利用细菌控制大豆根病技术研究段玉玺

沈阳农业大学植物线虫学研究室2007 年 9月 5日

大豆胞囊线虫Soybean Cyst Nematode (SCN)

胞　　囊

大豆胞囊线虫田间为害状

根部为害状

根部为害状

侵入侧根的二龄幼虫 侵入大豆根部中柱鞘内的二龄幼虫

大 豆 胞 囊 线 虫 二（ A ， B ） 、 三（ C ， D ） 、 四（ E ）龄幼虫大 豆 胞 囊 线 虫 成熟后突破根组织大豆胞囊线虫卵囊内的卵及二龄幼虫

大豆根腐病（ Soybean Root Rot ）

大豆根病生防细菌的筛选细菌悬液

细菌的 109cfu/ml 悬液细菌发酵滤液 温室试验

根病生防细菌不同靶标

对照（活 J2 ） 处理（死亡 J2 ）

E 10μm

A

CK R0118 B

C 10μm

D 10μm

F 10μm

菌株 R0118 （ A. 菌落形态 ; B. 葡萄糖发酵 ; C. 亚甲蓝染色 ; D. 革兰氏染色 ; E. 鞭毛染色 ; F. 芽孢染色）

菌株 R0140 （ A. 菌落形态 ; B. 葡萄糖发酵 ; C. 亚甲蓝染色 ; D. 革兰氏染色 ; E. 鞭毛染色 ; F. 芽孢染色）

E

10μm

A

B CK R0140

C 10μm

D 10μm

A

B 10μm

C 10μm

D 10μm

E 10μm

菌株 R0173 （ A. 菌落形态 ; B. 亚甲蓝染色 ; C. 革兰氏染色 ; D. 鞭毛染色 ; E. 芽孢染色）

菌株 R0223 （ A. 菌落形态 ; B. 葡萄糖发酵 ; C. 亚甲蓝染色 ; D. 革兰氏染色 ; E. 鞭毛染色 ; F. 芽孢染色）

A

B CK R0223

C 10μm

D 10μm

E 10μm

F 10μm

A

B 10μm

C 10μm

D 10μm

E 10μm

菌株 R0277 （ A. 菌落形态 ; B. 亚甲蓝染色 ; C. 革兰氏染色 ; D. 鞭毛染色 ; E. 芽孢染色）

菌株 R0463 （ A. 菌落形态 ; B. 葡萄糖发酵 ; C. 亚甲蓝染色 ; D. 革兰氏染色 ; E. 鞭毛染色 ; F. 芽孢染色）

E 10μm

C 10μm

A

B CK R0463

D 10μm

F 10μm

A

B 10μm

C 10μm

D 10μm

E 10μm

菌株 R0471 （ A. 菌落形态 ; B. 亚甲蓝染色 ; C. 革兰氏染色 ; D. 鞭毛染色 ; E. 芽孢染色）

菌株 R0495 （ A. 菌落形态 ; B. 葡萄糖发酵 ; C. 亚甲蓝染色 ; D. 革兰氏染色 ; E. 鞭毛染色 ; F. 芽孢染色）

A

B CK R0495

C 10μm

D 10μm

E 10μm

F 10μm

A

B

C 10μm

D 10μm

E 10μm

菌株 R0671 （ A. 菌落形态 ; B. 亚甲蓝染色 ; C. 革兰氏染色 ; D. 鞭毛染色 ; E. 芽孢染色）

菌株 R0675 （ A. 菌落形态 ; B. 葡萄糖发酵 ; C. 亚甲蓝染色 ; D. 革兰氏染色 ; E. 鞭毛染色 ; F. 芽孢染色）

D 10μm

A

B CK R0675

C 10μm

E 10μm

F 10μm

处理菌株Strains死亡的线虫数（条）The dead number of J2 校正死亡率Corrected mortality（ % ）

I II III 平均r030048r030060r030066r030121r030260r030348r030361r030398对照 CK无菌水 CK

7498563741

95106884822

6668792741

7.33Aa5.00Bb8.33Aa7.33Aa6.67Ab7.67Aa3.00Bb7.33Aa3.33Bb1.33Bb

60.00%25.04%75.00%60.00%50.00%65.07%-0.05%60.00%－－

表 2- ４ 不同菌株发酵液对大豆胞囊线虫 J2 的影响Table2-4 The effect of fermentation of different stains to J2 of SCN

菌株发酵液对大豆胞囊线虫 J2 的毒性作用

J 2不同菌株发酵液对大豆胞囊线虫 的影响

0123456789

10

r030048 r030060 r030066 r030121 r030260 r030348 r030361 r030398 CK对照 CK无菌水

处理菌株

死亡的线虫数( 条

)

对大豆胞囊线虫的作用

10 株已鉴定细菌的发酵滤液对大豆胞囊线虫 J2 的作用

0102030405060708090

100

R0118 R0140 R0173 R0223 R0277 R0463 R0471 R0495 R0671 R0675细菌菌株号

(%)

线虫死亡率

12h时线虫死亡率6h时线虫死亡率2h时线虫死亡率

a a a a a ab

b

a

b

a

44 株细菌的发酵滤液对大豆胞囊线虫 J2 的作用

2.6%-23.8%

2.6%-48.6%40 43 43

0

23

40

0

10

20

30

40

50

2h 6h 12h时间

()

细菌菌株数株

J 2抑制全部 活动的细菌J 2杀死 的细菌

生防活性传统研究

微生物工作者 植保工作者 根瘤菌

固氮结瘤能力 各种生防因子方 手 法 段

创新研究

固氮 防病 提高防效内生工程菌株

1. 筛选对大豆根腐病原真菌的有拮抗活性目的生防细菌

15 株根瘤菌： L396

786 株 79 株64 株产芽孢细菌： 64 、 Snb2 、 417 、 454 、 476 、 611 、 620

Snb2 对 4 种大豆根腐病菌的拮抗作用

尖孢镰刀菌 茄腐镰刀菌

立枯丝核菌 腐霉菌

L396 对大豆根腐病菌的拮抗作用

茄腐镰刀菌 腐霉菌

菌株 48h校正死亡率 (%) 96h校正死亡率 (%) 菌株 48h校正死亡率 (%) 96h校正死亡率 (%)L64 4.23 14.5 S274 8.3 38.7

Snb2 17.5 66.7 S233 12.6 46.4

L179 5.7 20.51 S165 9.78 39.65L258 6.73 25. 8 S287 8.9 35.21S345 15.2 50.00 S478 16.63 63.76L417 5.6 23.46 S066 14.7 49.38

S121 11.75 44.77 L396 7.3 21.6

L040 3.84 12.58 S620 13.5 47.14S454 9.78 39.6 L352 5.39 17.1

2. 活性菌株菌悬液对二龄幼虫的致死率测定

3. 目的细菌菌株抑菌谱的测定

薯芋黑斑病菌 番茄灰霉病菌 黄瓜菌核病菌 黄瓜枯萎病菌

水稻纹枯病菌 水稻恶苗病菌 水稻赤霉病菌 葡萄白腐病菌

玉米大斑病菌 玉米小斑病菌 烟草赤星病菌 小麦根腐病菌

( 注：上：对照；左： Snb2 ；右： L396 ； )

处理菌株 12h校正死亡率 (%) 24h校正死亡率(%)48h校正死亡率(%)

72h校正死亡率(%)L396 17.39 21.74 30.43 39.13Snb2 35.71 47.62 57.14 69.05

4. 目的生防细菌发酵液对大豆胞囊线虫 J2 的致死作用测定

5. 温室盆栽防效对照根部平均胞囊量为 36 个 , 最多达 57 个；Snb2 处理的大豆根部平均胞囊量为 13.5 个，防治效果达到 62. 5% ；菌株 L396 处理的大豆根部平均胞囊量为 26.5 个；

＋＋抗酸染色－－荚膜微纤毛周生多鞭毛鞭毛－＋革兰氏染色

无芽孢有芽孢，椭圆形，间生，偶有端生，胞囊不膨大芽孢染色

3.46±1.24(1.75~5.35)×1.56±0.38(1.1~1.95)

1.32±0.68(1.25~2.5)×0.65±0.25(0.5~0.9)

菌体大小（ μm）杆状，较粗，内有聚 -β-羟基丁酸盐颗粒短杆状菌体形态

菌落较小，呈圆形，边缘光滑，乳白色，凸起，有光泽，有粘液，直径 2-4mm，不产色素

菌落大，圆形至不规则形，边缘褶皱，表面干燥，中间凹陷，灰白色，不产色素菌落形态

L396Snb2鉴定项目生防细菌 L396 和 Snb2 的形态观察

注：“－”代表阴性；“＋”代表阳性；

目的菌生理生化性状鉴定 －－ 丙酸盐利用＋＋柠檬酸盐利用＋＋厌氧性测定－－氧化酶＋＋接触酶＋＋葡萄糖氧化发酵＋－ 脲酶－－硝酸盐还原＋＋淀粉水解还原产酸牛奶胨化＋＋甲基红＋＋明胶水解＋＋运动性－－3-酮基乳糖测定－＋V-P测定＋－苯丙氨酸解氨酶

L396Snb2 特 征

注：“－”

代表阴性；“

＋”

代表

阳性；

L396 的鉴定A ．亚甲蓝染色 B ．革兰氏染色C ．鞭毛染色D ．芽孢染色E ．淀粉水解F ．甲基红 G ．柠檬酸利用H ．明胶液化 I ．脲酶测定 J ．葡萄糖氧化发酵 K ． V-P 测定L. 荚膜染色

L

A B C

FED

G H I

KJ

Snb2 的鉴定A B C

FED

G H I

LKJ

A ．亚甲蓝染色 B ．革兰氏染色C ．鞭毛染色D ．芽孢染色E ．淀粉水解F ．甲基红 G ．柠檬酸利用H ．明胶液化 I ．脲酶测定 J ．葡萄糖氧化发酵 K ． V-P 测定L. 荚膜染色

初步鉴定结果： Snb2: 芽孢杆菌属（ Bacillus sp. ）； L396: 中华根瘤菌属（ Sinorhizobium sp. ） .

16SrDNA 的 PCR 扩增产物

Snb2 16S rDNA 全序列共有 1488bp ；L396 16S rDNA 全序列共有 1438bp ；

20002500

M Snb2 L396

1500

500

300

1000

菌株 strains 序列登录号 同源性 (%) 菌株所属Bacillus subtilis strain B432 DQ523502.1 1449/1451 (99.86%) 枯草芽孢杆菌

Bacillus subtilisStrain B-FS01 DQ520955.1 1449/1451 (99.86%) 枯草芽孢杆菌

Bacillus subtilis Strain MO4 AY553097.1 1449/1451 (99.86%) 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Strain CICC100

48 AY881643.1 1452/1455 (99.79%) 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Strain YJ001 DQ444283.1 1448/1451 (99.79%) 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Strain BFAS AY775778.1 1448/1451 (99.79%) 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Strain AU53 EF032683.1 1447/1451 (99.72%) 枯草芽孢杆菌

Bacillus subtilis Strain Tg AB195282.1 1447/1451 (99.72%) 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Strain B-1 AB213262.1 1448/1451 (99.72%) 枯草芽孢杆菌

Bacillus sp Strain SS9 AB017590.1 1447/1451 (99.72%) 芽孢杆菌Bacillus subtilis Strain BOH2 AY920508.1 1448/1451 (99.79%) 枯草芽孢杆菌

Bacillus subtilis Strain CICC10025 AY881635.1 1450/1455 (99.66%) 枯草芽孢杆菌

Bacillus subtilis Strain MA139 DQ415893.2 1447/1451 (99.72%) 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Strain MO5 AY553098.1 1447/1451 (99.72%) 枯草芽孢杆菌

菌株 Snb2 16S rDNA 序列比对的部分结果

菌株 序列登录号 同源性 (%) 菌株所属Sinorhizobium fredii strain LMG 8317 X77123.2 1417/1421 (99.71%) 费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii strain LMG 6216 AM181749.1 1417/1421 (99.71%) 费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii strain LMG 6218 AM181740.1 1417/1421 (99.71%) 费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii strain USDA205 AY260149.1 1417/1421 (99.71%) 费氏中华根瘤菌

Sinorhizobium fredii strain HH103 AY260145.1 1417/1421 (99.71%) 费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii strain HH003 AY260144.1 1417/1421 (99.71%) 费氏中华根瘤菌

Sinorhizobium fredii strain LMG 6217 X67231.1 1417/1421 (99.71%) 费氏中华根瘤菌Sinorhizobium sp. 15C-4 AF268072.1 1417/1421 (99.71%) 中华根瘤菌

Sinorhizobium fredii AB195268.1 1415/1419 (99.57%) 费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii strain USDA257 AY260150.1 1416/1421 (99.65%) 费氏中华根瘤菌

Sinorhizobium fredii strain SjzZ4 DQ786804.1 1415/1421 (99.57%) 费氏中华根瘤菌Sinorhizobium frediistrain: ATCC 35423 D14516.1 1412/1421 (99.36%) 费氏中华根瘤菌

Sinorhizobium fredii strain SjzE4 DQ786803.1 1412/1421 (99.36%) 费氏中华根瘤菌

菌株 L396 16S rDNA 序列比对的部分结果

菌株 Snb2 为枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）； 菌株 L396 为费氏中华根瘤菌（ Sinorhizobium fredii ）。

标记抗生素的筛选

链霉素 青霉素 氨卞青霉素

新霉素庆大霉素 青霉素

庆大霉素 红霉素 卡那霉素 氨卞青霉素

氯霉素新霉素链霉素卡那霉素

氯霉素

红霉素

两出发菌株对八种抗生素的敏感性测定 A.L396 B.Snb2

BA

10010010010010010060．26010010010010094．558．738．15510010010094．169．430．620．250

致死率（％）18015012090756045

处理时间（min）温度（℃）

菌株 L396 原生质体热灭活温度、处理时间与致死率间的关系

L396 原生质体热灭活

020406080

100120140mi n时间（ ）

t i me

0. 5 0. 8 1. 2 1. 5 2 2. 5 3mg/ mL溶菌酶浓度（ ）

concent rat i on of l ysoenzyme

Snb2L396

溶菌酶浓度对出发菌株原生质体形成的影响 L396 ： 1.5mg/mL ；Snb2 ： 2.0mg/mL ；

020406080

100120140160mi n时间（ ）

t i me

25 30 32 35 37 40 45℃温度（ ）

temperature

Snb2L396

酶解温度对出发菌株原生质体形成的影响

01020304050607080

mi n时间（ ）t i me

对数生长前期 对数生长中期 对数生长后期 静止期

菌体生长期per i od of thal l i

Snb2L396

菌龄对出发菌株原生质体形成的影响

L396 的形成率为 57.17 ％；Snb2 的形成率为 43.53 ％；

原生质体的释放过程

菌株 Snb2 原生质体释放过程的观察

菌株 L396 原生质体释放过程的观察

菌株 再生培养基一 再生培养基二 再生培养基三 HCNB 再生培养基四 YMA高渗培养基L396 64.0％ 70.0％ 51.5％ 92.5％ 48.5％ 72.5％Snb2 43.0％ 32.0％ 52.0％ 66.0％ 41.5％ 29.0％

出发菌株在不同种类再生培养基上的再生率

菌株 L396

菌株 Snb2

出发菌株原生质体在 HCNB 上的再生菌落

获得 398 个菌株，经过 6 次转代培养，最终有 49 个融合子能够保持稳定的生长；

Snb2Snb2

出发菌株与部分融合子的菌落形态差异

Snb2

L396

Rh3 Rh5

Rh25Rh4

菌株编号 菌体形态 菌体大小（ µm）L396 长椭圆形 3.46±1.24（ 1.75～ 5.35）×1.56±0.38（ 1.1～ 1.95）RH2 短杆状 1.54±0.36（ 1.01～ 2.27）×0.77±0.18（ 0.50～ 1.14）RH3 短杆状 1.59±0.27（ 0.82～ 2.07）×0.83±0.11（ 0.56～ 1.24）RH5 短椭圆形 3.12±0.75（ 1.79～ 5.23）×1.16±0.23（ 0.79～ 1.69）RH6 短杆状 1.50±0.24（ 1.10～ 1.93）×0.42±0.05（ 0.30～ 0.51）RH10 短杆状 1.42±0.31（ 1.06～ 1.97）×0.71±0.15（ 0.53～ 0.98）RH17 短杆状 2.01±0.43（ 1.55～ 2.18）×0.98±0.32（ 0.56～ 1.75）RH13 短杆状 1.38±0.23（ 1.05～ 1.74）×0.57±0.06（ 0.27～ 0.78）RH21 短杆状 1.52±0.22（ 1.21～ 2.01）×0.57±0.38（ 0.45～ 0.75）RH26 短椭圆形 2.94±0.74（ 2.28～ 5.59）×1.73±0.36（ 1.08～ 2.28）RH42 短椭圆形 3.03±0.59（ 1.23～ 3.34）×1.11±0.56（ 0.57～ 1.55）Snb2 短杆状 1.32±0.68（ 1.25～ 2.5）×0.65±0.25（ 0.50～ 0.90）

部分融合子菌体形态及菌体大小比较

部分融合子亚甲蓝染色和革兰氏染色

RH1

RH26 RH4

RH32

RH5

RH2 RH3 RH5

RH26 RH34 RH43

部分融合子对茄腐镰刀菌的拮抗作用测定

部分融合子对尖孢镰刀菌的拮抗作用测定

RH2 RH3 RH5

RH26 RH34 RH43

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

rh1

rh2

rh3

rh4

rh5

rh6

rh7

rh8

rh9

rh10

rh11

rh12

rh13

rh14

rh15

rh16

rh17

rh18

rh19

rh20

rh21

rh22

rh23

rh24

rh25

rh26

rh27

融合子编号number of f usants

校正死亡率

corr

ect

mort

alit

y

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

number of f usants融合子编号

校正死亡率

corr

ect

mort

alit

y

融合子处理96h

对线虫J2

的毒杀效

果

融合子结瘤能力测定

RH3 、 RH5 、 RH20 、 RH23 、 RH26 、

RH31 、 RH36 、 RH41 、 RH47。

对照孢子萌发

处理孢子萌发

0

20

40

60

80

100

稀释倍数

萌发率（％）

AaAa

ABa

BCb CDb

DcEc

FdFe

Gf Gf

RH5 发酵滤液对茄腐镰刀菌孢子萌发的影响

A B

FE

C

D

融合子 RH5 发酵液处理对茄腐镰刀菌菌丝体的影响A. 对照菌丝 B. 菌丝体中原生质体凝聚 C,D. 菌丝体变形 EF. 菌丝体溶解

CK 106 108 1010 1012

RH5 不同浓度菌悬液的促生效果

结果与分析

处理Treatment辽宁Liaoning 黑龙江Heilongjiang

平均单株胞囊数 胞囊抑制率 % 平均单株胞囊数 胞囊抑制率 %CK 30.0 -- 27.5 --

Nemab127 5.0 83.3 17.4 36.7Nemab176 6.6 78.0 13.0 52.7Nemab184 13.0 56.7 13.8 49.8Nemab246 7.0 76.7 6.0 78.2Nemab293 1.2 96.0 3.0 89.1Nemab306 8.4 72.0 2.9 89.5Nemab307 2.0 93.3 11.1 59.6Nemab309 4.0 86.7 3.9 85.8Nemab311 1.5 98.3 11.8 57.1Nemab320 6.6 78.0 5.2 81.1Nemab323 0.8 97.3 4.5 83.6Nemab342 3.6 88.0 9.3 66.2Nemab400 6.2 79.3 0.8 97.1Nemab402 0.8 97.3 16.0 41.8

采用不同细菌菌株包衣处理大豆种子对大豆根系胞囊形成的影响

结论：1. 可以利用细菌控制大豆胞囊线虫病和真菌引起的根腐病 ;2. 利用拮抗根瘤菌控制大豆胞囊线虫病和真菌引起的根腐病是一个更好的方法 ; 3. 利用芽孢杆菌和拮抗根瘤菌原生质体融合技术可以提高根瘤菌的拮抗作用 ,同时融合子对大豆幼苗的生长促进作用明显。

致谢王媛媛 博士陈立杰 博士朱晓峰 博士研究生王 雪 博士研究生李进荣 硕士秦 博 硕士

谢 谢 !

预祝大会圆满成功 !