• 면역전기영동법 – 1955년 Grabar

• Gel 확산에 의한 침강반응과 하전 정도에 의해 단백질을 분리하는 전기영동법을 조합시킴

– 면역전기영동법의 원리 • 단백질

– 아미노산의 polypeptide결합으로 구성 – 그 외 당, 지질

• 아미노산 – C, H, O, N, S, P, I, Fe, Cu, Zn 등의 원소를 함유 (SPONCHI, Fe, Cu, Zn)

• 단백질의 물리, 화학적 성상 – 아미노산의 성상(NH2)에 기인 – 아미노산 한 분자: 알칼리성(amino기), 산성(carboxyl기) 이 각기 peptide 결합하

여 polyetides를 구성 » amino기: 물과 반응하여 알칼리성을 나타냄 » carboxyl기: 해리되어 산성을 나타냄

– 수용액에 산(H+ high)을 가하면 단백분자는 양전하가 증가 – 수용액에 알칼리(OH- high)를 가하면 단백분자는 음전하가 증가 – 등전점 : 단백분자내의 양이온과 음이온의 수가 같아 전기적으로 중성을 나타내는 pH

» albumin: 4.9, α-globulin: 4.9-5.4, β-globulin: 5.9, γ-globulin: 5.7-7.3 » (pH 8.2 ~ 8.6 사용 모든 혈청 단백 (-)로 하전, (+)로 전기영동 가능)

• 보통 전기영동시 buffer pH 8.2-8.6을 사용 – 모든 혈청 단백은 음전하로 하전되어 양극으로 끌려가게 됨

– 단백의 등전점과 buffer solution의 pH와의 차이가 클수록 음으로 강하게 하전됨

– albumin이 양극으로 끌려가면 γ-globulin이 가장 나중에 끌려감

– 이러한 현상은 여지전기영동법(paperelectrophoresis),

cellulose acetate 전기영동에 적용해서 사용

• agar나 agarose 전기영동법 – agar 저항에 의해 albumin은 양극으로 이동

– α나 β-globulin은 검체를 가한 부위

– γ-globulin은 음극으로 이동

• 면역전기영동의 단계

– 1단계 • 여지전기영동법으로 검체(혈청 혹은 단백효소)를 분리시키는 것과 같은 조건으

로 agar coated slide에서 혈청단백을 분리

– 2단계 • 분리된 여러 분획에 대응하는 특이항혈청과 2원 확산하여 상호 특이반응에 의

한 침강대를 생성

• 단백염색하여 분석(amino black 10B, poncaeu 3R)

• 단백의 이동도에 영향을 미치는 요인

– 단백분자의 표면 하전

– 완충액의 pH

– 함유된 전해질의 성질 및 ion 강도

– 지지체의 전기영동법

• 지지체의 특성

• 단백분자의 모양, 크기, 전기침투현상

2) 응집반응 (agglutination reaction)

• 응집반응 – 세균, 적혈구, 백혈구 같은 일정한 크기를 가진 항원입자가 그 항체(IgG,

IgM)과 반응하여 응집괴를 만드는 현상

– 응집원: 항원

• 세균, 적혈구, 백혈구, 일정한 크기의 latex, bentonite, Kaline, 등의 입자에 흡착시킨 침강원(단백다당체, lipid), 가용성 항원(항체)를 피막한 동물의 적혈구

– 응집소: 항체

– 단순한 침강 반응에 비하여 감도가 10배 이상 높다

(응집원 + 응집소 응집)

• 직접응집반응

– 세균응집반응

– 혈구응집반응

• 간접응집반응

– latex 응집반응

– 간접 적혈구응집반응

– 항글로블린을 피막한 적혈구 응집 반응

– kaolin 응집반응

– 감작적혈구응집반응

직접응집반응

• 세균응집반응 – 세균과 세균에 대한 항체(면역혈청)이 반응 – 질병을 앓고 있는 동안 실시함 – 특이항체 역가(antibody titer)가 상승하면 현증감염을 암시 – 반응의 특성

• 교차반응(cross reaction) – 두 가지 다른 세균이 하나의 공통항원 결정기를 공유 – 이 항원에 대한 항체에 두 가지 세균이 모두 반응을 보임 – 위양성의 원인이 되기도 함 – rickettsia 혹은 virus에서도 일어남

• 구역반응(zonal reaction): 항원, 항체 비율이 가장 적당할때 나타나는 반응 • 전역반응(prozone reaction): 항체의 양이 많아서 반응이 안일어남 • 후역반응(postzone reaction): 항원이 너무 많아서 반응이 안일어남

• 혈구 응집 반응

– 적혈구가 해당 항체와 반응해서 응집이 일어나는 반응

간접응집반응

• 단백, 다당체, 지질 등을 일정한 크기의 인공입자(latex, bentonite, kaolin, colloid)나 적혈구에 흡착시켜 대응한 항체와 응집을 일으키는 것

• Latex 응집반응

– Latex에 가용성항원(단백항원)을 피막시킴

– 항체가 반응하면 latex 응집이 일어남

– RA test, CRP, Plano-test 등

• 간접 적혈구응집반응

– 가용성항원(혹은 항체)을 적혈구에 피막

– 항체와 반응하면 혈구응집이 발생

– 역수신 적혈구응집법(RPHA: reverse passive hemagglutination test)

• 적혈구에 항체를 피막

• HBsAg, alphafetoprotein

– 수신 적혈구응집법(PHA: passive hemagglutination test)

• 적혈구에 항원을 피막

• anti-HBs 나 아메바 항체검사

그림 6-20. 간접적혈구 응집반응

• 항 Globulin을 피막한 적혈구 응집 반응 – Anti-human globulin(Coombs’)혈청

– 토끼에 사람의 혈청 글로블린을 주사하여 얻은 혈청

– 직접 항 globulin 시험

• 적혈구에 불완전 항체의 결합여부를 보는 검사

• 적혈구와 anti-human globulin 혈청을 반응시켜 응집을 관찰

– 간접 항 globulin 시험

• 혈청 중에 불완전항체가 산출되고 있는지의 여부를 보는 검사

• 혈청(불완전항체)과 적혈구(감작적혈구)를 반응시킨 후 다시 anti-human globulin 혈청을 반응시켜 응집을 육안적으로 관찰

• Kaolin 응집반응

– 항원에 kaolin 입자를 흡착시켜 해당 항체를 검사

– 매독항체(VDRL), 결핵균 항체 검출 등

• 감작 적혈구 응집반응

– 감작적혈구

• 면양 적혈구를 토끼에 주사하여 얻은 항 혈청을 면양적혈구와 반응 시킴

– 류마티스 관절염 환자의 혈청에서 응집을 보임 (Waaler-Rose test)

4. 중화반응 (Neutralization reaction)

• 항원(독소 toxin, 변독소 toxin, virus)입자와 대응하는 항체(antitoxin)이 반응하여 항원이 가진 특유한 생물 활성을 중화하는 혈청학적 반응

– 독소중화반응

– virus 중화반응

– 효소중화반응

독소중화반응 • 독소, 톡소이드에 의해서 생산된 항체와 독소가 특이적으로 결합하여 독소작용

을 무독화 또는 중화 시키는 반응 – 독소 + 항독소 독소의 독작용 중화

• 독소 – 생체에 독작용을 가지는 고분자물질로 항원으로서의 성질을 가지고 있음 – 세균성, 동물성, 식물성 독소로 나누어짐

• 세균성독소 – 균체 외독소 (exotoxin) – 균체 내독속 (endotoxin)

• 동물성독소 – 전갈, 거미, 뱀 등

• 식물성독소 – 리치닌

• 응용

– 디프테리아, 파상풍, 독사의 교상 등

• 검사법

– Flocculation법 (Ramon)

• diphtheria 독소에 대한 항독소의 역가를 측정

• 가검혈청(항독소 혈청)을 일정하게 계단 희석

• 일정량의 독소를 넣어 반응시킴

• Flocculation이 일어나기 시작한 첫 tube 역가

– Elek 법

• 디프테리아균의 독소 생성여부를 조사

• 바이러스 중화반응 – 실험동물

• 바이러스 중화항체를 함유한 면역혈청 • 검사하고자 하는 virus 부유액을 혼합 • 일정기간 반응 • 감수성이 높은 실험동물에 주사 • 실험동물의 사망수를 기초로 중화항체 역가측정

– 조직배양세포, 부화란

• 조직배양세포나 부화란에 접종 • 배양조직의 세포변성이 중화항체에 의해 특이적으로 저지되는가를 판단

– 현성감염 및 불현성감염에서도 수년동안 지속

• 항체의 존재만으로 바이러스 감염이 있다고 진단하기 어려움 • 급성기와 회복기의 항체가의 상승을 증명

• 효소중화반응

– 효소와 특이적으로 결합하여 효소작용을 중화하는 항체

– Streptolysin O

• β-hemolytic streptococcus가 분비

• 사람이나 토끼의 적혈구를 용혈

• anti-streptolycin O를 환자의 혈청과 반응

– 적혈구 용혈능력을 상실

– streptococcus 감염여부 진단