学生： 戴云霞学生： 戴云霞

导师导师 : : 王忠王忠 教授教授

无选择标记的转反义无选择标记的转反义 WxWx 基因基因

稻米品质的研究稻米品质的研究

稻米品质主要由碾磨品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质等组成。其中蒸煮食味品质的优劣是消费者最为关心的指标。

稻米食用品质的优劣在很大程度上与稻米胚乳中淀粉淀粉的组成，即直链淀粉和支链淀粉的相对含量有关。

水稻胚乳中直链淀粉的合成是由水稻蜡质(Wx) 基因编码的淀粉粒结合淀粉合成酶（ GBSS）控制的。

反义 RNA技术作为一种调控特定基因表达的手段已被广泛应用。本实验室在利用反义 RNA技术以调控胚乳中直链淀粉的含量的研究方面已获得了较大的成功。

反义反义 RNARNA 技术：技术：　　　 是基于在细胞内引入一种能和靶基因mRNA 序列（或

部分序列）互补的RNA ，从而阻断由 DNA 经过 RNA 到蛋白质的信息流： mRNA 和反义 RNA 之间形成复合物，然后这种复合物或者被迅速降解，或者在核内加工过程中被破坏，或者阻碍mRNA 的翻译，从而发挥调节基因表达水平的作用。

据此，可利用反义RNA 技术来人为地下调某个基因的表达。

随着转基因作物商品化生产的加快，也呈现出越来越多潜在的问题。

选择标记基因在用于辅助筛选转目标基因植物的过程中起到了很大的作用。但当筛选到转基因植株后，选择标记基因的存在在一定程度上又是多余的，甚至是有害的。

问题： 可能会影响目的基因的稳定性 加重植物细胞代谢的负担

用于筛选的抗性选择标记一般都是一些抗生素抗性标记，含这些标记的转基因植物进入商品化生产应用后 :

重要的是

是否会对人畜产生潜在的危害

是否会被病原菌所摄取而造成更为严重的潜在后果等等

因此，在获得转目标基因的植物后，从转基因植

物中剔除有潜在问题的抗性选择标记基因，以培

育安全实用的转基因作物一直是科研人员努力的

目标 .

目前，已发展了多种技术用于培育无抗性选择标

记的转基因植物。

培育无选择标记的转基因植株的方

法 共转化法

位点特异性重组法

转座子介导法

多自动转化（ MAT ）系统法

一步转化法

共转化法共转化法：：

指把目的基因和选择标记基因分别构建进不

同的载体或同一载体的不同功能区段，期望借

助于基因枪或农杆菌介导等转化方法将选择标

记基因和目的基因同时导入同一

受体细胞。

农杆菌介导法 PEG介导法

基因枪法

电激介导法

共 转 化 法

双质粒/

双菌

株载体

双质粒/

双菌

株载体

双质粒/双菌

株载体

本实验是利用农杆菌介导的共转化法。使

用的是超双元载体超双元载体 pYH592pYH592

本研究的主要目的是，利用已获得的无抗

性选择标记的转反义 Wx基因水稻为材料，分析

其在品质性状上的变化。

图１：超双元载体 pYH592及其 T-DNA区的结构

龙特甫 B，及来源于龙特甫 B 的转反义 Wx基因水稻

实验材料：

粳 9983 ，及来源于粳 9983 的转反义 Wx基因水稻。

１．材料与方法

反应条件为： 预 变 性 ： 94℃ ， 3 min； 变性： 94℃, 50sec； 复性： 55℃,50 sec； 延伸： 72℃,50 sec； 30个循环； 最 后 延 伸 ：72℃， 10min

用于 PCR扩增的 5’和 3’端引物分别为： W4P3 （ 5’-CCA AGA AAC TGC TCC TTA AG -3’） W4P4 （ 5’-GAT GAA ATC GAA GGA TGA CC-3’）

PCR产物分子量为 698bp。

经 PCR鉴定，待种子成熟后，从每一单株

收获 50粒左右成熟种子，制成精米。一部分用

于测定糊化温度，其余混合磨成精米粉，用于测

定直链淀粉含量和胶稠度。

直链淀粉含量测定直链淀粉含量测定：： 称 50mg 干精米粉于 50ml试管

沸水浴20min

定容

吸 5ml 于以盛有 20ml 蒸馏水的 100ml 容量瓶

定容，静置 15min

620nm 测其光密度值

加 0.5ml 无水乙醇，轻轻摇匀加 4.5ml 1.0mol/L 的 NaOH 溶液，混匀

冷却至室温

加 1.0ml 1.0mol/L 乙酸溶液加 1.5ml 0.02% 的碘液

胶稠度的测定： 称 50mg 干精米粉于 15ml 试管

沸水浴8min

冰水浴 20min

室温下，将试管平放于平台 1h

室温冷却5min

测米胶的长度

加 0.2ml 百里酚蓝指示剂，震荡器震荡加 2.0ml 0.2mol/LKOH 溶液，震荡器震荡

糊化温度的测定：

取6

粒整精米于方

盒中

加盖30

℃保温2

3h 观察米粒胚乳分解

情况，分级记录

根据碱消值公

式

求出糊化温度

加 10ml

KOH 溶液

碱消值=∑ （ G·N ） /6

G ：每粒米的级别 N ：同一级的米粒数

籼稻： 1.7%粳稻： 1.4%

M P W 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67

图２：粳 9983 和部分龙特甫 B 来源的 T2 代株系的反义 Wx基因的纯合情况

注：图为 PCR扩增反义 Wx基因M.100bp DNA ladder plus ; P.质粒为 pYH592； W.未转化对照 ; 1-67均为 T2 代的转基因单株，其中 1-10 来源于 B4030-4 ； 11-20来源于 B4011-

14 ； 21-30来源于 B4011-20 ； 31-40来源于 B4032-12 ； 41-50来源于B4032-19； 51-60来源于 B4034-12； 61-67来源于 B4048-13

2.1 T2 代转基因植株的 PCR分析

2 、结果与分析

表１：部分超双元载体共转化水稻植株 T3 代成熟种子的品质分析

转基因植株编号T3 代成熟种子品质分析

直链淀粉含量（ % ） 胶稠度 (mm) 糊化温度 ( 碱消值 )

未转化粳 9983

B4011-12

B4011-14

B4011-20

未转化龙特甫 B

B4030-4

B4030-18

B4031-3

B4031-20

B4032-19

B4032-12

B4034-12

B4047-15

B4048-13

18.34 54.5 6.17

13.18 NT NT

15.98 NT 6.00

15.34 65.5 6.00

23.35 28.5 6.67

3.46 NT 3.83

7.88 86.0 4.75

6.94 NT NT

6.33 80.5 5.33

2.81 111.5 4.00

3 .65 NT 4.00

4.76 124.0 4.00

9.28 104.5 4.75

9.56 NT 5.33

注： NT 表示为未测定

2.2 共转化水稻植株 T3 代成熟种子的品质分析

图３：部分龙特甫 B 来源的转反义 Wx基因水稻中 T3 代成熟种子的蜡质

情况

注： a 图为未转化受体龙特甫 B; b 图为 B4048-13 ，反义 Wx 基因未纯合；c 为 B4030-4，反义 Wx基因已纯合。

从本试验结果可以看出，在这两个去除潮霉素

基因的转反义 Wx 基因的转化子的后代植株中，当

用反义 Wx 基因转化籼型杂交稻亲本龙特甫 B时，

其 T3 代部分种子胚乳中的直链淀粉含量有了大幅度

下降；而对于粳稻品种粳 9983，其 T3 代部分种子

胚乳中的直链淀粉含量下降幅度不大。

33 、讨论、讨论

这一现象与刘巧泉等（ 1998）的研究结果：导入反义 Wx 基因的籼稻品种直链淀粉含量下降幅度较小，而导入反义 Wx 基因的粳稻品种直链淀粉含量下降幅度较大有些差异。分析其原因，可能是由于转化所用基因的构建不同，或由于目的基因在基因组中整合的位置和拷贝数等不同造成的，但因本实验中所分析的去标记的转化子仅有两个，所以这种现象是否普遍存在，仍需以后的进一步研究。