МЕДИЦИНСКИ УНИВЕРСИТЕТ – СОФИЯ ФАКУЛТЕТ ПО ДЕНТАЛНА МЕДИЦИНА

КАТЕДРА „ОБРАЗНА И ОРАЛНА ДИАГНОСТИКА” Ръководител проф. д-р Ангелина Киселова, дм, дмн

Д-р Мариана Петрова Цекова-Янева

ДИАГНОСТИКА И САНАЦИЯ НА ОДОНТОГЕННИ ОГНИЩА. ПРОМЕНИ В ХУМОРАЛНИЯ И КЛЕТЪЧЕН

ИМУНИТЕТ

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т на дисертационен труд за присъждане на образователна и научна степен „доктор”

НАУЧНА СПЕЦИАЛНОСТ 03.03.01. Терапевтична стоматология

НАУЧЕН РЪКОВОДИТЕЛ Проф. д-р Ангелина Киселова, дм, дмн

НАУЧЕН КОНСУЛТАНТ Доц. д-р Мария Николова, дм

РЕЦЕНЗЕНТИ Акад. проф. д-р Богдан Петрунов, дмн Проф. д-р Тереза Джемилева, дм, дмн

______________ София, 2011

Дисертационният труд се състои от 228 страници и е онагледен с

50 фигури, 22 таблици и 8 приложения. Библиографията включва 281 литературни източника, от които 45 на кирилица и 236 на латиница.

Изследванията са извършени в Катедра „Образна и орална

диагностика” на Факултета по дентална медицина, МУ – София; и в Националната референтна лаборатория по имунология (НРЛИ) и в Лабораторията по хуморален и лигавичен имунитет към Националния център по заразни и паразитни болести (НЦЗПБ).

Публичната защита на дисертационния труд ще се проведе на

21.07.2011 г. от 13.30 часа в Първа аудитория на Факултета по дентална медицина, София, ул. „Св. Георги Софийски” № 1, съгласно чл. 76 и 77 от Правилник за условията и реда за придобиване на научни степени и заемане на академични длъжности в Медицински университет – София, и въз основа на Заповед № Р-512/30.05.2011 на Рект. МУ – София, пред научно жури в състав:

Председател: Доц. д-р Снежанка Топалова-Пиринска, дм – вътрешен член Членове: Доц. д-р Мая Рашкова, дм – вътрешен член Акад. проф. д-р Богдан Петрунов, дмн – външен член и рецензент Проф. д-р Тереза Джемилева, дм, дмн – външен член и рецензент Доц. д-р Мария Николова, дм – външен член и научен консултант. Материалите по защитата са на разположение в Катедра „Образна

и орална диагностика” на Факултета по дентална медицина, МУ, София, и са публикувани на интернет страницата на МУ – София.

2

СЪДЪРЖАНИЕ

ВЪВЕДЕНИЕ ......................................................................... 5

ЦЕЛ И ЗАДАЧИ ................................................................... 7

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ ................................................. 9

РЕЗУЛТАТИ ........................................................................ 17

ОБЩО ОБСЪЖДАНЕ ...................................................... 42

ИЗВОДИ ................................................................................. 59

ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................. 62

ПРИНОСИ ВЪВ ВРЪЗКА С ДИСЕРТАЦИОННИЯ

ТРУД ....................................................................................... 63

СПИСЪК НА НАУЧНИТЕ ПУБЛИКАЦИИ И

СЪОБЩЕНИЯ ВЪВ ВРЪЗКА С

ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД ........................................ 64

3

ИЗПОЛЗВАНИ СЪКРАЩЕНИЯ

АП Апикален периодонтит ГХП Генерализиран хроничен пародонтит ЕКТ Електрокожен тест ЕОД Електро-одонто диагностика ИО Имунен отговор ЛЕП Лезии от ендодонтски произход ЛТТ Локален термометричен тест Мка Моноклонално антитяло НРЛИ Националната референтна лаборатория по

имунология НЦЗПБ Национален център по заразни и паразитни

болести РИД Радиална имунодифузия ФХA Фитохемаглутинин ХАЛ Хронична апикална лезия ХАП Хроничен апикален периодонтит ABC Antibody binding capacity, антитяло-

свързващ капацитет CD Cluster of differentiation, маркер на

лимфоцитната диференциация CRP С-реактивен протеин IFN Интерферон IgA Имуноглобулин А IgG Имуноглобулин Г IgM Имуноглобулин М IL Интерлевкин LPS Липополизахариди MFI Mean fluorescence intensity, среден

интензитет на флуоресценция NK Клетки – естествени убийци PPD Probing pocket depth (дълбочина на джоба

при сондиране) PSI Пародонтален скринингов индекс Tc Т-цитотоксични лимфоцити Th Т-хелперни лимфоцити TNF Тумор-некротизиращ фактор Tregs Т-регулаторни клетки

4

ВЪВЕДЕНИЕ Имунната защита в устната кухина се осъществява

чрез функциите на естествената резистентност и придобития имунитет – локален и системен. Локалните механизми за защита се дължат на слюнката и многобройните й защитни фактори (лизозим, повърхностен епител, секреторни IgA). Системният имунитет е представен от защитните елементи на клетъчния и хуморален имунен отговор.

В многобройни научни изследвания детайлно са проучени механизмите на имуновъзпалителните реакции, които са в основата на патогенетичните промени, съпътстващи хроничните огнища от зъбен произход. Освен микробно-индуцираните локални ефекти, често с деструктивен характер, огнищната зъбна инфекция води до системни промени в отдалечени тъкани и органи, което е свързано със системно разпространение на локални медиатори на възпаление. Студиите, изследващи промените в системния имунитет след лечение на огнищната зъбна инфекция, понастоящем са малко. В специализираната литература прави впечатление приоритетното изучаване на локалните и на системните имуновъзпалителни механизми, съпътстващи хроничните пародонтити, като безспорен рисков фактор в етиопатогенезата на редица системни заболявания. Проучванията се фокусират главно върху изследване на маркерите на възпаление – CRP, IL-1 и IL-6 in situ.

За нас представляваше интерес да проучим и други огнища от зъбен произход с не по-малко значение като апикалните хронични периодонтити, интересът към които се увеличи в последните години във връзка със системните ефекти, които могат да инициират. Публикациите, разглеждащи ретинираните/полуретинираните трети молари

5

като огнищно действащи нокси, са твърде оскъдни. Това ни мотивира да потърсим пресечната точка на съществуващите разнопосочни мнения относно значението на огнищната инфекция от зъбен произход. За тази цел използвахме периферната кръв като диагностична среда за оценка на състоянието на системния имунитет на пациенти преди и след санация на огнищата от зъбен произход, както и за анализ на санационния ефект на базата на промените в параметрите на имунния отговор.

6

ЦЕЛ И ЗАДАЧИ Целта на настоящия дисертационен труд е да се

определи ефективността на огнищната санация при пациенти с доказана хронична инфекция от зъбен произход чрез изследване на промените в нивата на някои показатели на клетъчния и хуморален имунен отговор в периферна кръв.

За осъществяване на горепосочената цел си поставихме следните задачи :

1. Да се анализират огнищата от зъбен произход (хронични апикални периодонтити и полуретинирани/ ретинирани трети молари) при пациенти с доказана хронична одонтогенна инфекция. Да се определят честотата и видът на придружаващите огнищната инфекция системни заболявания.

2. Да се извърши екзактна санация на огнищната одонтогенна инфекция при пациенти без хронични системни заболявания с оглед изследване на промените в имунния им статус преди и след лечение.

3. Да се изследват нивата на общите имуноглобулини (хуморален имунитет) преди и след лечение на одонтогенна инфекция при пациенти без системни заболявания.

4. Да се изследва клетъчният имунен отговор – процент, абсолютен брой и ниво на ex vivo активация на основните лимфоцитни популации (Т, В и NK-клетки) преди и след лечение на огнищна одонтогенна инфекция при пациенти без системни заболявания.

5. На базата на метаанализ да се определят подходящите за изследването цитокини с оглед

7

установяване на ефекта от лечението на хроничната инфекция от зъбен произход.

6. Да се изследва ефектът от лечението на хроничната одонтогенна инфекция върху цитокиновия фон (баланс на Th1/Th2 цитокини) след неспецифична стимулация in vitro.

7. Да се изследва Т-регулаторната субпопулация (Тreg) преди и след лечение на огнищна инфекция от зъбен произход и връзката й с останалите показатели на клетъчния имунен отговор.

8. Да се състави лесноприложим в ежедневната практика комплекс от лабораторни имунологични методи за оценка на санационния ефект на огнищната зъбна инфекция.

8

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ КЛИНИЧЕН МАТЕРИАЛ И ДИЗАЙН НА

ПРОУЧВАНЕТО

1. Клиничен материал

Пациенти: На пациентите, преминали през кабинета по образна и орална диагностика на ФДМ – София, за периода 2008–2010 г. (n=358), бе извършена комплексна огнищна диагностика. При 165 от тях (46.1%) бе доказана активна огнищна инфекция от зъбен произход (табл. 1 и фиг. 1).

Табл. 1. Разпределение на пациентите с активни огнища от зъбен произход по възраст и пол

Възраст Пол <20 г. 20–29 г. 30–39 г. 40–49 г. 50–59 г. 60–69 г. Мъже 0 9 24 16 10 12 Жени 1 22 24 28 12 7 Общо 1 31 48 44 22 19

Фиг. 1. Разпределение на пациентите с активни огнища от зъбен произход по възраст и пол

Пациентите с огнищна инфекция от зъбен произход (n=165) разделихме условно на две групи:

9

I група: с придружаващи системни заболявания (n=132), регистрирането на които беше извършено посредством данните от личната документация на пациентите (здравни картони, история на заболяването, епикризи и др.).

II група: без анамнестични данни за придружаващи системни заболявания с оглед изследване на имунния им статус (n=33, 18 жени и 15 мъже, на средна възраст 41,8 г). Имунологичните изследвания на пациентите бяха извършени в НРЛИ и Лаборатория по лигавичен имунитет на НЦЗПБ1.

Контролна група здрави лица: за изработването на референтни граници за цитокиновите нива в периферна кръв, за NK-активационните маркери и за Т-регулаторните субпопулации в периода 2008–2009 г. бяха изследвани еднократно 22 здрави доброволци (13 жени и 9 мъже на средна възраст 43,4 години).  Всички лица, включени в проучването, получиха информация за характера и за целта на изследването и подписаха карта за информирано съгласие според изискванията на Комисията за етика на научните изследвания при МУ, София (КЕНИМУС) и на Етичната комисия към НЦЗПБ.

2. Кръвни проби Показателите на клетъчния имунитет бяха изследвани

в проби от цяла венозна кръв (взета чрез венепункция от кубиталната вена във вакутейнер с антикоагулант хепарин); а серумните имуноглобулини – във вакутейнер с активатор на кръвосъсирването. Пациентите бяха изследвани двукратно: преди и 6 месеца след лечение по схемата, отразена на фиг. 2.

1 Изказвам моите сърдечни благодарности за активното сътрудничество на доц. Мария Николова, дм – завеждащ НРЛИ към НЦЗПБ; на Драганка Станкулова, дм; на д-р Ралица Костадинова, дм и на М. Мухтарова.

10

Фиг. 2. Схема на имунологичните изследвания

3. Реагенти за флоуцитометричен анализ Бяха използвани комбинации от Мка за директна

имунофлуоресценция  срещу следните човешки левкоцитни антигени: CD45, CD3, CD19, CD4, CD8, CD16+56, CD25, CD27; кит за определяне на количествената експресия на CD38 (QuantiBRITE PE) и микросферов кит за определяне на човешки Th1/Th2цитокини (CBA), всички произведени от BD Biosciences.

4. Активатори – беше използван поликлоналният активатор фитохемаглутинин (ФХА).

11

ДИЗАЙН НА ПРОУЧВАНЕТО (фиг. 3)

Фиг. 3. Дизайн на проучването (работна програма)

МЕТОДИ ПО ЗАДАЧА № 1 За диагностициране на огнищата от зъбен произход на

всеки пациент приложихме предварително разработен протокол за определяне на общата и локална реактивност (по Киселова), модифициран за нуждите на изследването:

12

Огнищно и алергологично насочена анамнеза, снета чрез индивидуална карта

1) Клинични методи за определяне на обща и локална реактивност (ЕКТ, ЛТТ, ЕОД).

2) Параклинични методи – образна диагностика (ортопантомография, сегментни рентгенографии), хематология, микробиология.

3) Изготвяне на индивидуален санационен план. 4) Контролни прегледи. МЕТОДИ ПО ЗАДАЧА № 2 1. Клинични методи На пациентите от ІІ група, описани по-горе, беше

изготвен индивидуален санационен план, съгласуван със специалисти по ендодонтия и по орална и лицево-челюстна хирургия, включващ препоръки за:

екзактно ендодонтско лечение на първични и постлечебни периодонтити;

екстракция на полуретинирани и/или ретинирани трети молари;

контролни прегледи на 1, 3, 6 месеца след лечението.

Критерии за подбор на пациентите: без анамнестични данни за придружаващи системни заболявания; без имуномодулираща терапия през 6-те месеца, предхождащи изследването; отсъствие на изразена пародонтална патология. За установяване на пародонталния статус използвахме параклиничен (ортопантомография) и клиничен показател (PSI-periodontal screening index).

2. Параклинични методи • Ортопантомография. • Сегментни интраорални ретроалвеоларни рентгено-

графии (пре- и постоперативни).

13

За оценка на качеството на ендодонтското лечение и на

степента на костна регенерация в периапикалната тъкан или на евентуални резорбтивни изменения в костната структура на периапекса, на всички пациенти назначавахме постоперативни сегментни рентгенографии след окончателното извършване на огнищната санация на ендодонтските лезии.

При някои от пациентите с проведено хирургично лечение чрез сегментни рентгенографии установявахме нивото на костно възстановяване в зоната на отстранения мъдрец.

МЕТОДИ ПО ЗАДАЧА № 3, 4, 5, 6, 7 1. Флоуцитометрични методи за оценка на

клетъчния имунен отговор 1.1. Определяне на абсолютен брой (АБ) на

лимфоцитните популации в цяла кръв посредством многопараметърна флоуцитометрия: директно маркиране с лизиране без промиване (табл. 2).

1.2. Определяне на процент на лимфоцитни популации в цяла кръв посредством многопараметърна флоуцитометрия: директно маркиране с лизиране и промиване (табл. 2).

1.3. Количествено определяне на експресията на CD38 молекули от CD4 и CD8 Т лимфоцити.

1.4. Определяне на стимулираната цитокинова концентрация (Th1/Th2 цитокинов профил) в периферна кръв посредством микросферов метод.

1.5. Отчитане и анализ на резултатите от флоуцито-метричните изследвания с BD FACSDivaTM ver. 6.2.1.

14

Табл. 2. Лимфоцитни субпопулации, дефинирани с използвани панели

от Мка

Комбинация от Мка

Изследван параметър Лимфоцитни субпопулации Мярка

Панел за имунофенотипизация CD3 FITC CD19 PE CD45 PerCP

Т-лимфоцити (CD45+CD3+) В-лимфоцити (CD45+CD19+) Лимфоцити (CD45+)

АБ, % АБ, % АБ, %

CD4 FITC CD8 PE CD3 PerCP

CD4 Т-лимфоцити (CD3+CD4+) CD8 Т-лимфоцити (CD3+CD8+) Т-лимфоцити (CD3+)

АБ, % АБ, % АБ, %

CD3 FITC CD16+56 PE CD45 PerCP CD69 APC

Т-лимфоцити (CD45+CD3+) NK-лимфоцити (CD45+CD3-CD56+) Лимфоцити (CD45+) Активирани Т и NK-лимфоцити (CD69+)

АБ, % АБ, % АБ, % MFI, %

CD4 FITC CD127 PE CD25 APC-Cy7

T-регулаторни лимфоцити (CD4+CD25highCD127low) %

HLA-DR FITC CD38 PE CD4 PerCP CD8 APC

Количествена експресия на CD38 върху CD4 и CD8 Т-лимфоцити ABC

2. Количествено определяне на серумните имуноглобулини (IgG, IgA, IgM) посредством радиална имунодифузия (РИД).

Използва се EASY RID Kit (Liofilchem, Italy) – комбинирани плаки с разноцветен, готов за употреба агаров гел, съдържащ съответните моноспецифични античовешки серуми (кози) за определяне на серумни IgG (зелен), IgA (червен), IgM (син). Концентрациите (g/L) се изчисляват в съответствие с измерения диаметър по стандартни таблици, приложени към кита. На всяка плака се накапва и контролен серум (RCS, Liofilchem, Italy) с известна концентрация на имуноглобулини за вътрелабораторен контрол.

15

3. Статистически методи Wilcoxon matced pairs test – за установяване на

вътрегрупови статистически значими разлики (непараметри-чен).

Mann-Whitney test – за установяване на между-групови статистически значими разлики (непараметричен).

Spearman non-parametric correlation test – за оценяване на корелационните зависимости беше използван коефициентът на Спиърман (Spearman R, r). За значима корелация се приемаше стойност на коефициента R>0.3 при степен на статистическа значимост p<0.05.

Описателна (дескриптивна) статистика. Честотен анализ. Данните са обработени с помощта на програмните

пакети Statistica ver. 6.0, GraphPad Prism ver. 4.02 и SPSS ver. 15.0.

16

РЕЗУЛТАТИ 1

1. Да се анализират огнищата от зъбен произход (хронични апикални периодонтити и полуретинирани/ ретинирани трети молари) при пациенти с доказана хронична одонтогенна инфекция. Да се определят честотата и видът на придружаващите огнищната инфекция системни заболявания.

От общо 358 пациенти при 165 (46%) доказахме активна огнищна инфекция от зъбен произход, при останалите 193 (54%) не установихме данни за огнищна активност в изследваните зъби и прилежащите им тъкани (фиг. 4).

53,9%46,1%

10

20

30

40

50

Има активни огнища Няма активни огнища

Фиг. 4. Честота на активни огнища от зъбен произход при изследваните пациенти

При пациентите с доказана огнищна активност (n=165)

анализът на вида на зъбните огнищата показа, че с най-висок относителен дял са огнищата на базата само на ендодонтски лезии (63%), следвани от пациенти, с

1 Част от резултатите в дисертационния труд са финансирани по Грант – проект № 19 Д/2009 г., финансиран от СМН към МУ – София.

17

активност едновременно от ендодонтски произход и мъдреци (27%), а с най-нисък дял (10%) – пациенти с активност само в областта на ретинирани/полуретинирани мъдреци (фиг. 5).

Фиг. 5. Вид огнища от зъбен произход

Анализ на резултатите от огнищната зъбна санация: От общата група пациенти (n=165) с активни огнища

нужда от ендодонтско лечение се установи при 148 (89%). На 115 пациенти се извърши ендодонтско лечение на 118 зъба предимно от общопрактикуващи лекари по дентална медицина. Останалите 33 системно здрави пациенти бяха лекувани от специалисти по ендодонтия с оглед изследване на техния имунен статус. Зъбите с нужда от ендодонтско лечение условно разделихме на две групи:

• зъби с първични периодонтити на базата на усложнен кариес;

• зъби с вторични периодонтити на базата на неекзактно ендодонтско лечение, с/без рентгенологично установими периапикални лезии (постлечебни периодонтити).

18

При контролните прегледи анализът на данните от постоперативните рентгенографии на ендодонтски лекуваните зъби (n=118) показа, че само при 28.8% от всички случаи ендодонтското лечение е извършено екзактно. При останалите 71.2% лечението не отговаряше на критериите за добра ендодонтска практика (фиг. 6).

По отношение на хирургичната санация при 61 от пациентите (37%) бяха екстрахирани 92 полуретинирани и/или ретинирани мъдреци с данни за активност.

0102030405060708090

Брой зъби 84 34Процент 71,2 28,8

Некачествено ендодонтско лечение

Качествено ендодонтско лечение

Фиг. 6. Разпределение на зъбите според качеството на проведеното ендодонтско лечение

Честота на регистрираните системни заболявания

при пациенти с огнищна инфекция от зъбен произход От пациентите (n=165) с данни за активна огнищна

инфекция от зъбен произход при 80% регистрирахме придружаващи системни заболявания, а 20% бяха системно здрави. В групата със системни заболявания с най-висок относителен дял бяха тези със заболявания на опорно-двигателната система (табл. 3, фиг. 7).

19

Табл. 3. Разпределение на пациентите с активни огнища от зъбен

произход според вида на системното заболяване

Вид системни заболявания Пациенти с активни огнища Процент

На опорно-двигателната система 33 25,0 Кожни 29 22,0 Алергични 12 9,1 Сърдечносъдови 19 14,4 Бъбречни 9 6,8 На нервната система 9 6,8 Очни 8 6,1 Гастроинтестинални 8 6,1 Кръвни 5 3,8 Общо 132 100,0

0

5

10

15

20

25

30

35

Брой пациенти

Опорно-двигателнозаболяванеКожно заболяване

Сърдечно-съдовозаболяванеАлергично заболяване

Бъбречно заболяване

Нервно заболяване

Гастро-интестиналнозаболяванеОчно заболяване

Кръвно заболяване

Фиг. 7. Разпределение на пациентите с активни зъбни огнища според

вида на системното заболяване 2. Да се извърши екзактна санация на огнищната

одонтогенна инфекция при пациенти без хронични системни заболявания с оглед изследване на промените в имунния им статус преди и след лечение.

С оглед изследване на имунния статус на пациентите преди и след лечение изготвихме санационен план,

20

включващ консервативно и хирургично лечение на активните зъбни огнища. Лечението бе извършено от специалисти по ендодонтия и по орална и лицево-челюстна хирургия. В тази връзка изследвахме разпределението на активните огнища от зъбен произход (фиг. 8) и установихме, че при 40% от пациентите бяха налице активни огнища само от ендодонтски произход, при 9% регистрирахме активни огнища само в областта на мъдреците, при 50% – едновременно от двата вида огнища.

От изключително значение бе лечението на всички регистрирани активни огнища с оглед получаване на демонстративни промени в показателите на имунния отговор след санация. По тази причина изследвахме изпълнението на индивидуално зададения огнищен санационен план. Установихме, че при 72% от пациентите бе извършена санация на всички активни огнища, при 26% - бяха санирани част от огнищата (фиг. 9).

Фиг. 8. Разпределение на активните огнища от зъбен

произход при системно здрави пациенти

21

72,70 26,3

0 20 40 60 80 100

1

120

Санирани всички огнища Санирани част от огнищата

Фиг. 9. Разпределение на пациентите според изпълнението на индивидуално зададения огнищен санационен план

От предвидените за ендодонтско лечение 145 зъба бяха излекувани 126 (86.9%) от специалисти по ендодонтия. Качеството на това лечение беше в съответствие с критериите за добра ендодонтска практика (фиг. 10). По отношение на полуретинираните трети молари от 27 зъба с активност 25 (92.6%) бяха екстрахирани съобразно предвидения план за санация на огнищната инфекция (табл. 4). По-нисък е процентът на екстрахираните ретинирани мъдреци, като от предвидените за одонтектомия 13 ретинирани молара бяха екстрахирани 8 (61.5%) (табл. 4).

След извършване на одонтектомиите, в оперативния и следоперативен период не се установиха клинични и рентгенографски данни за смущение във възстановителния процес на мекотъканните и костни рани, които бяха проследявани клинично на 3-тия и на 7-мия ден, и рентгенографски на 6-тия месец.

22

Табл. 4. Разпределение на зъбите според изпълнението на индивидуално

зададения огнищен санационен план

За ендодонтско

лечени

е (бр.

)

За екстракци

я (бр.

)

Излекувани

(бр.

)

Екстрахирани

(бр.

)

Излекувани

(%)

Екстрахирани

(%)

Зъби за ендодонтско лечение 145 126 86.9

Полуретинирани мъдреци за екстракция 27 25 92.6

Ретинирани мъдреци за екстракция 13 8 61.5

Резултати от лечението на зъбите с активни

ендодонтски лезии (пре- и постоперативни рентгено-графии)

На представените няколко рентгенографии след лечение (фиг. 10) ясно се вижда хомогенната, плътна, равномерна сянка от каналопълнежното средство по цялата дължина на кореновия канал, както и отсъствие на шупли и завършващ коренов пълнеж на нивото на рентгенографския апекс. Не се наблюдават фрактурирани инструменти, както и перфорации. По анамнестични данни не се установи постоперативна клинична симптоматика.

След приключване на огнищната зъбна санация извършихме контролни прегледи за проследяване на локалната огнищна активност. При 48% от пациентите не се установиха данни за огнищна активност, докато при 51% бяха налице активни огнища в някои от санираните зъби и в прилежащите костни структури (фиг. 11).

23

Преди лечение След лечение

25 зъб

24 зъб

46 зъб

24 и 26 зъби

Фиг. 10. Пре- и постоперативни рентгенографии

24

18,2%

15,2%6,1%

48,5%

12,1%

Няма Има 1 брой Има 2 броя Има 3 броя Има 4 броя

Фиг. 11. Разпределение на активните огнища от зъбен произход според техния брой при контролното изследване

3. Да се изследват нивата на общите имуноглобулини (хуморален имунитет) преди и след лечение на одонтогенна инфекция при пациенти без системни заболявания.

За регистриране на нивата на общите имуноглобулини използвахме радиална имунодифузия, за да определим концентрациите на серумните IgG, IgM и IgA преди и след лечение на огнищната инфекция от зъбен произход.

Анализът на резултатите от изследването показа, че нивата на серумните имуноглобулини IgG, IgA и IgM при пациентите с огнищна инфекция преди и след санация бяха в референтните граници (табл. 5).

Табл. 5. Сравнително представяне на стойностите на серумните

имуноглобулини преди (1) и след санация (2) на огнищната инфекция

Показател Средна стойност (mg/ml)

Стандартно отклонение Р

IgG – 1 11,5 2,3 0,3 2 10,9 2,1

IgA – 1 2,4 0 0,001 2 1,9 0 IgM – 1 1,3 0 0,03 2 1,6 0

25

Сравняването на стойностите преди и след лечение (Wilcoxon) показа, че серумните нива на IgМ след огнищната санация се повишават (фиг. 12), докато нивата на IgA се понижават, без да се излиза от границите на референтните стойности (фиг. 13). Относно IgG не установихме сигнификантни разлики преди и след санация.

Фиг. 12. Сравнително представяне на стойностите на IgM преди и

след санация на огнищната инфекция3

Фиг. 13. Сравнително представяне на стойностите на IgA преди и

след санация на огнищната инфекция

3 (—) p5 - p95, референтни граници при здрави лица.

26

4. Да се изследва клетъчният имунен отговор –

процент, абсолютен брой и ниво на ex vivo активация на основните лимфоцитни популации (Т, В и NK-клетки) преди и след лечение на одонтогенна инфекция при пациенти без системни заболявания.

4.1. Абсолютен брой и процент на основните лимфоцитни популации

Процентът и абсолютният брой на общите лимфоцити (CD45+), Т-(CD3+), В (CD3+CD19+), NK-(CD3-CD56+) клеткитe, както и Т-хелперната (CD4+) и Т-цитотоксична (CD8+) субпопулация бяха определени флоуцитометрично.

По отношение на средните стойности на абсолютния брой (табл. 6) и на относителния дял (табл. 7) на основните клетъчни популации преди и след лечение на огнищата също не бяха установени значими разлики (WCox, p>0.05 за всички изследвани показатели).

Табл. 6. Средни стойности на абсолютния брой на основните

лимфоцитни популации в периферна кръв при пациенти преди (1) и след лечение (2) на огнищната инфекция от зъбен произход

Лимфоцити Средна стойност

Стандартно отклонение P

CD45 AC – 1 2021 565 0,8 2 2059 492

CD3 AC – 1 1525 464 0,9 2 1540 366

CD4 AC – 1 871 302 0,9 2 880 267

CD8 AC – 1 511 221 0,9 2 515 200

CD19 AC – 1 209 102 0,8 2 216 120

CD56 AC – 1 254 108 0,1 2 297 136

27

Табл. 7. Относителния дял на основните лимфоцитни популации в периферна кръв при пациенти преди (1) и след (2) лечение на огнищната

инфекция от зъбен произход

Лимфоцити Средна стойност

Стандартно отклонение P

CD3% – 1 75,2 5,8 0,9 2 75,3 5,7

CD4% – 1 43,1 8,2 0,8 2 42,9 7,9

CD8% – 1 25,3 7,2 0,7 2 25,2 6,7

CD19% – 1 10,5 4,3 0,6 2 10,2 4,6

CD56% – 1 12,8 4,6 ,1 2 14,4 5,3

Тези резултати ни насочиха към предположението, че

ефектите от лечението на хроничната огнищна инфекция вероятно са свързани с промени на рецепторно, функционално и регулаторно ниво.

4.2. Ниво на еx vivo активирани Т-лимфоцити CD38ABC

За определяне на нивото на ex vivo активацията на лимфоцитите използвахме експресията на CD38 антиген върху Т-хелперни и Т-цитотоксични лимфоцити, метод, чрез който оценихме тяхната функционална активност.

Резултатите от изследването показаха, че броят на CD38 молекулите на повърхността на CD4+ Т-лимфоцитите (CD4+CD38 ABC) при пациентите с огнищна зъбна инфекция беше сигнификантно по-висок спрямо здравите контроли (6776 vs. 2876, MW p<0.05). Локалното лечение на зъбните огнища доведе до значимо понижение в броя на CD38 активационните молекули върху Т-хелперните лимфоцити при санираните пациенти (5534 vs. 6776, WCx p<0.05) (фиг. 14).

28

Фиг. 14. Количествена експресия на CD38 върху CD4+ Т-лимфоцити преди и след лечението на огнищната зъбна инфекция, сравнени със

здрави контроли (WCox, MN *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001)

Броят на експресираните активационни молекули върху CD8+ Т-лимфоцити (CD8+CD38 ABC) преди лечение не се различаваше от средното ниво за здравите контроли (1706 vs. 1532, MW p>0.05). След санацията тази стойност беше сигнификантно повишена спрямо количеството експресирани CD38 активационни молекули преди лечение, но в рамките на нормалните граници за здрави лица (1870 vs. 1532, MW p<0.05) (фиг. 15).

Прави впечатление, че изследваната от нас количествена експресия на CD38 рецептора върху различните Т-клетъчни популации при пациентите преди санация е повишена само върху хелперните (CD4+), но не и върху цитотоксичните лимфоцити (CD8+) в сравнение с контролните стойности.

29

Фиг. 15. Количествена експресия на CD38 върху CD8+ Т-

лимфоцити преди и след лечение на огнищната зъбна инфекция, сравнени със здрави контроли

**p<0.01; ns – липсва статистически значима разлика (p> 0.05)

4.3. Ниво на еx vivo активирани NK-клетки За определяне нивото на ex vivo активация на NK-

лимфоцитите използвахме една от най-ранните промени при клетъчното активиране – експресията на CD69 антиген. Флоуцитометрично проследихме промените в интензитета на експресия (MFI) на CD69 върху NK-клетките при пациенти преди и след санация на огнищната инфекция. При пациентите преди санация експресията на CD69 върху NK-клетките беше значимо по-висока в сравнение със здравите контроли (CD69 MFI 269 vs. 116 p<0.05), което е показател за имунна активация на NK-клетките. Беше установено значително понижение в интензитета на експресия на CD69 на повърхността на NK-клетките при санираните пациенти в сравнение с пациентите преди санация (234 vs 90 p<0.05) (фиг. 16).

30

Фиг. 16. Интензитет на експресия на CD69 върху NK-клетки при

пациенти с огнищна зъбна инфекция преди и след санация, сравнени със здрави контроли (**p<0.01;***p<0.001, p> 0.05)

5. На базата на метаанализ да се определят

подходящите за изследването цитокини с оглед установяване на ефекта от лечението на хроничната инфекция от зъбен произход.

На базата на метаанализ определихме IFN-γ и TNF-α като цитокини с най-голяма информативна стойност за Тh1 профила, а IL-4, IL-5 и IL-10 – съответно за Th2 отговора (табл. 8).

6. Да се изследва ефектът от лечението на хроничната одонтогенна инфекция върху цитокиновия фон (баланс на Th1/Th2 цитокини) след неспецифична стимулация in vitro.

На всички пациенти от упоменатата по-горе ІІ група преди извършване на огнищната санация бяха определени нивата на основните Th1 (IFN-γ, TNF-α, IL-2) и Th2 (IL-10, IL-5 и IL-4) цитокини след 24-часова in vitro активация с ФХА в сравнение със здравите контроли. За повторно из-следване на цитокиновия профил (6 мес. след завършване на ендодонтското лечение и екстракцията на ретинираните/по-луретинираните мъдреци) се явиха 17 от пациентите. Стимулираната концентрация на цитокини в периферната

31

кръв на клинично здрави контроли беше оценена еднократно. Получените резултати са представени в табл. 9.

Табл. 8. По-важни свойства на изследваните цитокини Th2 IL Основни функции и клинично значение

IL-4

• Произхожда от Th-2 лимфоцити и участва в антитялозависимия (Th2) ИО; основен противовъзпалителен цитокин. • Подпомага активацията и пролиферацията на B-клетките. • Стимулира мастоцитите (Ма) и участва в регулацията на IgЕ синтеза. • Мощен инхибитор на моноцитната активация. • инхибитор на инфламаторните интерлевкини. серумен маркер за оценка на оздравителния процес при хроничните пародонтити.

IL-5

• Продуцира се от Th-2 лимфоцитите и от мастоцитите: основен противовъзпалителен цитокин. • Стимулира В-клетъчния растеж и увеличава имуноглобулиновата секреция. • Ключов медиатор в еозинофилната активация. • Експресира се от еозинофилите и участва в механизмите на различни алергични заболявания. • Основният регулатор на еозинофилната акумулация в тъканите.

IL-10

• Основният регулаторен цитокин. • Отделя се от Th2 и Tc2 лимфоцитите, B-лимфоцитите, МФ, МА. • Потиска Th1-медиираното възпаление; функцията на моноцити и макрофаги, подпомага лимфоцитната пролиферация и диференциация. • Потиска освобождаването на IL-8. • Потиска развитието на алергичното възпаление. • Потиска антиген-предизвикания Т-клетъчен отговор, като способства за намаляване на възпалителната реакция. • Серумен маркер за оценка на оздравителния отговор при лечение на пациенти с хроничен пародонтит.

TNF-α

• Образува се от макрофаги и моноцити. • Медиира цитотоксичност, туморна некроза, съдова тромбоза, треска. • Индуцира продукцията на IFN-γ, IL-1, IL-6, IL-8.

IFN-γ

• Произхожда от Th1CD4-лимфоцити, CD8+ T-клетки и NK-клетки. • Стимулира макрофагите и NK-клетките. • Проявява антитуморна и антивирусна активност. • Регулира диференцирането и функцията на моноцитите. • Лимфоцит-стимулиращ фактор. • Ключов регулаторен цитокин за клетъчния имунитет, наречен имунен интерферон.

32

Табл. 9. Концентрация на цитокини (pg/ml) в супернатанта от периферна кръв на пациенти и здрави контроли след 24 ч.стимулация с ФХА

Цито- кин

Пациенти преди терапия

Пациенти след терапия P1

∗ Здрави P2∗∗ P3

∗∗∗

IFNg 24248 (3535 – 70055)

16892 3223 – 53605 ns 19470

6400 – 33444 ns ns

TNFa 7520 (662 – 22208)

7977 (2328 – 16719) ns 6867

(2590 – 15022) ns ns

IL-4 245 (22 – 599)

355 (109 – 605) ns 187

(53 – 407) ns <0.01

IL-5 148 (11 – 400)

145 43 – 326 ns 53

8 – 110 ns <0.001

IL-10 1172 200 – 2900

1577 (752 – 2573) <0.05 783

(373 – 1212) ns <0.01

Посочените стойности са средни (p5-p95)

IFN-γ е основен цитокин, участващ в клетъчно-медиирания имунен отговор, повишеното ниво на който е признак за имунна активация в отговор на антигенен стимул.

Флоуцитометричното изследване на стимулираната секреция на IFN-γ в цяла кръв, след 24-часова in vitro активация с ФХА при пациентите с огнищна инфекция от зъбен произход, не показа статистически значими разлики в стойностите преди и след огнищната санация (Wcx p>0.05) (фиг. 17).

TNF-α също има проинфламаторно действие и ключова позиция в инициирането на възпалителен отговор спрямо антигенен стимул. Не установихме статистически значими разлики в стойностите на TNF-α преди и след огнищната санация (Wcx p>0.05) (фиг. 18).

∗ Сравнение между пациенти преди и след санация (Wcx). ∗∗ Сравнение между здрави контроли и пациенти преди санация (MW). ∗∗∗ Сравнение между здрави контроли и пациенти след санация (MW).

33

Фиг. 17. Средни стойности на стимулираната секреция на IFN-γ след 24 h. in vitro активация с ФХА при пациенти с огнищна инфекция в зъбно-челюстната система преди и след санация, сравнени със

здрави контроли (ns – липсва статистически значима разлика, p>0.05)

Фиг. 18. Средни стойности на стимулираната секреция на TNF-α в pg/ml след 24 h. in vitro активация с ФХА при пациенти с огнищна инфекция преди и след санация, сравнени със здрави контроли

(ns – липсва статистически значима разлика, p>0.05) Интерлевкин IL-4 заедно с IL-5 и IL-10 са основните

противовъзпалителни цитокини, характеризиращи Th2

34

профила на имунния отговор. Стимулираната с ФХА секреция на трите типа интерлевкини в цяла кръв изследвахме успоредно с Th1 цитокини преди и след лечение на хроничната инфекция от зъбен произход. Стойностите на IL-4 при пациентите с огнищна инфекция преди санацията бяха в референтните граници. След лечението установихме статистически значимо повишена стимулирана секреция на IL-4 в сравнение със здравите контроли, както и в сравнение с пациентите преди санация (MW, WCx, p<0.01) (фиг. 19).

Фиг. 19. Средни стойности на стимулираната секреция на IL-4 в

pg/ml, измерени след 24 h. in vitro активация с ФХА при пациенти с огнищна инфекция в ЛЧО преди и след санация, сравнени със здрави контроли (*** MW, p<0.0001; ns – липсва

статистически значима разлика; MW, p>0.05) Анализът на данните показа, че стойностите на IL-5

при пациентите с огнищна инфекция бяха статистически значимо по-високи от тези при здравите контроли (MW, p<0.001). След лечението на огнищната инфекция не регистрирахме значими промени в нивата на IL-5 (фиг. 20).

Средните стойности на стимулираната секреция на IL-10 при пациентите с огнищна инфекция преди санацията бяха в референтните граници. След лечението установихме

35

статистически значимо нарастване на стойностите на IL-10 в сравнение със здравите контроли (MW, P<0.01), а също така и в сравнение с пациентите преди санация (WCx, р<0.01) (фиг. 21).

Фиг. 20. Средни стойности на стимулираната секреция на IL-5 в

pg/ml, след 24 h. in vitro активация с ФХА при пациенти с огнищна инфекция в ЛЧО преди и след санация, сравнени със

здрави контроли (***p<0.0001;**p<0.01; ns – липсва статистически значима разлика; MW, p> 0.05)

Фиг. 21. Средни стойности на стимулираната секреция на IL-10 след 24 h. in vitro активация с ФХА при пациенти с огнищна

инфекция преди и след санация (*** WСx, p<0.0001)

36

Независимо от динамиката на концентрациите на

отделните цитокини, определящо за Th1/Th2 профила е съотношението IFN-γ/IL-4. Повишеното (респективно намалено) съотношение IFN-γ/IL-4 е показател за типа на цитокиновия фон и за насочването на имунния отговор: Тh1 – благоприятстващ клетъчен, или Th2 – благоприятстващ хуморален имунен отговор.

Според нашите резултати средната стойност на съотношението IFN-γ/IL-4 при пациентите с огнищна инфекция преди санация не се отличаваше значимо от средната стойност, определена за здравите контроли. След санация обаче установихме статистически значимо понижаване на това съотношение, както в сравнение със стойностите при нелекувани пациенти (WCx, р<0.01), така и в сравнение със здравите контроли (MW, p<0.001) (фиг. 22).

Фиг. 22. Динамика на съотношението IFN-γ/IL-4 след

24 h. in vitro активация с ФХА при пациенти с огнищна инфекция в ЛЧО преди и след санация в сравнение със здрави контроли (WCx, **p<0.01)

Следователно лечението на огнищната зъбна инфекция е свързано с промяна на цитокиновия профил от Th1 към Th2 тип.

37

7. Да се изследва Т-регулаторната субпопулация (Тreg) преди и след лечение на огнищна инфекция от зъбен произход и връзката й с останалите показатели на клетъчния имунен отговор.

Понастоящем като специфичен маркер на Treg се използва вътреклетъчната експресия на транскрипционния фактор FoxP3. В предварително проучване беше установено, че вътреклетъчната експресия на Foxp3 за над 95% от клетките съвпада с повърхностната ниска експресия на CD127 рецептора, което ни даде основание да използваме CD4+CD25highCD127low фенотипа като достатъчно надежден за дефиниране на Т-регулаторната популация в периферната кръв.

Анализът на данните показа, че процентът на СD4 Т-лимфоцити с регулаторен фенотип CD4+ CD25highCD127low е в референтни граници (фиг. 23).

Фиг. 23. Относителен дял на Т-регулаторните клетки в

периферна кръв при пациенти с огнищна инфекция в зъбно-челюстната система преди санация, сравнени със здрави лица След огнищната санация отчетохме статистически

значимо повишаване на процента на Т-регулаторните клетки (WCx, p<0.05) (фиг. 24).

38

**

Фиг. 24. Относителен дял на Т-регулаторните клетки в периферна

кръв при пациенти с огнищна инфекция в зъбно-челюстната система преди и след санация (** MW, p<0.01)

Този резултат е в съответствие с установеното значимо

повишаване на нивото на стимулирана секреция на IL-10 след санация (т. 6), като един от установените механизми, опосредстващи ефектите на Treg.

Потърсихме връзка на процента на Treg и нивото на стимулирана IL-10 секреция с останалите изследвани показатели на клетъчния имунен отговор след санация. Обратна корелация установихме между концентрацията на стимулирана продукция на IL-10 и интензитета на ранния активационен маркер CD69 върху NK-клетки (R=-0.44, p<0.05). С увеличаването на IL-10 се установи понижаване на ранния активационен маркер СD69 върху NК-клетките (фиг. 25). Това е косвено доказателство за ролята на Treg при обратната регулация на имунното възпаление.

Обратна корелация установихме и между процента на Т-регулаторни клетки в периферната кръв и съотношението IFN-g/IL-4 (R=-0.34, p<0.05) (фиг. 26). Следователно повишаването на циркулиращите Т-регулаторни клетки е свързано с промяна на цитокиновия профил от Th1 към Th2 тип като израз на оздравителния процес.

39

Фиг. 25. Обратна корелация между интензитета на експресия

на активационния маркер CD69 върху NK-клетките и стимулираната секреция на IL-10 (R = -0.44, p<0.05)

2.5 5.0 7.5 10.0

Фиг. 26. Обратна корелация между съотношението IFN-g/IL-4 или Th1/Th2 цитокиновия профил и относителния дял на Т-

регулаторните клетки (R = -0.34, p<0.05)

40

8. Да се състави лесноприложим в ежедневната практика комплекс от лабораторни имунологични методи за оценка на санационния ефект на огнищната зъбна инфекция.

След анализ на резултатите формулирахме комплекс от лабораторни имунологични методи за оценка на санационния ефект на огнищната зъбна инфекция, включващ:

• Флоуцитометрично определяне на неспецифично стимулираната секреция на цитокините IL-4, IL-10 и IFN-γ в периферна кръв.

• Флоуцитометрично определяне на активационния маркер CD38 върху CD4+ T-лимфоцитите (Т-хелпери) в периферна кръв.

• Флоуцитометрично определяне на ранния актива-ционен маркер CD69 върху NK-клетки в периферна кръв.

41

ОБЩО ОБСЪЖДАНЕ

Огнища от зъбен произход при пациенти с доказана хронична одонтогенна инфекция – с придружаващи системни заболявания и системно здрави

Огнищната инфекция от зъбен произход като етиологичен фактор за възникване на редица системни заболявания в България не се подлага на съмнение. Дискутабилни обаче са прецизните патогенетични механизми, изясняващи взаимовръзката саниране на огнищата–ход и изход на системните хронични заболявания при пациенти с потенциални и активни огнища в зъбно-челюстната система.

Социалното значение на одонтогенната огнищна инфекция трябва да се интерпретира освен с нейния локален увреждащ ефект, и със системните проявления, които може да индуцира в отдалечени системи на организма посредством in situ освобождаване на медиатори на възпаление с далечен спектър на действие.

За да изследваме влиянието на огнищата от зъбен произход върху системния имунен отговор, анализирахме техния вид и честота при пациентите с придружаващи системни заболявания. Установихме, че с най-висок относителен дял са огнищата само от ендодонтски произход, следвани от двата вида огнища едновременно – ендодонтски лезии и ретинирани/полуретинирани мъдреци, а с най-нисък дял – само ретинирани/ полуретинирани мъдреци. В настоящото проучване не сме имали за цел да изследваме огнищата от пародонтален произход, но сме длъжни да отбележим, че по литературни данни (Debelian et al., 1994; Glick, 2005; Barnett et al., 2006) те са с най-висока честота от всички одонтогенни огнища.

42

След като регистрирахме вида и честотата на одонтогенните огнища, за всеки пациент бе изготвен индивидуален санационен план, изпълнението на който стриктно контролирахме. Анализът на качеството на огнищната санация показа, че в 71% от ендодонтски лекуваните зъби лечението не беше изпълнено екзактно, а в 29% – отговаряше на критериите за добра ендодонтска практика. Ние считаме, че този резултат се дължи на факта, че по-голямата част от пациентите бяха лекувани от общопрактикуващи стоматолози, тенденция, която се потвърждава и от Вангелов и колектив (2008). За разлика от нас Peters & Wesselink (2002) регистрират висок процент (81%) на успешно ендодонтско лечение, тъй като в масовата практика то се извършва от специалисти по ендодонтия.

Според Travassos et al. (2003) успеваемостта на ендодонтската терапия като цяло е висока (85%–95%) и вариациите в данните вероятно се дължат на липса на споразумение между ендодонтистите за дефиницията за успех или неуспех от ендодонтската терапия.

През 2006 г. Европейската асоциация по ендодонтия публикува Ръководство за успешна ендодонтска практика (Quality guidelines for endodontic treatment). Критериите за оценка на качеството на ендодонтското лечение според тази асоциация са точно дефинирани и трябва да се прилагат от всички дентални лекари. Считаме, че качеството на ендодонтското лечение зависи най-вече от: 1) Подготовката на лекарите по дентална медицина за ежедневната ендодонтска практика е различна, както е различна и мотивацията и нуждата от специализирано и продължително следдипломно обучение; 2) Обстоятелството, че социалният статус на пациентите е различен, както е различно и 3) Оборудването със съвременна ендодонтска техника в различните дентални кабинети.

43

След анализ на вида и на честотата на съпътстващите системни заболявания при пациентите с огнищна инфекция от зъбен произход установихме, че преобладаващата част от пациентите (80%) са със системни заболявания. Тази статистически значима разлика ни дава основание да предположим, че наличната огнищна зъбна инфекция вероятно е отключила появата на системно заболяване или е допринесла за агравиране на вече съществуващо такова (Киселова, 2001; Caplan et al., 2004, 2006).

При пациентите с огнищна инфекция от зъбен произход установихме изяви на различни системни заболявания, като най-висок бе делът на заболяванията на опорно-двигателната система, следвани от кожни, сърдечносъдови, алергични заболявания, заболявания на бъбреците и на нервната система, заболявания на гастроинтестиналния тракт и на очите, като най-нисък бе делът на кръвните заболявания. Вероятно активността на отделните специалисти, които насочват своите пациенти в търсене на стоматологична консултация, определя и честотата на регистрираните заболявания, факт, който се потвърждава и от Джераси (1977). Въпреки съществуващите противоречия между отделни автори относно първото място на някои заболявания (например сърдечносъдовите, като евентуална фонова патология, а и като причина, свързана с огнищната инфекция), анализът на специализираната литература (Brita et al., 2009; Hujoel et al., 2001, Pischinger, 1990), а така също и нашите резултати ни дават основание да потвърдим факта, че огнищната инфекция от зъбен произход при определени условия оказва влияние върху хода и изхода на редица системни заболявания.

* * * На пациентите от II група (за изследване на имунния

статус преди и след лечение) изготвихме санационен план,

44

включващ консервативно и хирургично лечение на активните зъбни огнища от специалисти по ендодонтия и по орална и лицево-челюстна хирургия. Анализът на процентното разпределение на активните зъбни огнища показа, че преобладават тези на базата само на ендодонтски лезии, следвани от активни огнища от ендодонтски произход и атипично разположени трети молари едновременно, и с най-нисък дял – огнища само от областта на третите молари. Получените резултати напълно съвпадат с данните от анализа на относителния дял на активните зъбни огнища при І група пациенти. Данните показват, че след огнищата от пародонтален произход ендодонтските лезии са следващите по честота полета на смущение от зъбен произход.

От изключително значение за нашето проучване беше да се извърши лечение на всички регистрирани активни огнища, тъй като на демонстративен ефект от санацията (регистриран чрез показателите на имунния отговор преди и след лечение) можехме да разчитаме само след екзактно саниране на огнищната зъбна инфекция. С други думи, ефектът на огнищната санация върху параметрите на имунния отговор би бил значим, само след адекватно лечение. Установено е, че интензитетът на пародонталната терапия рефлектира върху степента на промяна на серумните възпалителни медиатори (D’Auto et al., 2005). В тази връзка проследихме изпълнението на индивидуално зададения огнищен санационен план и установихме, че при 72% от пациентите бе извършена санация на всички активни огнища, а част от тях – при 26% от пациентите. Частичната санация се дължи на по-високата цена на ендодонтското лечение, когато е извършена от специалист по ендодонтия. При всички 126 ендодонтски излекувани зъби регистрирахме високо качество на лечение съгласно критериите за добра ендодонтска практика.

45

По отношение на екстрахираните трети молари при контролните прегледи не бяха установени клинични и рентгенографски данни за смущение във възстановителния процес на мекотъканните и костни рани.

Сравнявайки качеството на ендодонтското лечение от общопрактикуващи стоматолози и от специалисти, считаме, че то трябва да се извършва само от специалисти по ендодонтия, както и от дентални лекари с нужната квалификация, особено при медицински компрометирани пациенти, при които необходимостта от екзактно саниране на всички огнища е безспорна. За съжаление ниският социално-икономически статус на голяма част от пациентите не позволява осъществяване на зъболечение от високо квалифицирани специалисти. Този факт възпрепятства осъществяването на превенция на огнищната зъбна инфекция от една страна, а от друга, невъзможността за благоприятно повлияване на съществуващите системни заболявания. В заключение – считаме, че необходимостта от активно търсене и лечение на ендодонтски неекзактно лекувани зъби, дори и при отсъствие на периапикални изменения, като източници на огнищно въздействие е както в теоретичен, така и в клиничен план напълно обоснована.

Що се отнася до хирургичното лечение на активни огнища в областта на асимптоматичните ретинирани/полу-ретинирани мъдреци прибягването до екстракция трябва да е разумно преценено, а безразборната да се избягва. Считаме, че хирургичното лечение (като част от огнищната санация) е необходимо да бъде извършено от специалисти по орална и по лицево-челюстна хирургия, тъй като постоперативната грижа за екстракционната рана е от особено значение с оглед превенция на поява на огнища в зоната на екстрахираните мъдреци (рестостити). Въпреки липсата на съвременни публикации, разглеждащи ретинираните мъдреци като огнищен и агравиращ фактор за системни

46

компликации, не можем напълно да пренебрегнем становището на немската школа (Glazer, Turk, Shu), както и на българската школа (Джераси, Киселова, Семерджиева, Зия), според които екстракцията на ретинираните мъдреци е задължителна, за да бъдат избегнати евентуални системни компликации. Безспорно обаче е значението на полуретинираните трети молари с перикоронарна патология, което се дискутира във връзка с доказани пародонтопатогени и с увеличена експресия на маркери на възпаление в сулкуларната течност (Mombelli et al., 1990; White et al., 2002; Blakey et al., 2002; Moss et al., 2006; Moloney et al., 2008). Липсата на единно становище относно необходимостта от екстракция на асимптоматични ретинирани трети молари във връзка със санацията на огнищната инфекция ни даде основание да изготвим ясно дефинирани критерии по отношение на подхода към асимптоматичните ретинирани и полуретинирани мъдреци.

Критерии за екстракция на полуретинирани мъдреци при пациенти с придружаващи системни заболявания:

• клинични данни за перикоронарит (мъдрецът е пробил гингивата с дадена своя част, без да е последвал цялостен пробив на короната поради неправилната му позиция или недостатъчно анатомично пространство). В тези случаи обективно се наблюдава оточна или фиброзно променена гингива с/без палпаторна болезненост и наличие на ексудация (Richardson et al., 1984, 1989);

• положителен електрокожен тест (Киселова, 2001). Критерии за екстракция на ретинирани мъдреци

при пациенти с придружаващи системни заболявания: • рентгенографски данни за резорбция на мъдреца

или на предлежащия зъб; • невъзможност за спонтанен пробив (Capuzzi et al.,

1994; Andreasen et al., 1998);

47

• наличие на кистозна, на пародонтална или на друг вид костна лезия, свързана със зъба (Kocaelli et al., 2009; Curran et al., 2002);

• положителен електрокожен тест (Киселова, 2001). Считаме, че профилактичната екстракция на

асимптоматични ретинирани трети молари, особено с висока степен на хирургична трудност, е неоправдана и безотговорна при системно здрави пациенти.

Съвременната диагностика на огнищната инфекция в ЛЧО изисква ограничаване до пълно елиминиране на субективния фактор. Що се отнася до ЕКТ на Гелен, който продължава да бъде един от основните диагностични методи в огнищната диагностика, при неговото използуване трябва да се отчита субективният му характер. Окончателна диагноза не бива да бъде поставяна, базирайки се изолирано само на данните от този тест. В Катедрата по образна и орална диагностика на ФДМ – София, се въвеждат нови за България обективни диагностични методи – контактна и безконтактна термография, които в комбинация с останалите клинични и параклинични методи способстват за игнориране на субективния фактор в огнищната диагностика в ЛЧО.

Промени в някои параметри на клетъчния и хуморален имунен отговор при системно здрави пациенти с огнища от зъбен произход

Данните от изследването на общите имуноглобулини при пациентите с огнищна инфекция, както и анализът на малкото публикации в специализираната литература (Marton & Kiss, 1992; Ботушанов и кол., 1989) показаха, че одонтогенната хронична инфекция не повлиява значително параметрите на хуморалния имунен отговор и той остава в референтни граници. Също така лечението на огнищната инфекция не предизвиква значими количествени промени в серумния антителен отговор. Вероятно хроничните, но слаби

48

локални антигенни стимули, съпътстващи огнищната инфекция, не водят до значими промени в нивата на общите имуноглобулини. Същевременно обаче отчетохме значимо понижение на стойностите на серумния IgA след лечението при голяма част от пациентите, което ни дава основание да предположим, че изследването на специфични, особено секреторните имуноглобулини в серума, би имало диагностична стойност с оглед проследяване на санационния ефект на огнищната зъбна инфекция. За оценка на ефекта от пародонталната терапия, както и за идентифициране на фактора вирулентност на пародонтопатогените, е изследването на специфични IgG срещу Porphyromonas gingivalis при пациенти с хронична пародонтална инфекция, което е широко използвано в практиката (Baker et al., 1999; Yamazaki & Honda, 2007).

Поради специфичната организация и консервативност на имунната система възникването на статистически значими отклонения в основните показатели на хуморалния и клетъчен имунитет в периферната кръв, за щастие настъпват бавно и сравнително рядко. Отклонения обикновено се наблюдават във връзка с високо антигенно натоварване, с генерализирани и продължителни отговори и с имунен дефицит от различен произход. Антигенното дразнене, съпътстващо огнищната инфекция от зъбен произход, макар и продължително, е слабо и локализирано, с което може да се обясни липсата на сигнификантни промени в стойностите на основните лимфоцитни популации, които не се различаваха статистически от тези при здрави лица. Също така в хода на санацията (екзактно ендодонтско лечение на зъби с ХАП, както и екстракция на полуретинирани/ретинирани трети молари) тези стойности не претърпяха значими промени. За разлика от нас Ботушанов и колектив намират статистически значимо понижение на стойности на IgG след лечение в рамките на

49

референтните стойности, което според тях е в корелация с намаляване на инфекцията след лечение на хроничните дифузни периодонтити.

Резултатите от проучването ни дадоха основание да предположим, че ефектите от санацията вероятно са свързани с по-дискретни промени на рецепторно, на функционално и на регулаторно ниво.

Определяйки количествената експресия на CD38 антиген върху Т-хелперни и Т-цитотоксични лимфоцити, оценихме ex vivo степента на тяхната активация и функционална активност (Almeida et al., 2002; Станкулова и кол., 2006). Антигенната стимулация води до промени в повърхностната експресия на определени лимфоцитни рецептори – антигени на активация, по които можем да съдим за степента на активация на лимфоцитната функция. В контекста на хроничната бактериална инфекция от зъбен произход CD38 молекулата се експресира като част от имунната реакция към бактериални антигени. Прави впечатление, че количествената експресия на CD38 рецептора преди санация бе повишена върху хелперните (CD4+), но не и върху цитотоксичните (CD8+) Т-лимфоцити в сравнение с контролните стойности. Този факт насочва към бактериалната етиология на хроничното дразнене, свързано с огнищната зъбна инфекция. Т-хелперните лимфоцити не само играят централна роля в регулацията на хуморалния и клетъчен имунен отговор (Baker et al., 1999; Wassenaar et al., 1995), но са и основни ефектори на клетъчния имунен отговор, а както е известно, те се активират от екстрацелуларни антигени, попаднали в ендозомно-лизозомния компартмънт на антиген-представящите клетки в резултат на фагоцитоза, т.е. от бактериален произход. Същевременно регистрираната тенденция към понижаване на броя на CD38 молекулите върху хелперните лимфоцити след проведеното лечение

50

подсказва, че санацията на огнищната зъбна инфекция води до затихване на хроничната зъбна инфекция в резултат на намаления бактериален товар, като отговор на адекватна огнищна санация.

В заключение, установената от нас тенденция към повишена количествена експресия на активационния маркер CD38 върху Т-хелперните лимфоцити в периферна кръв преди лечение може да бъде обяснена с готовността на организма да реагира на повишеното антигенно дразнене, съпътстващо огнищната зъбна инфекция. От друга страна, понижението на количествената експресия на същия маркер след адекватната санация показва тенденция към затихване на имунния отговор в резултат на намаления бактериален товар.

Интересен резултат бе и сигнификантно повишената количествена експресия на активационния маркер CD38 върху CD8+ лимфоцитите след лечение, но в рамките на нормалните граници за здрави лица.

В последните години се засили интересът към CD8 T- лимфоцитите с регулаторна функция, изолирани in vitro у миши модели и у хора. Все още ролята на CD8 Treg не е напълно изяснена, но се предполага, че те нямат цитотоксична функция; продуцират основно цитокини от втори тип и експресират селективно Foxp3. Регулаторната им функция и механизъм на действие са свързани с инхибиране на експанзията на ефекторните CD4 T (Th1) хелпери (Xystrakis et al., 2004).

Съществуват доказателства за участието на CD8 Т-регулаторни клетки в генерирането и в поддържането на оралната толерантност (Zhou et al., 2011).

Изследването на количествената експресия на CD38 върху CD8+ лимфоцитите е важен метод в мониторирането на HIV-1 и EBV инфекцията. Счита се, че измерването на нивата на CD38 върху CD8+ служи като надежден

51

прогностичен маркер за прогресията на заболяването, както и за мониториране на ефекта от терапията (Almeida et al., 2001; Петрова и кол., 2007).

Резултатите от нашето проучване, демонстриращи повишена количествена експресия на активационния маркер CD38 върху CD8+ лимфоцитите след лечение, вероятно отразяват механизмите на модулиране на имунния отговор при персистиране на зъбната хронична инфекция в контекста на регулаторната функция на CD8 Т-лимфоцитите.

За оценка на активационния статус на NK-лимфоцитите изследвахме един от най-ранните маркери на клетъчната активация – лектиновия рецептор от С-тип CD69. Този рецептор отключва процеса на активация и пролиферация в много от хемопоетичните клетки и е показател за функционалната им активност (Kamoda, 2004; Аvgustin et al., 2005). Въпреки че относителният дял на NK-клетките, експресиращи CD69 преди терапия, бе съизмерим с този при здрави контроли, интензитетът на експресия на CD69 (MFI) беше значимо повишен. Следователно продължителното и хронично дразнене, произхождащо от огнищата от зъбен произход, води до експресия на по-голям брой CD69 рецептори от NK-клетките в периферна кръв, като белег на повишена реактивоспособност в условията на антигенна стимулация. От друга страна, установеното значимо понижение в интензитета на експресия на CD69 на повърхността на NK-клетките при санираните пациенти в сравнение с пациентите преди санация, е свързано с понижението на имунната активация, което считаме, че е чувствителен маркер за намаляване на бактериалното дразнене след извършената огнищна санация.

Установено е, че увеличеният брой на системно активирани CD69+NK-клетки корелира с количеството на общите орални стрептококи и е полезен индикатор за

52

установяване на орална инфекция при възрастни пациенти (Kamoda et al., 2008).

Обстойният преглед на достъпните научни публикации, както и на специализираната литература, показа, че цитокините са сравнително нови маркери за диагностика и мониторинг на лечението. Тяхното значение е във връзка с участието им в патогенезата на редица заболявания, включително и в устната кухина (Abdolsamadi, H. et al., 2008). Безспорна е ролята на цитокините за прогресията и за изхода на заболяванията на пародонта, както и на туморни процеси в ЛЧО.

С оглед изследване на Th1/Th2 цитокиновия профил на пациенти с огнищна зъбна инфекция, на базата на метаанализ, подбрахме най-информативните за целта на проучването цитокини. Значението на Th1/Th2 профила е свързано най-вече с възможността за модулиране на имунния отговор, респективно – на относителния дял на секретираните в отговор на антигенния стимул Th1 или Th2 цитокини, което се отразява на баланса между протекция и имунопатология при различни заболявания, включително при огнищната зъбна инфекция. В заключение, „балансът” между ефектите на про- и противоинфламаторните цитокини е този, който определя изхода на заболяването (Dinarello, 2000).

Данните от изследването на средните изходни стойности за стимулираната концентрация на Th1 цитокините – IFN-γ и TNF-α, както и на Th2 – IL-4 и IL-10 цитокините преди лечение, не се отличаваха значимо от стойностите при здравите контроли. Трябва да отбележим обаче, че стойностите на провъзпалителните интерлевкини варираха в доста широки граници, като при отделни пациенти нивата им бяха значително повишени, обикновено еднопосочно за изследваните цитокини от Th1 тип. Огнищната санация не доведе до статистически значими

53

разлики в стойностите на IFN-γ и TNF-α. Влиянието на хроничната зъбна инфекция върху системните нива TNF-α и IFN-γ все още не е напълно изяснено, а данните в научните публикации – противоречиви.

Нивата на IFN-γ и TNF-α, изследвани in situ в гингивална течност, гингивална тъкан или периапикални лезии, според Górska et al. (2003); Lappin et al. (2001); Pršo et al. (2006), Yun et al. (2007) са значително повишени, докато Nakajima et al. (2009) регистрират сигнификантно по-ниски серумни нива на TNF-α при пациенти с пародонтални заболявания в сравнение със здравите контроли. Съществените различия между отделните автори, включително и нашите резултати, могат да бъдат обяснени с методологични различия, в това число типа на изследваната клетъчна култура, времето и метода на клетъчна стимулация, етническите характеристики на изследваната популация, както и изследваните патологични единици: хронични пародонтити, апикални периодонтити, или съвкупната им изява в контекста на огнищната зъбна инфекция, какъвто е дизайнът на нашето проучване.

Особен интерес за нас представляваха промените в стимулираната секреция на IL-4 и IL-10, тъй като те са основните цитокини с инхибиращ ефект върху провъзпалителните медиатори на имунния отговор. При нелекуваните пациенти с хронична зъбна инфекция стимулираната секреция на двата цитокина в периферна кръв беше в референтните граници, установени за съответстващи по пол и възраст здрави контроли. Лечението доведе до увеличаване на средното ниво на стимулираната продукция на основните цитокини от втори тип – IL-4 и IL-10. Следователно огнищната санация води до потискане на стимулираната секреция на Th1 цитокините и до увеличаване на стимулираната секреция на цитокините от втори (Th2) тип. По отношение на хроничната зъбна

54

инфекция (в частност огнищата от ендодонтски произход и хроничните пародонтити) все още няма категорична позиция относно Тh1/Th2 поляризацията. Едни автори подкрепят схващането, че предоминирането на Тh1 отговора е свързано с прогресия на заболяването (Stashenko et al., 2007; Sasaki et al., 2008), a Th2 отговорът e протективен (Ebersole et al., 2000; Stashenko et al., 2007). Независимо от динамиката на концентрациите на отделните цитокини, определящи за Th1/Th2 профила са съотношенията IFN-γ/IL-4 и IFN-γ/IL-10 (Станкулова и кол., 2006). След санация установихме статистически значимо понижаване на това съотношение, както в сравнение със стойностите при нелекувани пациенти, така и в сравнение със здравите контроли, което е още едно потвърждение, че лечението на огнищната зъбна инфекция е свързано с промяна на цитокиновия профил от Th1 към Th2 тип. Този факт е с потвърдителен характер спрямо резултатите на Stashenko & Goncalves, 2007; Ebersole & Taubman, 2000; Stashenko & Yu, 1989.

Въпреки съществените различия между отделните автори ние считаме, че санацията на огнищната инфекция от зъбен произход води до потискане на стимулираната секреция на Th1 цитокини (предимно деструктивен клетъчен имунен отговор) и преобладаване на Th2 цитокини (предимно протективен имунен отговор), което от своя страна, е свързано със затихване на имунната активация и с нормализиране на показателите на клетъчния имунен отговор.

Още един важен резултат е значително повишеното ниво на секреция на IL-10 при пациентите след санация. IL-10 заедно с TGF-β се причислява към цитокинитe с общорегулиращ и супресиращ ефект, продуцирани от регулаторни Т-клетъчни субпопулации и с важна роля в централната и периферна имунна толерантност. Същественото покачване на IL-10 при пациентите със

55

санирана огнищна инфекция от зъбен произход вероятно е свързано с ефектите на Т-регулаторната субпопулация CD4+CD25highFoxP3+, която играе важна роля в контрола на локалния и системен имуновъзпалителен отговор (Lewkowicz еt al, 2005). Следователно повишеното ниво на IL-10 в резултат на саниране на огнищата на възпаление е вероятен механизъм на оралната толерантност и косвено доказва противовъзпалителното действие на огнищната санация.

Tregs клетките са ключов регулатор на имунния отговор и решаващ фактор в контролирането на имунологичната толерантност. Тregs се различават от конвенционалните CD4+ T клетки по това, че експресират CD4+ рецептора в комбинация с високи нива на CD25+ молекулата и интрацелуларен Foxp3 протеин. В предварително проучване, което съвпада с литературните данни (Станкулова и кол. 2006) беше установено, че вътреклетъчната експресия на Foxp3 за над 95% от клетките съвпада с ниска повърхностна експресия на рецептора CD127, което ни даде основание да използваме CD4+CD25highCD127low фенотипа като достатъчно надежден за дефиниране на Т-регулаторната популация в периферната кръв.

Анализът на данните показа, че процентът на CD4+CD25highCD127low регулаторни Т-лимфоцити в периферната кръв на пациентите преди санация е в референтни граници. След огнищната санация отчетохме статистически значимо повишаване на процента на Т-регулаторните клетки.

Нарастване на регулаторната популация е демонстрирано в условията на генерализирана хронична инфекция с различна етиология: HIV, HBV, HCV, TB (Belkaid, Y., 2005).

56

При това концентрацията на Treg в местата на локално дразнене е значително по-висока, отколкото в периферната кръв (чревна лигавица и лимфни възли при HIV). Като се има предвид, че периферната кръв е доста опосредствано отражение на локалните имунни процеси, има две обяснения на наблюдаваната от нас динамика на Treg в периферната кръв на изследваните пациенти. Първо: огнищното антигенно дразнене от зъбен произход води до локално натрупване на Treg, а отстраняването на локалните стимули вероятно „освобождава” акумулираните във възпалителния инфилтрат лимфоцитни субпопулации. Второ: значимо повишеният процент Тregs в периферната кръв на пациентите след санация вероятно отразява механизмите на модулиране на имунния отговор при персистиране на зъбната хронична инфекция и след нейното саниране. Литературните данни очертават двузначна роля на Т-регулаторните клетки при хронични вирусни и бактериални инфекции: от една страна, ограничаване на пораженията, предизвикани от генерализираното неспецифично възпаление, а от друга – потискане на специфичните имунни отговори (Fehervari et al., 2004). От друга страна, изключително важна е ролята на Treg, демонстрирана при здрави индивиди, за поддържане на баланса между паметови и ефекторни Т-лимфоцити и потенциране на протективен имунен отговор в условията на силно антигенно дразнене (Nikolova et al., 2009).

Санирането на огнищната инфекция е предпоставка за затихване на хроничното огнищно възпаление с благоприятен като цяло ефект за пациента. За повишен процент на Т-регулаторните лимфоцити в корелация със затихване на хроничното възпаление съобщават и други автори (Yamazaki et al., 2005; Colic et al., 2009).

В подкрепа на тази теза е установената от нас обратна корелация между относителния дял на Т-регулаторните

57

клетки и съотношението Th1/Th2 (затихване на предимно ефекторния отговор с деструктивен характер), както и между стимулираната продукция на IL-10, като един от медиаторите на ефектите на Treg, и интензитета на ранния активационен маркер CD69 върху NK-клетки. Трябва да отбележим, че съгласно съвременните проучвания IL-10 е основният регулаторен цитокин, който не само ограничава проинфламаторните отговори срещу собствени кръстосано-реагиращи антигени, но и осигурява формирането и поддържането на ефективна имунна памет (Sasaki et al., 2008). Считаме, че увеличеният процент на Treg на фона на екзактно проведено лечение и отстранен антигенен товар, е механизъм за регулиране на имунната реактивност, за възстановяване на баланса между паметови и ефекторни Т-лимфоцити и за осигуряване на протективен имунен отговор при следващи антигенни дразнения.

58

ИЗВОДИ 1. С най-висок относителен дял от активните огнища

бяха тези на базата само на ендодонтски лезии, следвани от ендодонтски лезии и ретинирани и/или полуретинирани мъдреци едновременно, а с най-нисък дял – само ретинирани и/или полуретинирани мъдреци.

2. Качеството на ендодонтското лечение, извършено от общопрактикуващите лекари по дентална медицина (като част от огнищната санация), не отговаря на критериите за добра ендодонтска практика.

3. Анализът на придружаващите системни заболявания при пациенти с активни зъбни огнища показа най-висок относителен дял на заболяванията на опорно-двигателната система, следвани от кожни, сърдечносъдови, алергични, бъбречни, заболявания на нервната система, гастроинтестинални, очни и заболявания на кръвта. Този факт налага активна колаборация между съответните специалисти и лекарите по дентална медицина.

4. Абсолютният брой и процентните съотношения на основните лимфоцитни субпопулации (Т, В и NK-клетки), както и нивата на общите имуноглобулини (IgG, IgA, IgM) в периферна кръв при пациентите с огнищна зъбна инфекция, не се отличават от референтните стойности за здрави лица.

5. Хроничната одонтогенна инфекция и свързаните с нея огнища в зъбно-челюстната система инициират генерализирана имунна активация, изразяваща се в:

5.1. Повишен интензитет на експресия на активацион-ния маркер CD69 на повърхността на NK-клетките в периферна кръв.

5.2. Повишен брой CD38 молекули върху Т-хелперните клетки в периферна кръв.

59

6. Хроничната одонтогенна инфекция е свързана с преобладаващ Th1 профил на имунния отговор (повишено съотношение IFN-γ/IL-4).

7. Санирането на огнищната инфекция от зъбен произход не води до промяна в нивата на общите имуноглобулини, на абсолютния брой и на съотношенията на основните циркулиращи лимфоцитни популации.

8. Санирането на хроничната инфекция от зъбен произход води до:

8.1. Понижаване на нивото на имунна активация. 8.2. Повишаване на нивата на серумните противовъз-

палителни IL-4 и IL-10. Стимулирането на IL-10 в резултат на саниране на огнищата от зъбен произход е вероятен механизъм на оралната толерантност и косвено доказва антиинфламаторното действие на санацията.

8.3. Промяна на цитокиновия профил от хиперреак-тивния Th1 към протективния Th2 тип, като белег за овладяване на прогресията на хроничната зъбна инфекция, в резултат на проведеното лечение.

8.4. Повишаване на нивото на инхибиращи регулаторни CD4 Т-клетки (CD25highCD127low), което е в обратна корелация със съотношението Th1/Th2. Повишеният процент на Тreg има модулиращ ефект върху възпалителния отговор, което е в корелация със затихване на огнищното зъбно възпаление.

9. Навременното саниране на огнищната инфекция от зъбен произход и свързаното с това затихване на системната имунна активация е добра превантивна мярка срещу развитието на хронични системни нарушения.

10. Локалната реактивност (регистрирана чрез ЕКТ) в областта на санираните активни огнища от зъбен произход при клинично здрави пациенти показа повишена реактивност при контролните прегледи в 51,5% от тях.

60

Общата реактивност на организма при същите пациенти, измерена с показателите на клетъчния и хуморален имунитет, не показа отклонения от нормата след санацията.

11. Статистически значимите промени в нивата на някои цитокини и активационни лимфоцитни маркери в периферната кръв на пациентите преди и след санация могат да се използват в клиничен аспект за мониториране на ефекта от лечение на огнищата от зъбен произход:

• Флоуцитометрично oпределяне на неспецифично стимулираната секреция на цитокините IL-4, IL-10 и IFN-γ в периферна кръв.

• Флоуцитометрично определяне на активационния маркер CD38 върху CD4+ T-лимфоцитите (Т-хелпери) в периферна кръв.

• Флоуцитометрично oпределяне на ранния актива-ционен маркер CD69 върху NK-клетки в периферна кръв.

61

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящото проучване бе извършен задълбочен

анализ на някои параметри на клетъчния и хуморален системен отговор в цяла кръв преди и след лечение на пациенти с огнищна инфекция от зъбен произход. Санирането на огнищната инфекция от зъбен произход не води до промяна в нивата на общите имуноглобулини, на абсолютния брой и на съотношенията на основните циркулиращи лимфоцитни популации. Ефектите от лечението на хроничната огнищна инфекция са свързани с промени на рецепторно, на функционално и на регулаторно ниво – цитокини, активационни лимфоцитни маркери. Навременното саниране на хроничната инфекция от зъбен произход и свързаното с това затихване на имунната активация е добра превантивна мярка срещу развитието на хронични системни нарушения.

Статистически значимите промени в нивата на някои цитокини и активационни лимфоцитни маркери в периферната кръв на пациентите преди и след санация могат да се използват в клиничен аспект за мониториране на ефекта от лечение на огнищата от зъбен произход.

Считаме, че резултатите от нашето проучване са дока-зателство в подкрепа на необходимостта от профилактика и лечение на хроничните възпалителни и дегенеративни заболявания на зъбите и челюстните кости както при системно здрави, така и при медицински компрометирани пациенти с оглед недопускане на системни усложнения.

Известен е приносът на българската школа в доказване на връзката на огнищата от зъбен произход с общата и локална реактивност на организма. Липсваха доказателства за санационния ефект на консервативното и хирургично лечение. Установените от нас промени в системния имунен отговор са крачка напред в изясняване на патогенетичните механизми на огнищната зъбна инфекция.

62

ПРИНОСИ ВЪВ ВРЪЗКА С ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД

Приноси с потвърдителен характер 1. Извършен е задълбочен анализ на промените в

основните параметри на клетъчния и хуморален системен отговор в цяла кръв преди и след лечение на пациенти с огнищна инфекция от зъбен произход.

2. С помощта на обективни имунологични методи на изследване е потвърден социално значимият извод, а именно: навременното саниране на огнищната инфекция от зъбен произход и свързаното с това затихване на системната имунна активация е добра превантивна мярка срещу развитието или агравирането на вече съществуващи системни нарушения.

Оригинални приноси 1. На базата на метаанализ са подбрани цитокините с

най-информативна стойност с оглед определяне на Th1/Th2 отговора.

2. Съставен е лесноприложим в ежедневната практика комплекс от лабораторни имунологични методи за оценка на санационния ефект на огнищната зъбна инфекция:

• Флоуцитометрично определяне на цитокините IL-4, IL-10 и IFN-γ в периферна кръв.

• Флоуцитометрично определяне на активационния маркер CD38 върху CD4+ T-лимфоцитите (Т-хелпери) в периферна кръв.

• Флоуцитометрично определяне на ранния актива-ционен маркер CD69 върху NK-клетки в периферна кръв.

63

СПИСЪК НА НАУЧНИТЕ ПУБЛИКАЦИИ И СЪОБЩЕНИЯ ВЪВ ВРЪЗКА С ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД НАУЧНИ ПУБЛИКАЦИИ, УЧАСТИЕ В УЧЕБНИЦИ

Научни публикации 1. Цекова, М., А. Киселова. Системен имунен отговор

преди и след санация на пациенти с доказани полета на смущение от зъбен произход. С., Проблеми на денталната медицина, том XXXV/2009 – част ІІ, с. 42–51.

2. Цекова, М., М. Николова, Д. Станкулова, А. Киселова. Ефект от лечението на апикалните периодонтити върху нивата на серумните IL-4, IL-10 и Th-1/Th-2 цитокиновия профил. С., Проблеми на денталната медицина, том ХХХVI/2010 – част І, с. 43–56.

3. Цекова М, К. Дечев, А. Киселова Връзка между Алопеция ареата (Alopecia areata) и полетата на смущение от зъбен произход – описание на клиничен случай. Проблеми на денталната медицина, том ХХХVI/2010 – част І, с. 63–67.

4. Цекова, М., М. Николова, Д. Станкулова, А. Киселова. Регулаторни Т-клетки (CD25highCD127low) в серума на пациенти с хронична орална инфекция. С., Проблеми на денталната медицина, том ХХХVI/2010 – част ІІ, с. 68–74.

Участие в учебници 1. Клинична имунология, клинична алергология,

дентална клинична алергология. Учебник (под ред. на акад. проф. д-р Б. Петрунов, дмн; проф. д-р А. Киселова-Янева, дмн; доц. д-р В. Димитров, дм). Глава II. Изследване на кръв (с. 230–232): Приложения. С., Мед. изд. „АРСО”, 2009.

64

2. Орална медицина. Учебник (под ред. на проф. д-р З. Кръстев, дмн, проф. д-р А. Киселова-Янева, дмн, доц. д-р Р. Коларов, дм). Заболявания на устната кухина (с. 148–179). С., Изд. „Ив. Сапунджиев”, 2009.

УЧАСТИЕ В НАУЧНИ ФОРУМИ

1. Cekova, M., D. Stankulova, M. Nikolova, A. Kisselova. Treatment of patients with focal oral infection correlates with high peripheral blood levels of IL–10, IL–4, IL–2 and CD25highCD127low T-regulatory cells. 1st SEEC. Chemotherapy and Infection. 20 Annual Assembly of IMAB, Varna, Bulgaria, 6–9 May 2010, p. 28.

2. Cekova, M., A. Kisselova. The role of inflammatory mediators in the pathogenesis of dental inflammatory processes – a review of the literature. 1st SEEC. Chemotherapy and Infection. 20 Annual Assembly of IMAB, Varna, Bulgaria, 6–9 May 2010, р. 28.

65