Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М.
description
Transcript of Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М.
Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М.
Химический факультет МГУ имени М.В. ЛомоносоваЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»
Проблема:
Устойчивостьмикроорганизмов к действию бета-лактамных антибиотиков
Причина : Продукция бактериальных ферментов – бета-лактамаз
Бета-лактамазы представляют собой группу бактериальных ферментов, способных гидролизовать бета-лактамные антибиотики
1940 – E. Abraham E. Chain описали инактивацию пенициллина в бесклеточном экстракте культуры E. coli
1965 – описана бета-лактамаза ТЕМ-1Наст. время – описано более 700 бета-лактамаз
NO
COOH
S
HN
COOH
S
OH
H2O
Классификация семейства бета-лактамаз
KPCKPC OXAOXA VIM SPMIMP GIM SIMVIM SPMIMP GIM SIM
TEMTEM SHVSHV CTX-MCTX-M
• Бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС)
• Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы
• Карбапенемазы
5
Задача:
одновременная идентифицикация нескольких типов бета-лактамаз, определение мутаций в них
Возможное решение:• использование молекулярно-генетических
методов• использование мультипараметрических
методов исследований
6
Биологические микрочипы
Биологические микрочипы – это организованное размещение биологически активных молекулв виде миниатюризированных матриц на специальном носителе
Метод ДНК-зондов
Микрочип
7
Особенности технологии микрочипов
Одновременное определение множества параметров
Миниатюризация
Автоматизация
Высокая производительность
Одновременное определение множества параметров
Миниатюризация
Автоматизация
Высокая производительность
Выделение ДНК
• Амплификация гена (ПЦР)• Введение метки
Гибридизация Детекция результатовгибридизациипо активностиметки
Детекция результатов Детекция результатов гибридизационного анализагибридизационного анализа
9
Микрочипы с флуоресцентной детекцией
Cy3
СубстратОкрашенныйпродукт
Бт
Фермент
Микрочипы с колориметрической детекцией
10
Идентификация типа гена
C GA C
G U
T
G CA
A
U
CGA
G
T
CA U
T
A
G
C
Прямая цепь
Обратная цепь
11
Выявление точечных мутаций в генах
CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCAACAACATGGGGGCAACATGGGGG
CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCGGCAACATGGGGGCAACATGGGGG
CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCCCCAACATGGGGGCAACATGGGGG
CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCTTCAACATGGGGGCAACATGGGGG
TEM-1TEM-1
TEM-21TEM-21
TEM-1TEM-1
TEM-21TEM-21
151
...GSG...GSGHHYGT...YGT...
...GSG...GSGRRYGT...YGT...
AGCT
Анализ нуклеотидных последовательностей генов
ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ингибитор-устойчивых бета-лактамазингибитор-устойчивых бета-лактамаз
Контроль иммобилизацииОтр. контроль гибр.Полож. контроль гибр.Идентификация типа гена
Мутации в blaTEM
Мутации в blaSHV
Мутации в blaСТХ-М
Носитель: найлон
Размер чипа: 8 мм х 14 мм
Диаметр точки: ~ 350 µm
Количество точек: 246
Количество зондов: 78
Идентификация:• 3 типа генов β-лактамаз: TEM, SHV и СТХ-М
• 25 мутаций в них для определения БЛРС и ингибитор-уст. БЛ
13
TEM-1 + SHV-1 + TEM-1 + SHV-1 + SHV-12 + CTX-M-15SHV-12 + CTX-M-15 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV I-IV пок-пок-нийний))
Ин
тен
си
вн
ост
ь,
отн
. е
д.
Ин
тен
си
вн
ост
ь,
отн
. е
д.
TEM-1 + SHV-1TEM-1 + SHV-1 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I I поколения)поколения)
Результаты тестирования штамма Результаты тестирования штамма K. pneumoniaK. pneumonia, , продуцирующего три продуцирующего три ββ-лактамазы:-лактамазы:TEM-1, SHV-1 TEM-1, SHV-1 и Си СTX-M-9TX-M-9
14
Ин
тен
си
вн
ост
ь,
отн
. е
д.
TEM-1 SHV-1 CTX-M-9
Апробация ДНК-микрочипа на клинических штаммах Enterobacteriaceae (n=100)
БЛРC – (n = 10): БЛРС+ (n = 90):
24,6% штаммов продуцировали 2 БЛРС
SHV-5-likeCTX-M-1-likeCTX-M-2-likeCTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-2-likeTEM-1-like + SHV-5-likeTEM-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + CTX-M-9-likeSHV-1-like + SHV-5-likeSHV-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-likeTEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-9-likeSHV-2-like + CTX-M-1-likeSHV-5-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-2-likeTEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-likeSHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeSHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeSHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-2-like
Не обн.ТЕМ-1SHV-1(TEM-1+SHV-1)
20%
20%
10%
50%
ДНК-микрочип для определения генов карбапенемаз Id_IMP Id_VIM Id_OXA
IMP-1 VIM-1 OXA-23
IMP-2 VIM-2 OXA-40
IMP-5 VIM-7 OXA-51
IMP-11 Id_SPM OXA-58
IMP-14 Id_SIM Id_KPC
Id_GIM
Контроль иммобилизацииПоложительный контроль гибридизацииОтрицательный контроль гибридизацииИдентификация для металло-β-лактамазИдентификация OXA-β-лактамазИдентификация KPC-β-лактамаз
Носитель: найлонРазмер микрочипа: 11мм×15ммДиаметр одной точки: 350 мкмКоличество точек: 132
Идентификация карбапенемаз:VIM, IMP, SPM, GIM, SIM (класс B)OXA ( класс D)KPC (класс A)
Апробация ДНК-микрочипа для определения генов карбапенемаз на клинических штаммах
МикроорганизмЧисло
штаммов
Типы обнаруженных карбапенемаз
OXA-23-like
OXA-40-like
OXA-51-like
OXA-58-like
VIM-2-like
Acinetobacter baumanii
n=15 1 5 15 4 -
Pseudomonas aeruginosa
n=15 - - - - 11
Скрининг клинических образцов на наличие БЛРС, ингибитор-устойчивых бета-лактамаз класса А и карбапенемаз классов A, B, D
Интегрированный ДНК-микрочипдля идентификации β-лактамаз
Благодарности:Благодарности:
• Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова Уляшова М.М. Халилова Ю.И. Григоренко В.Г. Игнатенко О.В.
• НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская гос. мед. академия Эдельштейн М.В.
• Институт нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко Александрова И.А.
Финансовая поддержка:ФЦП "Национальная технологическая база" на 2007-2011 годы (Контракт ГП/07/442/НТБ/К)
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !