第六章重组 DNA 技术的操作过程

第六章重组 DNA 技术的操作过程A DNA 的体外重组（切、接）B 用于基因转移的受体菌或细胞C 重组 DNA 分子的转化和扩增（转、增） D 转化子的筛选和鉴定（检）

第六章重组 DNA 技术的操作过程切接转

增检

一 DNA 的体外重组（切与接）第六章重组 DNA 技术的操作过程

同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接

粘性末端的更换人工粘性末端的连接

重组率

外源 DNA 片段同载体分子连接的方法，即 DNA 分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和 DNA 连接酶的作用。

一般说来在选择外源 DNA 同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素：

(1) 实验步骤要尽可能地简单易行， (2) 连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回

收插入的外源 DNA 片段， (3) 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。

A 同种内切酶生产的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

EcoRI

5'GCTTAA

AATTCG

5' 5' GCTTAA 5' 5'

AATTCG

5'

退火GCTTAA

AATTCG

5' GCTTAA 5'

AATTCG

GCTTAA

AATTCG

5' GCTTAA 5'

AATTCG

T4-DNA ligase

GAATTCCTTAAG

5' 5'

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

5' 5'

GAATTCCTTAAG

B 同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI

5' 5'

GGATCCCCTAGG

GGATCCCCTAGG

5'GCCTAG

GATCCG

5' 5' TACTAG 5' 5'

GATCAT

5'

退火GCCTAG

GATCCG

5' TACTAG 5'

GATCAT

T4-DNA ligase

TGATCCACTAGG

5' 5'

GGATCACCTAGT

5' TGATCAACTAGT 5'

BclI

GCCTAG

GATCCG

5' TACTAG 5'

GATCAT

TGATCCACTAGG

5' 5'

GGATCACCTAGT

C 不同粘性末端的连接BamHI

5' 5'

GGATCCCCTAGG

GGATCCCCTAGG

5'GCCTAG

GATCCG

5' 5' CTGCAG 5'

GACGTC

3'

T4-DNA ligase

CGATCCGCTAGG

5' 5'

GGATCGCCTAGC

5' CTGCAGGACGTC 5'

PstI

3'

T4-DNA pol 切平5' C

G 5' G

C

Klenow 补平

5'GGATCCCTAG

GATCC5' CTAGG

CGATCCGCTAGG

5' 5'

GGATCGCCTAGC

D 人工粘性末端的连接 5‘ 突出末端

5'GCCTAG

GATCCG

5' 5' GCTTAA 5' 5'

5' AATTCG

T4-DNA ligase

5' 5'

Klenow 补平 Klenow 补平5'

GGATCCCTAG

GATCC5' CTAGG

5' GAATTCTTAA 5' 5'

5' AATTCTTAAG

TdT TdTdGTP dCTP

GAATTGGGGGGCTTAA

AATTCGGGGGGTTAAG

GGATCCCCCCCCCTAG

GATCCCCCCCCCTAGG

GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGG

GGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG

5' 5'

GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGG

GGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG

退火BamH I

BamH IEcoR I

BamH I

D 人工粘性末端的连接 3‘ 突出末端 CTGCA 3'

GG

3' ACGTC5' GCATG 3'

C 5'C

3' GTACG

T4-DNA ligase

TdT TdTdCTP dGTP

GCATGCCCCCC 3'C

退火

Pst I Pst I

C3' CCCCCCGTACG

CTGCAGGGGGG 3' G

G3' GGGGGGACGTC

5' 5'

GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTC

CTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTC

CTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG

5' 5'

GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTC

CTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG

5' 5'



Klenow

Pst ISph I

D 人工粘性末端的连接平头末端C 3' G

G5' G 3'C 5'

C3' G

T4-DNA ligase

TdT TdTdTTP dATP

GTTTTTTTTTT 3'C

退火C

3' TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3' G

G3' AAAAAAAAAAC

5' 5'

GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAAC

CAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG

S1

C3'

5' 5'

GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAAC

CAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG

加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAA

ACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTT

TGTGAC

CAGT

E 粘性末端的更换BamHI

5' 5'

GGATCCCCTAGG

T4-DNA ligase

Klenow 补平GATCC5'

G5'GCCTAG 5'

5'

5'GGATCCCTAG

5' GATCCCTAGG

5'5'

GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG

5' 5'

EcoR I

GGAATTCCCCTTAAGG

EcoR I linker

F 重组率重组率的定义

重组率 = 含有外源 DNA 的重组分子数 / 载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为 25 - 75%

重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化 DNA 重组的后续操作。

F 重组率提高重组率的方法

提高外源 DNA 片段与载体的分子比： 5 : 1 - 10 :

1 载体 DNA 分子在连接前先除去磷酸基团：

5' 5'

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

EcoRI

5'GCTTAA p

AATTCG

5' p5' GCTTAA OH 5' 5'

AATTCG

5' HO

退火5' G-A-A-T-T-C

C-T-T-A-A G 5'G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G

OHHO

OHHO

碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶

F 重组率提高重组率的方法

加装同聚尾末端：

CTGCA 3' G

G3' ACGTC

5' GCATG 3'C 5'

C3' GTACG

T4-DNA ligase

TdT TdTdCTP dGTP

GCATGCCCCCC 3'C

退火C

3' CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3' G

G3' GGGGGGACGTC

5' 5'

GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTC

CTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG

5' 5'



Klenow

二用于基因转移的受体菌或细胞

各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体

受体细胞应具备的条件

一、宿主的选择从安全性考试，应具备以下条件： 1. 不适合在人体内生存 2. 不适合在非培养条件下生存 3. 在非培养条件下，其 DNA 容易解体 4. 它的 DNA 不易转移 5. 它的质粒只在这一宿主由复制 6. 便于检测

A 受体细胞应具备的条件

从遗传性考虑： 1. 重组缺陷型 recA －，用于基因扩增或高效表达的受体细胞（ recA- ） 2. 限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源 DNA 的除解。外切酶和

内切酶活性缺陷（ recB-， recC-， hsdR- ） 3. 与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型） 4. 具有较高的转化效率

A 受体细胞应具备的条件

B 各种基因工程受体的特性大肠杆菌

遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定

适用于外源 DNA 的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是 DNA 重组实验和基因工程的主要受体菌

产物结构复杂、种类繁多的内毒素

B 各种基因工程受体的特性枯草杆菌

遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素

适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌

遗传欠稳定，载体受体系统欠完备

B 各种基因工程受体的特性链霉菌

抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素

主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢

B 各种基因工程受体的特性酵母菌

具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定

适用于外源 DNA 的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是 DNA 重组实验和基因工程重要的真核性受体菌

内源性蛋白产物种类繁多且含量高

B 各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）

具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定

适用于真核生物基因的高效表达 DNA 重组操作系统欠完善

B 各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO ）

与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统

适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是 DNA 重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体

细胞培养条件苛刻，生长缓慢

B 各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶）

农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用

适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良

遗传操作繁琐

C 实验室常用的基因工程受体大肠杆菌

用于接受质粒：C600 、 W3110 、 HB101 、 JM83 、

JM101 （ Aps 、 Tcs 、 Cms ）用于接受 -DNA ： LE392 、 ED8654

酵母菌

哺乳动物细胞 CHO

毕赤酵母啤酒酵母

三重组 DNA 分子的转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增

A 转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化

Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等）， 1970年建立此技术，其原理是 Ca2+ 与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态


大肠杆菌感受态细胞的制备：100 ml 菌体培养至 OD600 = 0.5 ，离心收集菌体用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液悬浮菌体冰浴放置 12 - 24小时，备用

收集菌体


大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取 100 l 感受态细胞，加入相当于 50 ng 载体的重组冰浴放置半小时在 42℃保温 2 分钟（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置 1 - 2 分钟

DNA 连接液，混匀

加入 1 ml 新鲜培养基，于 37℃培养 1 小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选

A 转化的原理与技术细菌原生质体的转化

革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源 DNA

的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组 DNA 分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化


不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如 34% 的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在 10.3% 的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂

细菌原生质体的制备：


取 0.2 - 1ml 的原生质体悬浮液（ 108-109 个原生质体），加入 10 - 20 l DNA 重组连接液，同时加入含有 PEG1000 和

Ca2+ 的等渗溶液，混匀

细菌原生质体的转化：

细菌原生质体的再生：

原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素

A 转化的原理与技术噬菌体 DNA 的转染感受态细胞的培养：

将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和 MgCl2 的培养基中培养至 OD600 = 0.5

吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液， 30℃保温 10分钟转染裂解：加入 20 倍体积的新鲜培养基， 30℃培养 2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选

A 转化的原理与技术电电电电电

将待转化的质粒或 DNA 重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或 DNA 重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验

B 转化率电电电电电电

转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA 在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体 DNA 转化后，受体细胞接纳 DNA 的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）


例如， pUC18 对大肠杆菌的转化率为 108 ，即每微克 pUC18

中只有 108 个分子能进入受体细胞。一微克 pUC18共有 3.4X1011

个分子（ 6.02X1017 / 2686X660 ），也就是说，每 3400 个

pUC18 分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克 pUC18共需 2ml

感受态细胞，大约含有 2X1010 个大肠杆菌细胞，也就是说，每 2

00 个细胞只有一个细胞能接纳 pUC18 DNA


利用转化率和重组率等参数可以帮助设计 DNA 重组实验规模电电电某一 DNA 重组实验的重组率为 20% ，转化率为 107/g 载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低 100倍，欲获得 104

个重组克隆，需投入多少载体 DNA进行重组实验？若重组率为 100% ，则转化后产生 104 个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 g 载体 DNA 考虑到实验系统的重组率为 20% ，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 g 载体 DNA 载体投入量确定后，外源 DNA 的投入量即可按 10 1∶ 的要求算出（ 5 g ），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选

B 转化率电电电电电电电电

载体及 DNA 重组分子方面：载体本身的性质：

不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象：

质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级

插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低


受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如： pBR322 转化大肠杆菌 JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌 ED8767株的转化率则较高


转化方法方面：受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：

Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA

转化方法：Ca2+诱导转化 106 - 107 / g DNA

原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA

原生质体转化 105 - 106 / g DNA -DNA 转染 107 - 108 / g DNA 电穿孔转化 106 - 109 / g DNA

C 转化细胞的扩增电电电电

转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的 37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程噬菌体转染后的 30℃培养等，均属扩增操作

C 转化细胞的扩增电电电电电电电

增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定

四转化子的筛选和鉴定（检）载体遗传标记检测克隆 DNA 序列检测外源基因产物检测

四转化子的筛选和鉴定（检）由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子

转化子重组子目的重组子

A 载体遗传标记检测电电电电电电

ROPROI

Sal I

BamH I

Tcr

Pvu IPst I

Pst I

EcoR ICla IHind III

Hind II

Bal I

Apr

抗药性筛选法的基本原理：

pBR3224363 bp

ori

抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源 DNA 片段插在 EcoRI位点：非重组子呈

Apr 、 Tcr 重组子呈 Apr 、 Tcr 将外源 DNA 片段插在 BamHI位点

：非重组子呈 Apr 、 Tcr

重组子呈 Apr 、 Tcs

A 载体遗传标记检测电电电电电电

抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有 Ap 的平板再将 Ap 平板上的转化子影印至

含有 Ap 和 Tc 的平板上在 Ap 平板上生长、但在 Ap 和

Tc 平板上不长的转化子即为

Ap

Ap + Tc

影印挑选

重组子

A 载体遗传标记检测电电电电电电电电

营养缺陷型筛选法的基本原理：营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子


常见的营养缺陷型筛选标记：

用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因 trp+

用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择 tk- 缺陷型

胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（ thymidine Kinase,TK ）在所有真核细胞中都有表达 , 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶 , 它可催化胸苷磷酸化转变成为 dTMP, 继续磷酸化生成 dTTP,

参与 DNA 的生物合成。



TR dTMP dTDP dTTPTK

TK 胸腺嘧啶核苷激酶

含有胸腺嘧啶核苷激酶（ TK ）编码基因缺陷的受体细胞（ tk -

）不能在含有次黄嘌呤 (H) 、氨基喋呤 (A) 、胸腺嘧啶核苷 (T)

的培养基上（ HAT 培养基）生长，载体上的标记基因 tk 能与之遗传互补 . TK- 细胞因氨基喋呤抑制了 dTTP 的合成而死亡， TK+ 细胞可存活，以此进行筛选 .



dCDP dTDP dTTPAP

AP 氨基喋呤

A 载体遗传标记检测电电电电电

显色筛选法的基本原理：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒 pUC18携带的 lacZ’ 基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的 melC 基因（黑色反应）等

A 载体遗传标记检测电电电电电

显色筛选法的基本操作： pUC18

Apr

lacZ'

ori

Ap + X-gal

重组子（ Apr +

lacZ- ）

将外源基因克隆在 pUC18 的 lacZ’

标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈 Apr 、 lacZ- ，淡黄色菌落；而非重组子则呈 Apr 、 lacZ+ ，蓝色菌落

B 克隆 DNA 序列检测电电电电电电电电

所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA 片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。


全酶解图谱法：

pUC18 2.7 kb

HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI

Apr

lacZ’

ori

B BE P

4.0 kb

1.0 kb 0.8 kb

区分重组子与非重组子用 BamHI 酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段重组子： 2.7 kb + 4.0 kb

非重组子： 2.7 kb

如果外源 DNA 片段也是 2.7 kb ，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子



pUC18 2.7 kb


Apr

lacZ’

ori

S SB P

4.0 kb

1.0 kb 0.8 kb

区分重组子与非重组子如果外源 DNA 片段插在 pUC18

的 SphI位点处，原则上也可用SphI 酶解鉴定，但这样做很不经济，因为 SphI 非常昂贵（每 100

单位 50美元）。用 HindIII 和

EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及 SphI

的 1 / 50



pUC18 2.7 kb


Apr

lacZ’

ori

B BE P

4.0 kb

1.0 kb 0.8 kb

区分目的重组子与非目的重组子用 EcoRI 酶切转化子质粒 DNA

目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb

或者： 1.0 kb + 5.7 kb

用 PstI 酶切转化子质粒 DNA

目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb

或者： 0.8 kb + 5.9 kb



pUC18 2.7 kb


Apr

lacZ’

ori

B BE

4.0 kb

2.0 kb 2.0 kb

区分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒DNA 用 EcoRI 酶切开后，只出现2.0 kb 和 2.7 kb两条带子，实际上 2.0 kb 的条带中含有两种不同的分子

2.7 kb

2.0 kb

E


部分酶解图谱法：

2.2 kb

PstI EcoRI BamHI

BBE

4.4 kb

1.2 1.8 kb

EB

0.6 0.8

该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：BamHI 全酶解： 0.6 0.8 5.2 kb

BamHI+EcoRI 全酶解： 0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb

其中， 1.2 kb 片段的存在表明该片段位于一端BamHI部分酶解： 1.4 2.6 4.0 kb

其中， 1.4 kb 的片段必为 0.6 kb 和 0.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；同理， 2.6 kb 的片段必为 0.

8 kb 和 1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后，4.0 kb 的片段必为 0.6 kb 和 3.4 kb两片段，表明两者是连在一起的

B 克隆 DNA 序列检测电电电电电电电电电电

菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或 DNA 片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中， DNA 同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据


菌落原位杂交法的基本操作：影印用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板

洗涤杂交

感光

用 0.4N 的 NaOH溶液浸泡影印薄膜用 SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温用 SSC-SDS 液洗涤杂交薄膜用 X光胶片覆盖薄膜感光

控制杂交和洗膜的缓冲液


杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：

单链结构（双链 DNA 可用碱变性）足够长度（至少 12 个碱基）内部不含互补区

探针的制备方法或来源包括：人工合成 cDNA 合成同源序列 mRNA

GACCTAAAGCGGATCGTAGGTC

GACCTACTGGAT

AAGC

TGGGC A


杂交探针的标记： T4-PNP介导的末端标记

5‘ HO3‘ HO

OH 3‘ OH 5‘

T4-PNP Mg2+ pppATP （ -32P-

ATP ）5‘ p

3‘ HOOH 3‘ p 5‘

T4-多核苷酸磷酸激酶


杂交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记3’AAAAAAAAAAACCAGCUUCC···GAACUGAUUUAGGCU 5’mRNA

反转录酶 Mg2+ dNTP + pppdATP （ -32P-

dATP ）

5’TTTTTTTTTTT

5’mRNA3’cDNA

3’AAAAAAAAAAACCAGCUUCC···GAACUGAUUUAGGCU5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAATCCGA


杂交探针的标记： DNA 聚合酶介导的缺刻前移标记5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’

3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘

Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA （ -32P-dATP ）

5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T… 3’

3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘

5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘

DNase I

DNA pol I


杂交探针的标记： ABC荧光标记

GCTTGAGCAGTAACCTG

荧光胺

Biotin 生物素

Avidin生物素结合蛋白

烷烃连接臂


杂交探针的标记： ABC 显色酶标记

GCTTGAGCAGTAACCTG

显色酶Biotin 生物素

Avidin 生物素结合蛋白

烷烃连接臂

生色底物

颜色产物


杂交探针的标记：地高辛系统标记

dUTP- 连接臂 -甾醇半抗原 digoxigenin DIG

抗体 - 显色酶交联复合物

B 克隆 DNA 序列检测DNA 序列分析法

双脱氧末端终止测序法的基本原理： DNA 序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用 Sanger 发明的双脱氧末端终止法测定 DNA 序列，其工作原理是在 DNA 聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定 DNA

序列其关键技术有：DNA链聚合反应时的定点随机中断（ ddNTP ）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（ 600 bp / 601 bp ）

电脑自动检测、记录、编辑程序用于 DNA 测序的专一性试剂盒（ Kit ）

在模板指导下，聚合酶不断将 dNTP 加到引物的 3’-OH

末端，使引物延长，合成出新的互补的 DNA 链，如果加入双脱氧三磷酸核苷 (ddNTP ） , 由于双脱氧核糖的 3’ 位置上缺少一个羟基，故不能同后续的 dNTP 形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同 5’- 引物端和以 ddNMP 残基为3’ 端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链 DNA ，从而读取DNA 的核苷酸序列。

POH

dNTP

ddNTP

POH

OH

P

P

P

P

OH

双脱氧终止法测序反应体系包括：DNA 聚合酶单链 DNA 模板带有 3-OH 末端的单链寡核苷酸引物Mg2+

4 种 dNTP(aATP,dGTP,dCTP 和 dTTP)

4 种 ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP 和 ddTTP)

Sanger 法 DNA 测序的试剂① 引物：通常由 20-23 个碱基构成， G+C=12 ， A+T=8 到

11 ， Tm=60-68℃ ，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构② 模板

③ DNA 聚合酶 ④ 2′ ， 3 ′- 双脱氧核苷三磷酸

（ 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ dNTP


双脱氧末端终止测序法的基本操作：

A C G T

ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA Primer Primer Primer Primer Klenow Klenow Klenow Klenow

dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs

ddATP ddCTP ddGTP ddTTP

A G T C

DNA 聚合反应

聚丙烯酰胺凝胶电泳


双脱氧末端终止测序法的基本反应：

Klenow

OH 3'5' P

T

dNTP + ddATP

TTTTTOH 3'5' P

A G T C

GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA

C 外源基因产物检测电电电电电电电电电电

淀粉酶目的基因的鉴定：

淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，易于辨认。蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定


抗菌素抗性基因的鉴定：抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生


抗菌素抗性基因的鉴定：目的重组子

诱导抗性

抽取重组质粒再次转化


DNA 结合蛋白编码基因的鉴定：

影印

用聚乙烯薄膜影印裂解平板

洗涤杂交

感光

轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 80℃烘干固定影印薄膜与探针溶液中杂交洗涤、干燥、感光

用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板聚乙烯膜

探针选用能与目标蛋白特异性结合的DNA 片段

裂解菌落，释放包含外源基因表达产物在内的细胞内含物

该方法用于 cDNA 文库中目的基因的筛选。其原理是在体外无细胞的转译中利用 cDNA 与 mRNA 杂交后导致 mRNA 的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。

分离的基因编码着丰富的 mRNA 。优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。缺点：较烦琐。


杂交释放转译鉴定：

步骤： 1. 将从大肠杆菌菌落或噬菌体群体中制备的带有目的基因的重组质

粒 DNA 变性后，与总 mRNA 杂交； 2. 转入无细胞转译体系（麦胚提取物或兔网织红细胞提取物） , 由

于加有 35S 标记的蛋氨酸，转译的多肽蛋白质可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析；

3. 结果同未杂交的 mRNA 转译产物作比较，从中找出其转译合成被抑制的 mRNA ，即同目的基因变性 DNA 互补彼此杂交的 mRNA。



杂交释放转译鉴定：

合并

变性

挂柱

制备

上样

淋洗

洗脱

翻译

测活

重组 DNA 单链 DNA mRNA 杂交的mDNA

蛋白质蛋白质无细胞体外翻译系统：麦胚提取物、网织红细胞提取物


放射免疫原位杂交鉴定：

影印

用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印

洗涤与 I125 标记的 IgG 保温

感光轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定与 I125 标记的 IgG 保温洗涤、干燥、感光

用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板

含抗体的聚乙烯膜

裂解平板


免疫沉淀鉴定：在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体然后涂布转化液

37℃ 培养经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周围形成白色的圆斑此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大


如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用电电电电电电电电电电电电电电电电

如果克隆在载体质粒上外源基因高效表达，会出现比较宽的考马斯亮蓝染色带

第六章重组 DNA 技术的操作过程

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