实验二 DNA 重组技术
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实验二 实验二
DNADNA 重组技术重组技术
实验目的
通过本实验学会重组 DNA连接以及鉴定重组子的方法。
基因重组基因重组::不同的不同的 DNADNA 分子间发生共分子间发生共价连接形成重组价连接形成重组 DNA DNA 分子。分子。
重组重组 DNADNA
质粒质粒 DNADNA 基因片段基因片段
实验原理
外源 DNA 片段和线状质粒载体的连接,也就是在双链 DNA5’ 磷酸和相邻的3’ 羟基之间形成的新的共价键,如质粒载体的两条链都带有 5’ 磷酸,可生成 4 个新的磷酸二酯键,但如果质粒 DNA 已经去磷酸化,则只能行成2 个新的磷酸二脂键,在这种情况下产生的杂交体分子带有 2 个单链切口,当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复。
实验原理相邻的 5’ 磷酸和 3’ 羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的 DNA连接酶催化,这两种酶就是大肠杆菌 DNA 连接酶和 T4 噬菌体 DNA 连接酶。
重组DNA技术基本原理:切、接、转、筛
多种酶切口多种酶切口
多克隆位点多克隆位点
限制性内切酶限制性内切酶
单一酶切口单一酶切口
限制性内切限制性内切酶酶切酶酶切切
酶切酶切
磷酸二酯键的形成磷酸二酯键的形成
DNADNA 连接酶连接酶
DNADNA 连接酶连接酶
DNADNA 连接酶连接酶
目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接接接
TT44-DNA-DNA 连接酶连接酶: : TT44-- 噬菌体噬菌体
连接温度:连接温度:不高于粘性末端熔点温度(不高于粘性末端熔点温度( TTmm ) ) ≤ ≤15℃15℃ : : 15℃/6h15℃/6h ; ; 12℃/8h12℃/8h ; ; 8℃/128℃/12hh ;;
连接方式:连接方式:
相同粘性末端的连接相同粘性末端的连接 平头末端的连接平头末端的连接 不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接
粘端连接粘端连接
CCGG CCGGCCGG CCGG
GGCC GGCCGGCC GGCC
CGG CCGG C
C GGCC GGC
CGG CCGG C
C GGCC GGC
CCGGCCGG GGCCGGCC
HapⅡHapⅡ T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶
平端连接平端连接
AGCTAGCT TCGATCGA
AluⅠAluⅠ DNADNA 连接酶连接酶
AGCT AGCTAGCT AGCT
TCGA TCGATCGA TCGA
重组体的转化重组体的转化
受体细胞受体细胞
转
JM109JM109 感受态感受态
含氨苄平板含氨苄平板
AmAm
重组重组质粒质粒 感受态感受态
原核细胞的转化(细菌转化)原核细胞的转化(细菌转化)
1)1) 受体细胞的选择受体细胞的选择
限制缺陷型限制缺陷型 : : 避免修饰和降解避免修饰和降解
重组缺陷型:重组缺陷型:避免重组整合避免重组整合
转化亲和型:转化亲和型:较高的可转化性较高的可转化性
遗传互补型:遗传互补型:利于筛选利于筛选
感染缺陷型:感染缺陷型:防止感染防止感染
22 )转化方法)转化方法CaClCaCl22 诱导转化诱导转化电穿孔电穿孔PEGPEG 介导转化介导转化人工体外包装人工体外包装 特殊处理特殊处理
受体细胞受体细胞
细胞膜特性细胞膜特性改变改变
CaClCaCl22 处理处理
受体细菌受体细菌
50-100mmol/L
CaCl2
感受态感受态细菌细菌
重组体转重组体转入细菌入细菌
含氨苄平板含氨苄平板
连接连接连接连接
目的基因目的基因
基因载体基因载体
连接酶连接酶
转化转化
重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定筛
宿主细胞宿主细胞
转化后的克隆群体:转化后的克隆群体:
11 遗传检测法遗传检测法
11 )抗药性标志的选择)抗药性标志的选择
pBR322
Amp Tet
插入片段插入片段
AmpAmp平板平板
TetTet平板平板
22 )标志补救()标志补救( ß-ß- 半乳糖苷酶半乳糖苷酶法)法)
lacZlacZAm
N2H
片片段段
COOHCOOH
片段片段
X-galX-gal
Lac ZLac Z
蓝色化合物蓝色化合物
X-galX-gal
(( LacZLacZ 基因 基因 NN 端序列)端序列) 插入片段插入片段
(( LacZLacZ 基因失基因失活)活)
LacZLacZ 基基因 因 NN 端端
序列序列
LacZLacZ 酶酶
2 2 电泳检测法电泳检测法
凝胶电泳检测凝胶电泳检测
加加样样孔孔
DNA MarkerDNA Marker
空质粒空质粒重组质粒 重组质粒
重组质粒酶切重组质粒酶切
重组质粒的重组质粒的 PCPCRR 扩增片段扩增片段
原位杂交原位杂交
3 3 菌落杂交筛选法菌落杂交筛选法
实验仪器
超净工作台超净工作台
离心设备台式高速冷冻离心机
恒温空气摇床恒温空气摇床
恒温培养箱
培养皿
恒温水浴锅
材料及试剂
E.coli DH5α
pUC19 质粒
λDNA
EcoRI 酶
3mol/L Kac (pH5.2)
Xgal (20mg/ml)
IPTG (200mg/ml)
材料及试剂 1. T4DNA 连接酶
2. 10×T4DNA 连接酶缓冲液 :
400mmol/L Tris-Cl pH7.5
100mmol/L MgCl2
100mmol/L DTT,
500 μg/ml BSA
5-10mmol/L ATP
试剂3. 限制性内切酶( PstI )
4. 10× 限制性内切酶缓冲液
500mmol/L Tris-Cl
100mmol/L MgCl2
1000mmol/L NaCl
1mg/L BSA
5. 灭菌去离子水
实验步骤1. 混合以下溶液于一个无菌离心管中
xμl pUC19 质粒 (0.1-4μg)
2μl 10× 酶切缓冲液
1- 5U 限制性内切酶( EcoRI )
yμl 去离子水
终体积为 20μl
2. 在推荐温度下育温 1小时(一般为 37℃)
加入 5μl 电泳缓冲液终止反应,电泳检测结果。
酶切
实验步骤1.混合以下试剂
λ DNA 7.7μl
pUC19 DNA 1 .0μl
10×T4DNA 连接酶缓冲液 1.0μl
T4DNA 连接酶 (10u/μl) 0.3μl
混合液于 14℃ 培养 12小时
连接
转化及筛选
连接子的转化及筛选同实验一。
实验结果
实验报告
1.简述实验目的和实验原理及材料与试剂 ;
2.详述实验步骤;
3.画出实验结果示意图并分析。