑪　　　　　　　2⑪　　　　　　　4e　　　　　　　6G

　　　　　　　　　　　Time（months）

図18　Kaplan－Meier法による血清ミッドカイン門別5年生存率

36

　5年累積生存率については他の臨床病理学的因子でも検討を行い、臨床病期や腫瘍

径、頸部リンパ節転移との問に強い相関関係を認めたが、血清ミッドカイン値で有意差は

認めらなかった。

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表7口腔扁平上皮癌患者の血清ミッドカイン値と

　臨床病理学的因子および5年累積生存率

37

血清ミッドカイン値と予後に相関が認められたにもかかわらず、生存率に関与する他の

臨床病理学的因子（臨床病期、腫瘍径、頸部リンパ節転移）との間に相関が見られなかっ

たため、再発もしくは後発転移の有無と血清ミッドカイン値について検討した。しかし再発・

転移群の血清ミッドカイン値は、再発・転移なし群と比較し高い傾向に見られたが有意差

はなかった（833．1±305．3pg／ml　VS　722．0±192．1　pg／ml；P＝0．17）。

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（n　＝　20）

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図19再発・転移の有無とミッドカイン値

38

7－3．ミッドカインとp53

7－3－1．免疫組織化学染色による53とミッドカインの比

口腔扁平上皮癌組織においてp53とミッドカインの発現を免疫組織化学染色において

比較検討した。下図に示すように、陽性症例における抗p53抗体による発現部位は癌組

織と異形上皮の一部、特に基底細胞に近い部分において認められた。一方IP抗体による

ミッドカインの発現も癌組織を中心に認められたが、異形上皮組織では全層にわたり発現

していた。

図20口腔扁平上皮癌組織と腺組織の免疫組織染色写真

　　　　　（70歳、女性、T2N20MO、頬粘膜癌）

（A）（C）：抗ミッドカイン抗体（IP－10）．（B）（D）：抗p53抗体（RSP53）．

　　（A）　（B）：×　40，　bar　＝2　mm，　（C）　（D）：　×　100，　bar　＝　500　pm．

39

さらにp53の染色性を陰性群と陽性群に分類し、ミッドカインの発現を点数化して比較検

討した。その結果、p53陰性群のミッドカイン染色点数は1．63±0．94点であるのに対し、

p53陽性群では2．36±0．81点と有意差が認められた（P＜0．005）。

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P53　negntive　P53　posttis’e

　（n＝4D　（n＝66）

図21抗p53抗体の染色の有無とミッドカイン発現点数

40

7－3－2．53＋／＋）（＋／一）（一／一）マウスにおけるミッドカイン発現

p53（＋／＋）、（＋／一）、（一／一）マウスからそれぞれ摘出した小腸、肝臓、脾臓を用いて、ミッ

ドカインmRNAの発現をreal－time　PCRを用いて解析した。全ての臓器において、　p53

（＋／＋）マウスよりp53（＋／一）マウスの方が、そしてp53（＋／一）マウスよりp53（一／一）マウスの方がミ

ッドカインの発現は高い傾向が見られた。

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C．　Spleen

図22p53（＋／＋）、（＋／一）、（一／一）マウスの各臓器におけるミッドカイン発現

41

7－3－3．53（＋／＋）（一／一）大腸　細胞株におけるミッドカイン発

前項のマウスによる結果を受けて大腸癌細胞株であるHCT116　p53（＋／＋）細胞とHCT116

p53（一／一）細胞でのミッドカインmRNA発現を比較した。本解析においても野生型ミッドカイ

ンを持つp53を持たない細胞ではミッドカインの発現が増加していた。

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図23HCT116　p53（＋／＋）細胞、　HCT116　p53（一／一）細胞におけるミッドカイン発現

42

7－3－4．53（一／一）大腸癌細胞　への野生型53の遺伝子’入

HCT116　p53（一／一）細胞に野生型p53遺伝子を導入し、　p53遺伝子増加を確認した後に、

ミッドカインmRNAの発現を検討した。解析の結果、野生型p53遺伝子の導入はミッドカイ

ン発現量の低下を引き起こすことがわかった。

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　　　　　　　＋“ild　tJl）e　p53　＋“ild　type　p53

　図24HCT116　p53（一／一）細胞への野生型p53遺伝子の導入

43

7－3－5．siRNAを用いた53（＋／＋）大腸癌細胞株での53発　　制

野生型p53遺伝子を持つHcT116細胞から、　siRNAを用いてp53遺伝子発現を減量さ

せることにより、ミッドカインの発現量が変化するかを検討した。本研究では、FBS中に含ま

れる成長因子やサイトカインの影響を除外するために、細胞回収5時間前にFBSの入っ

てない培養液に交換し、細胞回収と同時に細胞上清を採取した。

p53　siRNAの遺伝子導入によりp53遺伝子は約30％程度に発現抑制できたが、ミッドカ

インmRNA発現はとの間に相関はみられなかった。そのため、細胞上清中のミッドカイン濃

度をELISAにて計測したところ、細胞上清中のミッドカイン値はsiRNA導入後に有意に上

昇していた。

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図25HcT116　p53（＋／＋）細胞へのp53　siRNAの遺伝子導入

44

7－3－6．口腔扁平上皮癌細胞株への野生型53の遺伝子’入

本研究では、p53のアミノ酸配列が野生型と変わらないSAS細胞と、　DNA結合部位のコ

ドン248に変異を認めるHSC4細胞を用いて実験を行った。

その結果、どちらの細胞においても野生型p53遺伝子導入によりミッドカイン発現は約

70％に抑制された。コドン248に変異のあるp53では薬剤感受性においてdominant

negativeな効果が指摘されているが、ミッドカイン発現においてはその効果はみられなかっ

た。

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図26SAS細胞HSC4細胞への野生型p53遺伝子の導入

45

8．考察

1．口腔扁平上皮癌におけるミッドカインの発現と腫瘍マーカーとしての検討

これまで口腔扁平上皮癌患者において血中ミッドカイン発現を検討した報告はなかった

が、ミッドカインは口腔扁平上皮癌組織で他の悪性腫瘍と同様に過剰発現していた。そこ

で、本研究では分泌蛋白であるミッドカインの口腔扁平上皮癌の腫瘍マーカーとしての有

用性について検討した。その結果、われわれは2つの重要な知見を得た。

第一に、血清ミッドカイン値が口腔扁平上皮癌の予後予測因子となりうる可能性が明らか

となった。これは口腔扁平上皮癌の治療方針をたてる上で重要な戦略となりうる。本研究

では血清ミッドカイン値が650pg／mlより高い症例では5年生存率が有意に低かった。しか

も同値は、5年生存率と相関がみられた臨床病期や腫瘍径、頸部リンパ節転移の有無とは

相関関係はみられなかった。これは、ミッドカインが腫瘍の浸潤や転移とは異なる機構で

予後と関連している可能性を示している。

これまでミッドカインと予後との関連については、星細胞膠腫（Mishimaθオ以1997）、神経

膠芽腫（Nakagawara　et　al，1995）、膀胱癌（0’Brienθオ以1996）、食道癌、消化管問質腫瘍

（gastrointestinal　stromal　tumor；GIST）（Kaifi　et　a！，2007）、口腔扁平上皮癌（Ruanθt　a7，

2007）、膵臓i頭部癌（Maeda　et　a！，　2007）などにおいて腫瘍組織中のmRNA量やタンパク質

量と相関があると考えられてきた。さらに、食道癌（Shimada　et　al，2003）、神経芽腫

（lkematsu　et　a！，2003）、子宮内膜癌（Tanabeθオ鋤2008）などでは血中ミッドカイン値と予後

の関連についても報告されている。この中の一部には、転移や腫瘍径と相関があるとする

報告もあるが、ほとんどが臨床病期や転移との相関関係は得られていない。こうした事実も

通常の浸潤や転移とは異なる、ミッドカインと予後を結ぶメカニズムの存在を裏付けている。

ミッドカインは癌の生存や進展を助けるような様々な機能を持っていることが知られている。

例えば細胞の遊走能（Takada　et　al，1997）や血管新生能（Choudhuriθt　a！，1997）、有糸分

裂誘発（Muramatsu＆Muramatsu，1991）、抗アポト・・一一・・シス能（Owadaθオ以1999）などがあげ

られる。中でもミッドカインは抗アポトーシス能によって癌の生存を助けるとされている。Qi

ら（Qiθオ以2000）はミッドカインがBcl－2のupregulationを通して、（ウィルムス腫瘍の細胞

株である）G401細胞をシスプラチンがもたらすアポトーシスから免れさせたと報告している。

さらにMirkinら（Mirkin　et　a！，　2005）は、ミッドカインがドキソルビシンの作用から薬剤感受性

細胞を守ることにより、薬剤耐性細胞から機能を細胞間で伝達するような作用を持ち、その

機能はAktの活性化を通してアポトーシスを抑制している可能性を指摘している。また、

46

Kangら（Kang　et　af，　2004）は5一舳orourasil（5－FU）、ドキソルビシン、シスプラチンに薬剤耐

性を示す10種類の胃癌細胞株と耐性を持つ前の細胞株でcDNAマイクロアレイ解析を行

い、薬剤耐性株で最も強発現していたのはミッドカインだったと報告している。これらの報

告は、ミッドカインが薬剤耐性機構に深く関与し、さらにその機能を細胞間伝達作用により

隣接細胞に伝え、アポトーシスを抑制している可能性を示している。本仮説はミッドカイン

が癌の浸潤や転移に依存しない、予後を規定する最大の要因である可能性を示している。

しかし、本仮説を証明するためには、薬剤耐性や細胞間伝達機構などのさらなる病態解

明が必要である。

一方でミッドカインがもつ血管新生能と予後についても注目する必要がある。Ruanら

（Ruanθt以2007）は口腔扁平上皮癌組織におけるミッドカインの発現が、Vascular

Endthelial・Growth・Factor（VEGF）の増加と相関していると報告し、　Ueharaら（Ueharaθオ以

2004）はVEGFが口腔扁平上皮癌の予後と関連すると報告している。これらの報告はミッド

カインがVEGFを通して血管新生を誘導し、予後と相関する機能を持つ可能性を示してい

る。しかしミッドカインとVEGFの関係を示唆する報告（Krzystek一一Korpacka　et　a！，　2007）があ

る一方で、最近ではミッドカインがVEGFに誘導された血管新生を阻害するという知見も報

告されてきている（van　der　Horst　et　a！，　2008）。血管新生に関するミッドカインの作用につい

ては、VEGF以外の因子が血管新生に関与している可能性も否定できない。このような抗

アポトーシス作用や血管新生以外でもミッドカインが生命予後に影響を与えている可能性

もふまえ、ミッドカインの更なるメカニズム解明が必要である。

第二の知見は、血清ミッドカイン値が口腔扁平上皮癌の早期診断マーカーになりうること

である。本研究では血清ミッドカイン値は健常人と比較してステージ1の段階より急激に上

昇していた。これまでの口腔扁平上皮癌で使用されていたSCC抗原やCEAなどの腫瘍

マーカーは腫瘍の増大や転移に伴い発現が上昇するために、異常値が出たときにはすで

に腫瘍は進展状態にあり早期診断としての有用性は低かった。そのため感度に優れたミッ

ドカインの早期診断マーカーとしての出現意義は大きい。さらにミッドカインは神経芽腫や

食道癌、胃癌（Obata　et　al，　20e5）などの腫瘍マーカーとしての有効性も報告されており、他

の悪性腫瘍でも血中に過剰発現している可能性は高く、全身の癌のスクリーニング検査と

して使用できる可能性は高い。

本研究ではミッドカインの測定法についても解析を行ったところ、免疫蛍光分析装置によ

る二つの抗体を用いたステップサンドイッチ法はELISAよりも簡便で、感度に優れた方法

であることがわかった。本検査法は、より短時間で多量の検体（約1時間に60検体、機械

によっては1時間に170検体）を計測することが可能であり、スクリーニングとして臨床応用

47

できる可能性が高いと考えられる。また、本解析では健常人および癌患者にかかわらず、

60歳以上の高齢者で血清ミッドカインは高値を示した。原因の一つとしては加齢現象や無

症候性疾患への罹患などが考えられるが、明確な理由については不明である。いずれに

しろ血清ミッドカイン測定にあたっては異常値の設定が重要となる。さらに臨床応用に向け

ては、良性腫瘍や前癌病変との比較などその特異度についての更なる検討が必要であろ

う。

ミッドカインには癌特異的に発現すると考えられている短縮型ミッドカインの存在が証明

されており、腫瘍マーカーとしての有用性という観点からは興味深い（Aridomeθt　al，1998；

Miyashiroθオ以1996；Miyashiro　et　E7，1997；Tao　et　a7，　2007）。そこで本研究では短縮型ミ

ッドカインがエクソン3の欠失したスプライシングアイソフォームであることから、本部位にエ

ピトープを持つ抗ミッドカイン抗体（IP10）とCドメインにエピトープを持つ抗体（IPI4）を使

用して免疫化学染色を行った。しかし、癌における陽性率や染色域はほとんど変わらず、

染色強度は明らかに短縮型ミッドカインを認識しないIP10の方が強かった。　IP14の染色性

が弱かった原因としては、ミッドカインの生物活性がほとんどCドメインにあるため、Cドメイ

ンはプロテアS一一・一門や他の因子の影響を受けやすく抗体との反応が薄くなった可能性が考

えられる。Matsudaら（Matsuda　et　a7，　1996）はNドメインには蛋白分解からミッドカインを守る

機能があり安定性が高いと報告している。これもIPIOの染色性が強かった原因の一つで

はないかと考えられる。本解析で短縮型ミッドカインの蛋白発現は確認できなかったが、発

現していたと仮定してもmRNAの割合から推測すると極めて少量であることが推測される。

また短縮型ミッドカインmRNAの発現は、エクソン3と4をまたぐ部分にプライマーを設計し

たところ、real－time　RT－PCRで93症例中58例（62．4％）に確認できたが、全長ミッドカイン

の発現は全例で確認できた。これらの理由から短縮型ミッドカインの存在にかかわらず、

ELISAやEIAではNドメインに反応性を持つ抗体を使用して検討を行った。その結果、口

腔扁平上皮癌の検出において感度に優れた検査が可能であった。

48

ll．　p53の動態に着目したミッドカインの発現動態に関する検討

ミッドカインの生物学的活性やシグナル伝達についてこれまで多くの報告がなされ、徐々

にその機能と伝達機構について解明されてきている。しかし、ミッドカインの発現を調節す

る上流の因子と情報伝達メカニズムについての報告は極めて少ない。これまでの報告で

は、ミッドカインが低酸素により発現上昇（Reynoldsθオ以2004）し、コルチゾールによって制

御されること（Kaplanθご磁2003）、野生型p53遺伝子導入によりミッドカインプuモーター依

存性転写が抑制されること（Yuθオ以2003）がわかっている。さらに最近、その伝達機構とし

てTNFαがNFκBを通してミッドカインの発現を誘発することが報告されている（You魂謡

2008）。しかし、ミッドカインの多彩な機能を考慮すると、ミッドカイン制御に関わる因子が他

にも多く存在すると考えられる。

ミッドカインが抗アポトーシス作用を持ち、薬剤耐性に強く関与し、ミッドカインプUモータ

ーに対する報告があることより、本研究ではミッドカインとp53のシグナル伝達に着目し前

述の研究を行った。最初に口腔扁平上皮癌組織でミッドカインとp53について免疫組織化

学染色で検討したところ、変異型p53を持つ癌組織ではミッドカインの発現が有意に高か

った。そこで次に野生型p53とミッドカインの発現について解析するために、　p53（÷／＋）、

（＋／一）、（一／一）マウスから取り出した臓器やp53（＋／＋）、（一／一）HCT116大腸癌細胞株でミッ

ドカインmRNAの発現を確認したところ、野生型p53をもつマウスやミッドカインではミッドカ

インの発現は抑制されていた。さらにp53（一／一）HCT116細胞に野生型p53を遺伝子導入

するとミッドカインmRNAは減少し、野生型p53が直接もしくは間接的に転写因子としてミ

ッドカインの発現を抑制していることが示された。次にp53（＋／＋）HCT116細胞でp53

siRNAを用いてp53遺伝子発現量を減少させると、ミッドカインmRNAはわずかに減少し

ていたが細胞上清中に含まれるミッドカイン量は増大していた。本解析結果からp53がミッ

ドカインのプロモーターに作用するだけではなく、ミッドカインの遺伝子安定性やミッドカイ

ンの翻訳から分泌に至る蛋白合成系路に何らかの影響を与えている可能性が考えられる。

口腔扁平上皮癌でも同様に野生型p53と変異型p53の発現形質を持つSAS細胞とHSC4

細胞（コドン248の変異）に野生型p53遺伝子の導入を行ったところ、両細胞でミッドカイン

発現が抑制されていた。これはコドン248変異型p53を持つ細胞がミッドカイン発現に関し

ては、dominant　negativeな効果を示さないことを示している。

p53と薬剤耐性については以前より研究されており、最近ではp53遺伝子導入治療薬が

承認され注目を集めている。しかしp53を全身の細胞で作動させることは、大量の放射線

を浴びたときのように、消化管細胞や骨髄細胞に細胞死を引き起こす可能性も否定できな

49

い。今回の解析でミッドカインはp53の下流で薬剤耐性と関与している可能性が高いこと

が証明された。そこで前述のようなp53変異型の腫瘍に対してもミッドカインの発現を抑制

すればp53で起こりうる副作用を受けることなく、より効果的に薬剤感受性を充進できるか

もしれない。これまでにミッドカインを治療対象とした研究報告も散見されている。癌治療に

対してはアンチセンスオリゴDNAや抗ミッドカイン抗体などを用いた腫瘍抑制効果が報告

されている。なかでもTakeiら（Takei　et　a！，　2006）1まMK　siRNAとパクリタキセルを同時に使

用することによりパクリタキセルの効果を増強したという報告は、抗癌剤との併用療法という

視点で興味深い。ミッドカインと薬剤耐性機構に関する病態解析は不明な点が多いが、ミ

ッドカイン抑制により薬剤感受性が増大する可能性は高く、抗ミッドカイン薬は抗癌剤とし

てだけではなく薬剤耐性癌に対する抗癌剤補助薬としての可能性も秘めている。今後、ミ

ッドカインの更なる病態解明と分子治療薬の候補因子としての解析が必要と考えられる。

50

9．今後の展望

ミッドカインの詳細な機能については未だ不明な点が多いが、癌細胞の癌性変化や進

展とは密接に関与した重要な蛋白質であることは間違いない。特に薬剤耐性とミッドカイン

の発現関係については興味深い。今後は更なるミッドカインの病態解明と、ミッドカインを

標的とした癌の診断や治療による新たな治療戦略が期待される。

51

10．結語

本研究では血清ミッドカイン値が口腔扁平上皮癌の感度の高い早期診断マーカーであ

り、予後予測マーカーとしても有用であることを示した。今後は臨床応用に向けて血清ミッ

ドカインの特異度や他疾患での動向についての検討が必要と思われる。

また、p53はミッドカインの上流でその発現を制御している可能性が示され、ミッドカイン

はp53遺伝子治療薬と同様に薬剤耐性の治療薬としての可能性も秘めていると考えられ

る。

52

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