第一章 基因操作的主要技术原理

第二节 凝胶电泳

凝胶电泳是一种分析鉴定重组 DNA

分子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。

1 凝胶电泳

凝胶包含复杂的孔道网络， DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。

小的 DNA分子，在凝胶中迁移的更快。

按凝胶材料分 :

聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳 ( 普通和低熔点琼脂糖 )

按电泳装置分 :

水平式 / 琼脂糖凝胶 竖式 / 聚丙烯酰胺凝胶两种方法比较：分离效果和分离范围 ; 操作难易

凝胶电泳的种类

基本原理带有负电荷的 DNA或 RNA核苷酸链，依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，

在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，

可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。

2 核酸电泳

凝胶的成分和浓度决定能够分离的 DNA大小琼脂糖凝胶： 相对大的孔道，分离大一些的分子；聚丙烯酰胺凝胶： 很小的孔道，分离小的 DNA分子， 能够分离仅仅相差一个核苷酸的 DNA分子。

用途

琼脂糖凝胶： 用于 DNA 和 RNA的常规分析聚丙烯酰胺凝胶： 常用于小分子核酸和蛋白质分析凝胶电泳的一般程序 制胶，点样，电泳，染色，观察

取决于核酸分子本身的大小和构型

分子量较小的 DNA分子，比分子量较大的 DNA

分子迁移率要快；

同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环 DNA分子或线性 DNA分子迁移率要快。

电泳的迁移率

与凝胶的类型和密度相关

琼脂糖凝胶的分辨力在 0.2～ 50Kb之间 ;

聚丙烯酰胺的分辨力在 1 ～ 1000bp之间；

凝胶电泳的分辨力

Separation Range of Agarose

PolyAcrylamide Gels (PAGE)

琼脂糖：

一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。

分为

常熔点的琼脂糖

低熔点（ LMP）琼脂糖

2 琼脂糖凝胶电泳

Agarose gel electrophoresis

LMP琼脂糖 熔点： 62～ 65℃ 熔解后，在 37 ℃ 可保持液态数小时； 在 25 ℃ 可保持液态约 10min

回收 DNA分子 在 65 ℃ 下将 LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提 DNA； 离心获得含 DNA分子的上清液；

琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液： 1× TAE（ TBE, TPE） 凝胶的含量：根据检测的 DNA大小 加 DNA样品： <1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间， 小片段高电压短时间

使凝胶中的 DNA分子可视化

染色是最简单的方法。溴乙锭 (EtBr) 能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的 DNA进行染色。只要在足够的 DNA存在条件下，经过 EtBr染色后，在紫外照射下能以不同的条带显示出来。注意： 溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会灼伤。因此，用于把 DNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照射就能看见 DNA的非致癌染料，越来越多地被用于实验室研究中。

染色和观察： 溴化乙锭（ EB）染色， 在 300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪） 能看到 0.05 μg的微量 DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比

DNA 分子大小的估计

如何确定凝胶电泳中片段的大小 ?

最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学关系。相关公式是：

D=a-b (logM)

D 是迁移的距离， M 是相对分子质量， a 和 b 是依赖于电泳条件的常数。

通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计 DNA片段大小的方法。

方法：利用已知大小的 DNA片段作标准 (marker /ladder),目的 DNA片段与之比对、估计。例如： HindⅢ 将 λDNA切成 8 个片段，这些片段的大小都已经知道，范围从 125bp到 23kb。实验中的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位置而加以估计。尽管不十分精确，这种方法进行起来只有 5 ％的错误率

Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8% Agarose

1

2

4

681012kb

Agarose Gel Electrophoresis

EtBr Detection Limit: ~5-10 ng DNA

根据标准 DNA 相对迁移距离推测待测定的 DNA 片段的大小

Agarose gel electrophoresis

对放射性标记的 DNA进行放射性自显影

染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中 DNA的含量少于 10ng，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的 DNA就需要更加灵敏的检测手段。放射自显影是一个很好的方法。 电泳前将 DNA结合上放射性标记，利用 X 射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。放射性 DNA使胶片曝光，显示出 DNA条带。

聚丙烯酰胺凝胶： 丙稀酰胺 / 亚甲双丙稀酰胺（ 29 ：1 ）

TEMED 过硫酸铵（ 10％）缓冲液： TBE

3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

链分离凝胶 -SSCP

用于单链分离 , 可以进行 SNP的检测。PAGE原理：SNP: DNA长度相同，仅一个碱基不同；

加热后解链后电泳，迁移速度不同。

可以分离 1bp的差异用途：测序、 AFLP、为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）

核酸测序凝胶

传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的， DNA分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNA分子在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而被分离开。

只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越小。

实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于50kb的 DNA分子。

4 通过凝胶电泳分离染色体

1984 年， D.R.Cantor 发明的，分离超大分子量的DNA 分子。

在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成 45 ℃ 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成 45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA 分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。

脉冲电场凝胶电泳（ PFGE）

脉冲场凝胶电泳原理图

北

南 脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀 ; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀， 定时改变电场方向， DNA 分子的净 DNA 移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈 45o ，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备 DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样品增加， 制备 DNA 样品与常规方法不同

脉冲场凝胶电泳 PFGE工作假说1)    DNA松弛时间：大分子 DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与 DNA分子量呈正相关（ Tr）2)    DNA移动时间： DNA分子向前移动的时间（ Tm）3)    电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（ Tp）

与分子量小的 DNA分子相比，分子量大的 DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量 DNA分子的目的。

可以分离几千 kb的 DNA分子。这个长度范围包含许多真核生物染色体分子，包括酵母、许多重要的丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。因此，能够得到这些生物体染色体的凝胶图谱。

PFGE can resolve large DNA fragments

染色体 DNA电泳的用途 1. 测定染色体数目：特别适合于低等真核生物 2.  测定基因连锁关系：结合 DNA 杂交技术，可适合各种生

物 3.   染色体 DNA 重排分析 1 ）酵母细胞经 X- 射线照射，染色体发生断裂，可得弥散

型。 但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化 2 ）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4.  疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物 Leishmania, 具有其特征性的染

色体。 PFG 便可用于诊断。

方法：不同的 RNA电泳方法是依据使 RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使 RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。

1.  乙二醛 / 二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，

特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生。

步骤： RNA+10mM羟甲基醛和 50% DMSO混合 50℃ 、 1 h变性 点样 电泳 染色 观察

5 RNA凝胶电泳

2. 羟甲基汞法原理：羟甲基汞可与 RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。步骤： RNA+10mM羟甲基醛，点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上，电泳，染色观察

3.  甲醛法步骤： RNA+2.2M甲醛 +50%甲胺，点样在含 2.2M甲醛琼脂糖凝胶上， MOPS缓冲液电泳，染色观察其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于 RNA电泳 . 4.  三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的 RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收 RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。

6 蛋白质电泳

方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为 SDS-PAGE。差别：有无变性剂

用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）

SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。 mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。

用于 DNA 、 RNA 以及蛋白质的回收方法 1)  电洗脱法 : 利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子洗脱

到其它介质中； 2) 滤纸法 —核酸凝胶染色，长波紫外光确定位置，在分离

带前方切一口子并插入滤纸条 ( 其背面覆盖透析袋膜 ) ，电泳至 DNA 带全部进入滤纸条，洗脱 DNA ，纯化、沉淀

7 电泳片段的分离与回收

3) 透析袋法—切下含 DNA带琼脂块，放入透析袋，封口，放入电泳槽，电泳 2-3 小时至全部 DNA离开凝胶块，反向电泳 1 分钟，取出 DNA液，纯化、沉淀。

4) 冻融法

待回收 DNA 切口

DNA 切口

凝胶块 滤纸法

透析袋 凝胶块

待回收 DNA

透析袋法 待回收 DNA

凝胶块 V- 型槽

电洗脱槽法

回收 DNA方法

影响回收率的因素 1 ） DNA分子大小—回收率与分子量大小呈负相关； 2 ）乙醇沉淀—其中温度、时间和 DNA浓度（回收

时体积）均与回收率有关； 3 ）离心时间—时间越长，效果越好，对低浓度 DNA尤其明显。