第十五章生物技术应用

Shenyang Agricultural University制作人：吕香玲

第十五章生物技术应用第一节细胞和组织培养第二节植物原生质体培养和体细胞杂交

第三节重组 DNA技术（基因工程）

第四节分子标记辅助选择技术

第五节分子设计育种


通过本章学习，了解生物技术在作物育种中的意义及重要作用，生物技术的领域，

在育种中应用的基本方法和育种程序。

本章教学目标


二离体培养技术在植物育种中的应用二离体培养技术在植物育种中的应用

一体细胞变异体和突变体的筛选一体细胞变异体和突变体的筛选

三细胞和组织培养技术的其他利用途径三细胞和组织培养技术的其他利用途径

第一节细胞和组织培养的应用

植物组织培养介绍植物组织培养介绍


组织培养组织培养（（ tissue culturetissue culture，， in vitroin vitro cultureculture）指把植物的个别组织或细胞放在培）指把植物的个别组织或细胞放在培养基上，人工诱导其形成植株的方法和技养基上，人工诱导其形成植株的方法和技术。是一种植物无菌培养技术。包括：术。是一种植物无菌培养技术。包括：•胚胎培养胚胎培养•器官培养器官培养•愈伤组织培养愈伤组织培养•液体培养（悬浮培养）液体培养（悬浮培养）

植物组织培养


植物组织培养的选材：植物组织培养的选材：1.1. 体细胞如根、茎、叶的分生组织；体细胞如根、茎、叶的分生组织；2.2. 生殖细胞如花粉生殖细胞如花粉


植物组织培养植物组织培养


2. 2. 通过组织培养获得变通过组织培养获得变

异体或突变体的方法异体或突变体的方法

1. 1. 基本概念基本概念

3. 3. 体细胞无性系选择工体细胞无性系选择工

作中的几个问题作中的几个问题

一体细胞变异体和突变体


1. 基本概念

植物体细胞在离体条件下，会发生各种遗传和不遗传的植物体细胞在离体条件下，会发生各种遗传和不遗传的变异。变异。

无性系变异（无性系变异（ somaclonal variationsomaclonal variation）：）：指植物体细胞在指植物体细胞在离体条件下所发生的各种变异。离体条件下所发生的各种变异。

变异体（变异体（ varientvarient）：）：指不加任何选择压力而筛选出的变指不加任何选择压力而筛选出的变异个体；异个体；

突变体（突变体（ mutantmutant）：）：指经过施加某种选择压力所筛选指经过施加某种选择压力所筛选出的无性系变异；培养基中的毒素、盐分等出的无性系变异；培养基中的毒素、盐分等


无性系变异的筛选与个体水平上的诱变育种相比，有以下优点：

1.变异频率高，稳定快；2.变异的筛选可以在实验室内有控制地进行，节省人力和物力；

3.选择效率高。成功的例子：耐盐碱的烟草，耐低温的水

……稻；花培品种很多


2. 组织培养获得变异体或突变体的方法

（（ 11）） . . 组织培养之前组织培养之前的变异及其选的变异及其选择择：：体细胞变异体细胞变异 ------分离分离 ------组培组培 ------再生再生为植株。为植株。以烟草抗除草剂的变异体筛选为例，说以烟草抗除草剂的变异体筛选为例，说明其选择过程：明其选择过程：

如何通过组培获得突变体：组培前，组培中，组培后


烟草花药愈伤组织烟草花药愈伤组织

单倍体植株单倍体植株

大部分变黄，少大部分变黄，少量组织保持绿色量组织保持绿色

再生植株再生植株

纯合二倍体纯合二倍体抗除草剂材料抗除草剂材料

灭草松、甲二威灵，便于选灭草松、甲二威灵，便于选择择

rr射线照射，诱导其变异；除射线照射，诱导其变异；除草剂处理幼叶草剂处理幼叶 ,,观察其反应观察其反应

取绿色组织培养，诱导再取绿色组织培养，诱导再生生

染色体加倍染色体加倍


对对 1515株抗灭草松的突变体中的株抗灭草松的突变体中的 88株进行遗株进行遗传鉴定，它们与敏感型植株杂交的传鉴定，它们与敏感型植株杂交的 F1F1都是都是敏感型的，说明抗性是一个隐性性状。进一敏感型的，说明抗性是一个隐性性状。进一步分析证明，这步分析证明，这 88个抗性植株中包含有个抗性植株中包含有 44个个不同的抗性基因，不同的抗性基因， F2F2的分离方式有两种，的分离方式有两种，

一种是一种是 33（敏感）：（敏感）： 11（抗）；（抗）；

另一种是另一种是 1515（敏感）：（敏感）： 11（抗）；（抗）；

表明后一种植株中有两个基因发生了突变。表明后一种植株中有两个基因发生了突变。

2. 2. 组织培养获得变异体或突变体的方法组织培养获得变异体或突变体的方法


（（ 22））组织培养期间组织培养期间的变异及其选择：指在的变异及其选择：指在组培过程中对培养物（愈伤组织）施加某种组培过程中对培养物（愈伤组织）施加某种处理，使之发生变异后再进行选择。这种方处理，使之发生变异后再进行选择。这种方法往往能收到比较好的效果。法往往能收到比较好的效果。



玉米抗小斑病的玉米抗小斑病的 TT小种突变体的筛选过程：小种突变体的筛选过程：Gengenbach,B.G.Gengenbach,B.G.（（ 19751975）用玉米小斑病的）用玉米小斑病的 TT小小种毒素在感病的玉米培养物中进行筛选，经过愈种毒素在感病的玉米培养物中进行筛选，经过愈伤组织培养以及毒素的继代培养，最后获得了抗伤组织培养以及毒素的继代培养，最后获得了抗性愈伤组织并诱导出再生植株。性愈伤组织并诱导出再生植株。过程：感小斑病的幼培过程：感小斑病的幼培 --------愈伤组织愈伤组织 --------加毒素加毒素 --------抗性愈伤组织抗性愈伤组织 --------再生植株再生植株 --------抗小斑病抗小斑病



经过 4个周期选择之后

经过 5~15个周期选择

感病 9 0

抗病 0 167

可育 0 97

不可育 0 70

总数 9 167

玉米抗小斑病玉米抗小斑病 TT小种的筛选结果小种的筛选结果（（ Gengenbach,B.G,1975Gengenbach,B.G,1975 ））


（（ 33））组织培养后组织培养后的选择和鉴定：指对组培后的的选择和鉴定：指对组培后的植株的一些变异进行选择、利用的方法。植株的一些变异进行选择、利用的方法。原理：诱变剂的继续作用原理：诱变剂的继续作用主要是形态性状，如株型、叶色等；主要是形态性状，如株型、叶色等；这种选择方式中所用的培养基一般不包含特定的这种选择方式中所用的培养基一般不包含特定的选择因素，但往往包含诱变剂，由此产生的变选择因素，但往往包含诱变剂，由此产生的变异植株可能出现某种有益的变异，将再生植株异植株可能出现某种有益的变异，将再生植株种在田间或温室内进行选择。这种选择多局限种在田间或温室内进行选择。这种选择多局限于形态性状，如株型、叶色以及其他可见的性于形态性状，如株型、叶色以及其他可见的性状。状。



3. 体细胞无性系选择中应注意的问题

（（ 11）选择目标的确定）选择目标的确定（选择前的准备工（选择前的准备工作）作）：：主要考虑三个因素：主要考虑三个因素： ① ① 性状的意义，性状的意义，如抗逆性，品质等如抗逆性，品质等；； ② ② 目标性状基因的数目；目标性状基因的数目；单基因易于识单基因易于识别；多基因难识别；别；多基因难识别；

③ ③ 考虑该性状的显隐性；考虑该性状的显隐性；显性的当代表现，显性的当代表现，

隐性的下代表现隐性的下代表现


（（ 22）外植体的选择：）外植体的选择：外植体（外植体（ explantexplant））是指用来进行培养的植物体某一部分组织的是指用来进行培养的植物体某一部分组织的统称。选择外植体要考虑：统称。选择外植体要考虑： ① ① 基因型基因型；；选易于组培的品种选易于组培的品种

② ② 植物的合适植物的合适部位部位；；分生组织分生组织

③ ③ 考虑它的合适考虑它的合适年龄年龄；；玉米幼胚玉米幼胚 1010～～ 1111 天天

3. 体细胞无性系选择的问题


（（ 33）培养系统的选择：）培养系统的选择：• 器官发生系统器官发生系统 ----再生植株由愈伤组织直再生植株由愈伤组织直接分化而成）；接分化而成）；

• 胚胎发生系统胚胎发生系统 ------外植体首先形成愈伤组外植体首先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出来类似于种子织，再由愈伤组织分化出来类似于种子胚的胚状体（胚的胚状体（ embryoidembryoid），胚状体进），胚状体进一步发育成熟而形成完整植株一步发育成熟而形成完整植株

3. 3. 体细胞无性系选择的问题体细胞无性系选择的问题


（（ 44）无性系变异的选择：）无性系变异的选择：无性系变无性系变异通常在愈伤组织阶段就有所表现，异通常在愈伤组织阶段就有所表现，但是它在再生植株中却有可能不再出但是它在再生植株中却有可能不再出现，而且并非出现在植株上的变异都现，而且并非出现在植株上的变异都能遗传，因此必须选择到目标性状稳能遗传，因此必须选择到目标性状稳定才算成功。定才算成功。



通常具有目标性状的无性系变异植株往往通常具有目标性状的无性系变异植株往往同时具有并发的其他不良的变异。解决这类同时具有并发的其他不良的变异。解决这类问题的办法有二：问题的办法有二：

一是在大量无性系中筛选具有尽可能少的一是在大量无性系中筛选具有尽可能少的并发变异的个体；并发变异的个体；

其次是选用两个都具有目标性状的无性系其次是选用两个都具有目标性状的无性系杂交，从他们的后代中筛选没有不良变异的杂交，从他们的后代中筛选没有不良变异的重组体。重组体。



二离体培养技术的应用

（（ 22）离体胚的培养在育种中的应）离体胚的培养在育种中的应用用

（（ 11）胚珠或子房培养与试管受精）胚珠或子房培养与试管受精


（ 1）胚珠或子房培养及试管受精

克服远缘杂交不亲和性的有效方法克服远缘杂交不亲和性的有效方法，， 19671967年年Zenkteler Zenkteler 采用试管受精法，克服了石竹科内采用试管受精法，克服了石竹科内远缘杂交的不亲和性。他在异株女蒌菜和红远缘杂交的不亲和性。他在异株女蒌菜和红色女蒌菜的种间杂交中和异株女蒌菜的属间色女蒌菜的种间杂交中和异株女蒌菜的属间杂交中，采用离体培养子房、人工授精的方杂交中，采用离体培养子房、人工授精的方式，使受精过程正常进行，并发育成良好的式，使受精过程正常进行，并发育成良好的胚，取出胚进行离体培养，获得了开花的胚，取出胚进行离体培养，获得了开花的 F1F1株。株。


（ 2）离体胚的培养的应用

1. 1. 使远缘杂种的胚发育成植株：使远缘杂种的胚发育成植株：19251925年年 LaibachLaibach首先在亚麻属的中间杂种首先在亚麻属的中间杂种中采用了这一方法，中采用了这一方法，19911991年李浚明等用普通小麦品种农大年李浚明等用普通小麦品种农大 146146作母本，簇毛麦作父本，经有性杂交和杂作母本，簇毛麦作父本，经有性杂交和杂种未成熟胚培养，成功地获得了杂种植种未成熟胚培养，成功地获得了杂种植株；株；


（ 2）离体胚的培养的应用

2. 2. 促进核果类植物胚的后熟作用：促进核果类植物胚的后熟作用：早熟品早熟品种与晚熟品种杂交，很难得到杂交后代种与晚熟品种杂交，很难得到杂交后代 ..用幼胚离体培养就能得到杂交后代，因此用幼胚离体培养就能得到杂交后代，因此在核果类早熟性育种中常采用这种方法；在核果类早熟性育种中常采用这种方法；

3. 3. 打破种子的休眠期；打破种子的休眠期；用离体胚培养法，用离体胚培养法，几天就可长成幼苗，大大缩短了育种年几天就可长成幼苗，大大缩短了育种年限。限。


三细胞和组织培养的其他用途

（（ 22 ）种质保存）种质保存

（（ 11）快速繁殖）快速繁殖

（（ 33 ）产生无病毒植物材料）产生无病毒植物材料


（ 1）快速繁殖

通过分生组织的培养，可以快速繁殖有经济通过分生组织的培养，可以快速繁殖有经济价值的植物，如花卉、药材等，有些植物应价值的植物，如花卉、药材等，有些植物应用次法，一年可以产生用次法，一年可以产生 101066~10~1077个植株。个植株。如广西用此法繁殖甘蔗苗比常规法效率高如广西用此法繁殖甘蔗苗比常规法效率高10001000倍以上。由此法产生的植株一般都整倍以上。由此法产生的植株一般都整齐一致，尤其是对特别宝贵的基因型，用此齐一致，尤其是对特别宝贵的基因型，用此法扩繁更有意义。法扩繁更有意义。方法有方法有愈伤组织培养和和丛芽培养丛芽培养等。等。


（ 2）种质保存

有些植物种质的保存已经正式采用组有些植物种质的保存已经正式采用组培方法，荷兰的所有甜菜种质都是用培方法，荷兰的所有甜菜种质都是用此法保存的，当然这并不意味着不再此法保存的，当然这并不意味着不再应用种子。应用种子。


（ 3）产生无病毒植物材料

通过通过茎尖培养茎尖培养可以淘汰病毒，还可能可以淘汰病毒，还可能淘汰某些细菌，这对于营养繁殖的植淘汰某些细菌，这对于营养繁殖的植物是非常重要的。目前国内很多植物物是非常重要的。目前国内很多植物都是通过这种手段脱毒，由此而得到都是通过这种手段脱毒，由此而得到的后代可以大大提高产量。的后代可以大大提高产量。


（ 4）花药培养

通过花药培养进行单倍体育通过花药培养进行单倍体育种。种。


一原生质体的分离和培养一原生质体的分离和培养

原生质体简介原生质体简介

二原生质体的融合二原生质体的融合

三杂种细胞的鉴别和选择三杂种细胞的鉴别和选择

四诱导杂种细胞产生愈伤组四诱导杂种细胞产生愈伤组

织和再生植株织和再生植株

第二节植物原生质体培养和体细胞杂交


2. 2. 原生质体培养利用途径原生质体培养利用途径

1. 1. 原生质体原生质体

3. 3. 体细胞杂交体细胞杂交

4. 4. 体细胞杂交的特点及其环节体细胞杂交的特点及其环节

基本概念


1. 原生质体

原生质体：原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团的、裸露的、有生活力的原生质团。。就单个细胞而言，除了没有细胞壁就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。外，它具有活细胞的一切特征。


2. 原生质体培养的利用途径

① ① 通过原生质体培养可以通过原生质体培养可以制造单细胞无性制造单细胞无性系系。。② ② 原生质体可以作为原生质体可以作为基因转化的受体基因转化的受体，使，使之接受外源遗传物质（如细胞器、染色体或之接受外源遗传物质（如细胞器、染色体或DNADNA片段等）产生新的变异类型。片段等）产生新的变异类型。③③ 利用原生质体进行许多利用原生质体进行许多基础性研究基础性研究，如，如细胞生理、基因调控、分化和发育等。细胞生理、基因调控、分化和发育等。④④细胞融合细胞融合


3. 体细胞杂交

体细胞杂交（体细胞杂交（ somatic hybridizatioinsomatic hybridizatioin））又称又称原生质融合（原生质融合（ protoplast fussionprotoplast fussion），是指两），是指两个具有完整遗传物质的体细胞之间的融合。个具有完整遗传物质的体细胞之间的融合。结果是合子中包含双亲体细胞中全部的染色结果是合子中包含双亲体细胞中全部的染色体及全部的细胞质。体及全部的细胞质。


体细胞杂交体细胞杂交

AA B B

AB AB

××


4. 体细胞杂交的特点

最大特点是：最大特点是：有可能使有性杂交不亲有可能使有性杂交不亲和的双亲之间杂交成功和的双亲之间杂交成功。。也就是说在体细胞水平上的杂交，其也就是说在体细胞水平上的杂交，其双亲间的亲和性或相容性似乎有所提双亲间的亲和性或相容性似乎有所提高，因而有可能高，因而有可能扩大杂交亲本和植物扩大杂交亲本和植物资源的利用范围资源的利用范围。。


4. 体细胞杂交的环节

主要有：主要有：① ① 原生质体的分离和培养；原生质体的分离和培养；② ② 原生质体间的融合（体细胞杂原生质体间的融合（体细胞杂交）；交）；③ ③ 融合后杂种细胞的鉴定与选择；融合后杂种细胞的鉴定与选择；④ ④ 诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生植株。植株。


1. 1. 一般用愈伤组织或叶肉细胞等一般用愈伤组织或叶肉细胞等分生能力强的细胞分离原生质体。分生能力强的细胞分离原生质体。

一原生质体的分离和培养


2. 2. 改良或选用合适的培养基和培养方法，改良或选用合适的培养基和培养方法，用于培养原生质体的培养基和培养方法很用于培养原生质体的培养基和培养方法很多，其中多，其中 KM8PKM8P及其改良培养基效果较及其改良培养基效果较好，如果采用琼脂糖包埋或琼脂糖珠、看好，如果采用琼脂糖包埋或琼脂糖珠、看护培养、饲养培养等方法能大幅度提高培护培养、饲养培养等方法能大幅度提高培养效果。养效果。



3. 3. 选择适宜的酶制剂，近年来由于使用选择适宜的酶制剂，近年来由于使用了了 Onzuka R-10Onzuka R-10和和 Onzuka RsOnzuka Rs纤维素酶纤维素酶以及以及 PectolyasePectolyase果胶酶，大大提高了禾果胶酶，大大提高了禾谷类植物原生质体的游离效果，又保证谷类植物原生质体的游离效果，又保证了原生质的质量。了原生质的质量。



原生质体分离的示意图原生质体分离的示意图

叶片表面消毒叶片表面消毒

去下表皮去下表皮

叶片小块飘浮叶片小块飘浮在加渗透稳定在加渗透稳定剂的酶液中剂的酶液中

培养培养 18h18h

除去酶液除去酶液离心离心

再悬浮培养以获再悬浮培养以获得合适的植板密得合适的植板密度度

再悬浮培养再悬浮培养

再悬浮于再悬浮于蔗糖洗涤蔗糖洗涤培养基中培养基中离心离心


关键是：关键是：融合剂融合剂的选用，早期用的选用，早期用 0.25 mol/L 0.25 mol/L 的的 NaNONaNO33和高和高 CaCa2+2+作融合剂；后来改用作融合剂；后来改用 PHPH

溶液处理，可大大提高融合率。溶液处理，可大大提高融合率。其特点是：其特点是：处理量大、频率高、不影响再生而处理量大、频率高、不影响再生而又不需昂贵的设备；又不需昂贵的设备；其缺点是：其缺点是：处理时间过长，有时不易掌握，有处理时间过长，有时不易掌握，有时形成多元原生质体融合体。时形成多元原生质体融合体。

二原生质体的融合


近年来又研究出一种近年来又研究出一种电融合电融合技术，先在交技术，先在交流电场下形成原生质体凝聚体，然后用直流电场下形成原生质体凝聚体，然后用直

流电脉冲刺激，使膜发生融合。流电脉冲刺激，使膜发生融合。

二原生质体的融合


在两亲细胞融合试验中，可以产生同源融合体在两亲细胞融合试验中，可以产生同源融合体（（ A×AA×A或或 B×BB×B）、异源（）、异源（ A×BA×B）和非融合体）和非融合体（（ AA或或 BB）。如何选择出异源融合体即杂种细）。如何选择出异源融合体即杂种细胞：胞：

（（ 22）互补选择法）互补选择法（（ 11）用选择性培养基创造条件）用选择性培养基创造条件

（（ 33）异核体机械分离和核型分）异核体机械分离和核型分析析（（ 44）体细胞杂种核胞质杂种鉴定）体细胞杂种核胞质杂种鉴定

三杂种细胞的鉴别和选择


（ 1）用选择性培养基创造条件

用选择性培养基创造专门使杂种细胞才能生用选择性培养基创造专门使杂种细胞才能生长的条件：长的条件：

卡尔逊（卡尔逊（ Carlson, 1972Carlson, 1972）育成的世界上第一）育成的世界上第一个烟草体细胞杂种就是采用这种方法，已知个烟草体细胞杂种就是采用这种方法，已知两亲的原生质体均不能在无外源激素的培养两亲的原生质体均不能在无外源激素的培养基上分裂，而通过有性杂交得到的双二倍体基上分裂，而通过有性杂交得到的双二倍体的原生质体却能在无外源激素的培养基上分的原生质体却能在无外源激素的培养基上分裂并长成愈伤组织裂并长成愈伤组织


（ 2）互补选择法

这种方法是用可察觉的标记性状的互补进行选择，这种方法是用可察觉的标记性状的互补进行选择，常常涉及到某些叶绿体突变和生化突变的利用：常常涉及到某些叶绿体突变和生化突变的利用：如在矮牵牛体细胞杂交中，一个亲本具有亚致死因如在矮牵牛体细胞杂交中，一个亲本具有亚致死因子子 SS，其外部特征为生活力弱。另一亲本具有黄绿，其外部特征为生活力弱。另一亲本具有黄绿苗因子苗因子 VV，纯合的，纯合的 VVVV个体表现黄绿苗。个体表现黄绿苗。 SS和和 VV处处于不同位点上，当两种原生质体融合后，由杂种细于不同位点上，当两种原生质体融合后，由杂种细胞再生成的植株（胞再生成的植株（ V+SV+S）表现绿色、生长健旺；而）表现绿色、生长健旺；而非杂种细胞再生的植株则分别具有两亲的性状。此非杂种细胞再生的植株则分别具有两亲的性状。此外，体细胞杂种植株的有性繁后代，又能分离出亚外，体细胞杂种植株的有性繁后代，又能分离出亚致死（致死（ SS）、绿色健旺（）、绿色健旺（ S+VS+V）和黄绿苗（）和黄绿苗（ VV）三）三类植株。类植株。


（ 3）异核体机械分离和核型分析

异核体机械分离和杂种细胞的核型分异核体机械分离和杂种细胞的核型分析：析：采用特制的培养皿，把一个个细胞采用特制的培养皿，把一个个细胞单独分离开来悬滴培养，然后再用鉴别单独分离开来悬滴培养，然后再用鉴别核型的方法筛选杂种细胞。核型的方法筛选杂种细胞。


（ 4）体细胞杂种和胞质杂种的鉴别

前已述及胞质杂种与体细胞杂种在核的前已述及胞质杂种与体细胞杂种在核的组成上往往有明显区别，这种差别通常组成上往往有明显区别，这种差别通常用以下方法才能鉴别：用以下方法才能鉴别： ① ① 花部和营养体的形态观察；花部和营养体的形态观察； ② ② 细胞学监测；细胞学监测； ③ ③ 生化鉴定；生化鉴定； ④ ④ 分子生物学分析；分子生物学分析；


一般参照未经融合的单一基因型的原生质再生植一般参照未经融合的单一基因型的原生质再生植株的经验。株的经验。据杨世湖（据杨世湖（ 19911991）介绍，当由原生质体再生的）介绍，当由原生质体再生的愈伤组织直径达愈伤组织直径达 2mm2mm以上时，即可转入再生培以上时，即可转入再生培养基诱导植株再生，培养基为不含养基诱导植株再生，培养基为不含 22，， 4-D4-D的的N6N6加入加入 2 mg/L2 mg/L以上的以上的 KinetinKinetin或或 6BA6BA可提高再可提高再生频率。有时也加入低浓度的生频率。有时也加入低浓度的 NAANAA，最快两周，最快两周分化出芽，长根，若根系不发达，可转至含分化出芽，长根，若根系不发达，可转至含15g/L15g/L蔗糖、蔗糖、 2mg/L IAA2mg/L IAA或或 IBAIBA的的 N6N6或或WhiteWhite培养基上，促进根系发育。培养基上，促进根系发育。

四诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生植株


胞质杂种（胞质杂种（ cytohybridcytohybrid）） ::是指体细胞杂交过程中是指体细胞杂交过程中有意识地去除（或杀死）某一亲本的细胞核，得到有意识地去除（或杀死）某一亲本的细胞核，得到的将是一个亲本细胞核和两个亲本细胞质的杂种细的将是一个亲本细胞核和两个亲本细胞质的杂种细胞。胞。


二基因工程理论技术准二基因工程理论技术准备备

一重组一重组 DNADNA技术简介技术简介

三基因工程改造植物的三基因工程改造植物的内内

容和步骤容和步骤

第三节重组 DNA技术的应用


一简介

重组重组 DNADNA技术又称分子克隆或基因工程，技术又称分子克隆或基因工程， 19861986年比利时的年比利时的 NVNV遗传公司把苏云金芽孢杆菌遗传公司把苏云金芽孢杆菌（（ Bacillus thuringiensisBacillus thuringiensis）的一种毒蛋白基因转）的一种毒蛋白基因转移到烟草中，使之获得了抗鳞翅目幼虫的特移到烟草中，使之获得了抗鳞翅目幼虫的特性，这种基因能在转移当代表达，并能遗传。性，这种基因能在转移当代表达，并能遗传。北京大学陈章良的抗病毒的转基因香料烟草进北京大学陈章良的抗病毒的转基因香料烟草进入大田中间试验，达到了世界先进水平。入大田中间试验，达到了世界先进水平。


重组 DNA技术的定义

概念：概念：指利用一些先进的现代生物技术，使指利用一些先进的现代生物技术，使外源的外源的 DNADNA通过载体植入植物体内，并使通过载体植入植物体内，并使外源的外源的 DNADNA在植物体内表达。这一过程称在植物体内表达。这一过程称为为重组重组 DNADNA或或基因工程基因工程，这一过程中所需，这一过程中所需要的技术称为要的技术称为重组重组 DNADNA技术技术。。


二基因工程理论技术准备

基因工程迅猛发展的重要理论和技术基础基因工程迅猛发展的重要理论和技术基础是：是：① ① 分子生物学中心法则的确立；分子生物学中心法则的确立；② ② 限制性内切酶及其它工具酶的发现；限制性内切酶及其它工具酶的发现；

③ ③ DNADNA、、 RNARNA和蛋白质的序列分析；和蛋白质的序列分析； ④ ④ DNADNA和和 RNARNA合成技术和转移基因载体的合成技术和转移基因载体的

发现；发现；


三基因工程的内容和步骤

用重组用重组 DNADNA技术实现对某一植物的改造，大体上要经技术实现对某一植物的改造，大体上要经过以下过以下 55个步骤：个步骤：

① ① 获取外源获取外源 DNADNA或目的基因；或目的基因；

② ② 获取目的基因的载体；获取目的基因的载体；

③ ③ 把目的基因连接到载体上，获得把目的基因连接到载体上，获得 DNADNA重组体；重组体；

④ ④ 使重组使重组 DNADNA进入受体细胞，即实现外源进入受体细胞，即实现外源 DNADNA的转的转化；化；

⑤ ⑤ 被转化的受体细胞再生成完整植株，外源被转化的受体细胞再生成完整植株，外源 DNADNA在受在受体内表达。体内表达。


（一）分离基因的途径：（一）分离基因的途径： 1. 1. 通过通过 RNARNA反转录为反转录为 cDNAcDNA：：首先提首先提取目的基因所编码的取目的基因所编码的 mRNAmRNA，， mRNAmRNA经纯化后经过反转录程序，以其为模板经纯化后经过反转录程序，以其为模板复制出复制出 cDNAcDNA。。

三基因工程的内容和步骤三基因工程的内容和步骤


（一）分离基因的途径：（一）分离基因的途径： 2. 2. 从基因文库中获取目的基因：从基因文库中获取目的基因：对于大多数基因而言，对于大多数基因而言， cDNAcDNA并不等于其天然结构基因，并不等于其天然结构基因，因为因为 cDNAcDNA中缺少天然基因中的启动部分和内含子中缺少天然基因中的启动部分和内含子（（ intronintron）。由于在）。由于在 DNADNA（天然基因）转录（天然基因）转录 mRNAmRNA时，时，其启动部分和内含子没有转录到其启动部分和内含子没有转录到 mRNAmRNA中；所以大多数中；所以大多数mRNAmRNA中并不包含完整的遗传信息。因此，要用纯化的中并不包含完整的遗传信息。因此，要用纯化的mRNAmRNA探针，到事先构建的基因文库中去钓取与之对应探针，到事先构建的基因文库中去钓取与之对应的目的基因。的目的基因。



（二）（二） TiTi质粒及其改造：质粒及其改造：一切基因工程载体都是由某种细菌质粒或一切基因工程载体都是由某种细菌质粒或病毒来充任，而在众多的载体中目前仅有病毒来充任，而在众多的载体中目前仅有TiTi质粒在转化植物受体方面取得较多的成质粒在转化植物受体方面取得较多的成功。所以功。所以 TiTi质粒是当前植物基因工程中最质粒是当前植物基因工程中最常用的载体系统。常用的载体系统。

三基因工程的内容和步骤


TiTi质粒是土壤农杆菌（质粒是土壤农杆菌（ Agrobactericum Agrobactericum tumefacienstumefaciens）中一种环形）中一种环形 DNADNA分子分子

左左 TiTi质粒，质粒， 1. 1. 毒性区域毒性区域 2. T-DNA2. T-DNA 区区右右 T-DNAT-DNA的结构的结构 ShiShi和和 RoiRoi 为致瘤基因为致瘤基因 NosNos为胭脂碱合酶基因为胭脂碱合酶基因 OcsOcs 为章鱼碱合酶基因末端为章鱼碱合酶基因末端 2525对碱基序列对碱基序列


TiTi质粒大约包含质粒大约包含 150~200kb150~200kb，这个质粒有两个重，这个质粒有两个重要区段，一段为要区段，一段为 T-DNAT-DNA区，另一段为毒性区。区，另一段为毒性区。农杆菌侵染植物后，农杆菌侵染植物后， TiTi质粒中的质粒中的 T-DNAT-DNA区段脱区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体上。因此，离质粒而整合到受体植物的染色体上。因此，如果把外源基因插入如果把外源基因插入 T-DNAT-DNA中，就有可能携带中，就有可能携带进入受体植物并整合到染色体上。进入受体植物并整合到染色体上。



但是但是 T-DNAT-DNA中的中的 ShiShi和和 RoiRoi基因与这个质粒的基因与这个质粒的毒毒性区段中的几个基因合作，能导致植物产生冠性区段中的几个基因合作，能导致植物产生冠瘿瘤，这些基因不但与运载外源基因无关，而瘿瘤，这些基因不但与运载外源基因无关，而且还有害于植物。且还有害于植物。因此目前已经把这些有害部分去掉，代之以其因此目前已经把这些有害部分去掉，代之以其他外源他外源 DNADNA，构建成改良的，构建成改良的 TiTi质粒。质粒。



经过改良的经过改良的 TiTi质粒保留了它的插入植物染质粒保留了它的插入植物染色体、自我复制，转录色体、自我复制，转录 mRNAmRNA等功能以及等功能以及其固有的起标志作用的合成其固有的起标志作用的合成 OpinesOpines（罂粟（罂粟碱）的基因，并且容许目的基因插入其碱）的基因，并且容许目的基因插入其中，这种改良的中，这种改良的 TiTi质粒可以侵染烟草、矮质粒可以侵染烟草、矮牵牛、马铃薯和向日葵等许多双子叶植牵牛、马铃薯和向日葵等许多双子叶植物，并且能有效地转移外源基因。物，并且能有效地转移外源基因。



（三）重组（三）重组 DNADNA的制备：的制备：已经分离或合成的基因一般都保存在大肠杆菌已经分离或合成的基因一般都保存在大肠杆菌内的一类辅助质粒中（如内的一类辅助质粒中（如 pBR322pBR322）。在制备）。在制备重组重组 DNADNA时，将时，将 pBR322pBR322从大肠杆菌中提出，从大肠杆菌中提出，再导入农杆菌中，使之与经过改造的再导入农杆菌中，使之与经过改造的 TiTi质粒质粒（即（即 pGV3850pGV3850）发生一个单交换，前者所携带）发生一个单交换，前者所携带的目的基因便转移到的目的基因便转移到 TiTi质粒之中，从而形成目质粒之中，从而形成目的基因与的基因与 TiTi质粒的重组体质粒的重组体（见图）


Shenyang Agricultural University制作人：吕香玲外源基因插入外源基因插入 pGV3580pGV3580的示意图的示意图


（四）重组（四）重组 DNADNA ——进入植物体转化：——进入植物体转化：通常是使植物原生质体与农杆菌共培养，通常是使植物原生质体与农杆菌共培养， 14~3014~30小时小时后抗生素除去农杆菌，在选择性培养基中选择转化后抗生素除去农杆菌，在选择性培养基中选择转化体（即接受体（即接受 TiTi质粒的植物细胞）。还可以利用组织质粒的植物细胞）。还可以利用组织进行转化的方法。进行转化的方法。例如叶的圆盘（用打孔器切下），茎段和根段等，例如叶的圆盘（用打孔器切下），茎段和根段等，利用它们的伤面与农杆菌接触转染，效果很好。利用它们的伤面与农杆菌接触转染，效果很好。



（五）被转化受体的再生与鉴定：（五）被转化受体的再生与鉴定：经过鉴定证实已被转化的受体，无论是原生质体、经过鉴定证实已被转化的受体，无论是原生质体、细胞或某些组织，都要经过愈伤组织进而诱导出细胞或某些组织，都要经过愈伤组织进而诱导出再生植株。最后还要在植株水平上鉴定目的基因再生植株。最后还要在植株水平上鉴定目的基因是否表达，以及能否连续多代稳定地表达。否则是否表达，以及能否连续多代稳定地表达。否则就不能达到改造植物的目的。就不能达到改造植物的目的。



除了上面两种方法外，也有一些不通过除了上面两种方法外，也有一些不通过载体系统直接把外源基因导入受体细胞的载体系统直接把外源基因导入受体细胞的方法。方法。



第四节、分子标记辅助选择

• 一、分子标记的类型和作用原理• 1。遗传标记：指那些可以识别的形态、细胞或分子的稳定特征。它可以用来研究基因的表达与变异规律。

• 2。分子标记：以 DNA多态性为基础的标记，目前它已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择（molecular marker-assisted selection ， MAS ）育种更受到人们的重视。


分子标记是以 DNA多态性为基础，因

而具有以下优点：

①表现稳定，多态性直接以 DNA形式

表现，无组织器官、发育时期特异性，不受

环境条件、基因互作影响；

②数量多，理论上遍及整个基因组；


③多态性高，自然界存在许多等位变

异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为

与重要性状基因紧密连锁标记的筛选创造了

条件；

④对目标性状表达无不良影响，与不良

性状无必然连锁；


⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别

纯合体与杂合体；

⑥对于特定探针或引物可引进或根据发

表的特定序列自行合成，一般实验室均可进

行。


应用于分子标记辅助育种的标记

主要有

RFLP、 RAPD、 SSR、 AFLP、 ST

S等。它们的遗传、表现特点总结于下

表。


表 1 主要分子标记产生体系及特点------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

比较内容 RFLP RAPD AFLP SSR ISSR SCAR STS CAPS------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

主要原理限制酶切随机 PCR 扩增限制性酶切 PCR 扩增随机 PCR 扩增特异 PCR 扩增特异 PCR 扩增 PCR扩增产物 southern 杂交结合 PCR 扩增限制性酶切------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

探针或引特定序列 9-10bp 由核心序列酶切特异引物以 2-、 3-、 4- RAPD 特征带 RFLP 探针序列特异引物，物来源 DNA 探针随机引物位点及选择性碱基核苷酸为基元的测序设计的 Alu-因子、 YAC、

组成的特定引物不同重复次数作为引物特异引物 Cosmid插入末端序列设计引物------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

基因组中丰富度中等很高高高高中等（？）中等中等（？）

多态性水平中等较高非常高高高中等检测基因组区域单 / 低整个整个重复重复序列间隔整个单拷贝区

整个拷贝区基因组基因组序列的单拷贝区基因组基因组 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

可检测座位数 1-4 1-10 20-100 1-5 0-50 或更多 1 1 1 可靠性高中高高高高高

高遗传特性共显性显性 / 共显性共显性 / 显性共显性显性 / 共显性共显性显性 / 共显性共

显性DNA 质量要求高 5-10μg 中 10-100 μg 很高 50-100μg 中 10-100μg 中 2-50 μg 中 5-10 μg 高 50-100 μg

需否序列信息否否否需否需需需------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

放射性通常是不是通常是不是不是不是不是不是

实际周期长短较长短短短短短

发展成本高低高高低高高高------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------


二、重要农艺性状基因连锁标记筛选技术用于MAS育种的分子标记需具备 3 条件：

1、分子标记与目标基因紧密连锁（最好 1cM或更

小，或共分离）；

2、标记实用性强。重复性好，而且能经济简便地检

测大量个体（当前以 PCR为基础）；

3、不同遗传背景选择有效。遗传背景的MAS则需

要有某一亲本基因型的分子标记研究基础。


遗传图谱构建的主要环节为：

1、群体中不同植株的标记基因型分析；

2、借助于计算机程序构建连锁群。

因此，要构建好的遗传图谱，首先要选择合适的亲

本及分离群体，这直接关系到建立遗传图谱的难易

程度、遗传图谱的准确性及所构建图谱的适用性。

（一）遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记


表不同作图群体的特点

------------------------------------------------------------------------------------------------

F2 BC1 DH RIL

----------------------------------------------------------------------------

群体形成 F1自交后代回交后代花粉分化个体个体自交

后代

性状研究对象个体个体品系品系

准确度低低高高

必要的群体规模大大中中

分离比例 1∶2∶1或 3∶1 1∶1 1∶1 1∶1

----------------------------------------------------------------------------


遗传标记连锁图


（二）数量性状基因的定位产量、成熟期、品质、抗旱性等大多数重要的农艺

性状均表现为数量性状的遗传特点。影响这类性状

的表现型差异由多个基因位点（数量性状位

点， QTL）和环境共同决定，子代常常发生超亲分

离。筛选与多基因控制的数量性状基因连锁的分子

标记要比筛选主基因控制的质量性状复杂得多。


QTL定位的方法

• 单标记或单点分析• 区间作图• 复合区间作图• 多 QTL 作图• 上位性 QTL作图


回交群体中的区间标记型和 QTL基因型P1: P2:

F1: P1:

区间标记类型1 2区间标记类型 3区间标记类型区间标记类型4

Mi Q Mi +1

Mi Q Mi +1

mi q mi +1

mi q mi +1

×

Mi Q Mi +1 Mi Q Mi +1

Mi Q Mi +1

×

Mi Q Mi +1 Mi Q Mi +1 Mi Q Mi +1 Mi Q Mi +1

Mi Q Mi +1 Mi Q mi +1 mi qMi +1

mi q mi +1

Mi Q Mi +1

Mi q mi +1

mi q Mi +1

Mi Q Mi +1

mi Q Mi +1

mi q mi +1


三、作物MAS育种


（一）作物MAS育种需具备的条件

要开展MAS育种，必须具备如下条件：

①分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求

两者之间的遗传距离小于 5cM，最好 1cM 或更小； ②具

有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，

目前，主要应用在自动化程度高、相对易于分析，

而且成本较小的 PCR技术；


③筛选技术在不同试验室间重复

性好，而且具有经济、易操作的特点；

④应有实用化程度高并能协助育

种家作出抉择的计算机数据处理软件。


由单基因或寡基因控制的质量性状的分子

标记，易于用于MAS育种。对大多数数量性状遗

传的重要农艺性状，若利用MAS育种则必须具有

精确的 QTL图谱。这不仅需要将重复的性状利用

合适软件分成多个 QTLs，并将各个 QTL标记定

位于合适的遗传图谱上，而且还与是否有对该数量

性状表现型进行准确检测的方法。


用于作图的群体大小、可重复性、环

境影响和不同遗传背景的影响以及是否有合

适的数量性状遗传分析方法等有关。这为筛

选某一复杂农艺性状的 QTL标记提出了更

高的要求，也增加了MAS付诸育种实践的

难度。


（二）MAS育种方法


筛选与质量性状基因紧密连锁的分

子标记用于辅助育种，可免受环境条件的影

响。 Deal等（ 1995）将普通小麦 4D染色

体长臂上的抗盐基因转移到硬粒小麦 4B染

色体上，利用与该抗盐基因连锁的分子标记

进行选择，大大提高了选择效率。


研究表明：在一个有 100个个体数的

回交后代群体中，借助 100个 RFLP标记选

择，只需 3代就可使后代的基因型回复到轮

回亲本的 99.2%，而随机挑选则需要 7代才

能达到。


利用MAS技术在快速基因累集方面也

表现出其巨大的优越性，国际水稻所Mackill

等（ 1992）已将抗稻瘟病基因 Pi-l、 Pi-

Z5、 Pi-ta精确定位，并建立了分别具有这 3

个基因的等基因系。通过MAS聚合杂交获得

3个抗稻瘟病累集到一个材料中的个体。


近十多年来，分子标记的研究

已经得到快速发展，在许多作物中已

定位了很多重要性状的基因，但是预

测品系或品种的报道还很少。


目前，最时髦的分子标记是 SNP全基因组标记 ,.

最时髦的分子育种就是分子设计育种。


生物技术应用总结

生物技术在植物育种中已经充分地显示生物技术在植物育种中已经充分地显示了它的巨大的创造力和生命力，预计在了它的巨大的创造力和生命力，预计在不久的将来，由于生物技术的进一步完不久的将来，由于生物技术的进一步完善和发展，将给植物育种带来革命性的善和发展，将给植物育种带来革命性的变化。变化。


在植物育种中利用重组在植物育种中利用重组 DNADNA技术方技术方面，可望在短期内取得以下成果：面，可望在短期内取得以下成果：

1. 1. 把抗除草剂基因转化到烟草、大把抗除草剂基因转化到烟草、大豆、马铃薯、油菜及林木之中。豆、马铃薯、油菜及林木之中。

2. 2. 在更多植物基因组中插入抗病和在更多植物基因组中插入抗病和杀虫剂因。杀虫剂因。

生物技术应用总结生物技术应用总结


3. 3. 为了提高特异氨基酸水平（如大豆中的为了提高特异氨基酸水平（如大豆中的蛋氨酸）可以修饰编码同源贮存蛋白的基蛋氨酸）可以修饰编码同源贮存蛋白的基因，或者转移表达异源贮存蛋白基因，这因，或者转移表达异源贮存蛋白基因，这种异源贮存蛋白质的氨基酸成分可以补充种异源贮存蛋白质的氨基酸成分可以补充自然蛋白质的氨基酸成分。自然蛋白质的氨基酸成分。

4. 4. 把脂肪酸合成酶基因接上一种特别的启把脂肪酸合成酶基因接上一种特别的启动子，插入油料种子植物中，可以增加植动子，插入油料种子植物中，可以增加植物种子中油的生成。物种子中油的生成。



预计预计 2121世纪，人们将培育成不要施肥、不需世纪，人们将培育成不要施肥、不需施用杀虫剂、除草剂及其它化学药品的超级植施用杀虫剂、除草剂及其它化学药品的超级植物，由于植物间有性杂交障碍的克服，将创造物，由于植物间有性杂交障碍的克服，将创造出具有更丰富更优越性状的植物，使之成为新出具有更丰富更优越性状的植物，使之成为新颖、高级产品的原料。如用植物制品代替石油颖、高级产品的原料。如用植物制品代替石油化工产品，创造特质油、药材、调味品和香料化工产品，创造特质油、药材、调味品和香料制品的原料植物，以及其他能源植物，从而极制品的原料植物，以及其他能源植物，从而极大程度提高它们的利用范围。大程度提高它们的利用范围。



summary

1.1.名词：无性系变异，体细胞杂交，胞质杂种，名词：无性系变异，体细胞杂交，胞质杂种，外植体，植物原生质体，外植体，植物原生质体，

2.2.如何通过组培获得突变体如何通过组培获得突变体3.3.体细胞无性系选择中应注意的问题？体细胞无性系选择中应注意的问题？4.4.植物体细胞杂交的重要环节？植物体细胞杂交的重要环节？5.5.用基因工程改造植物性状的主要内容和步骤？用基因工程改造植物性状的主要内容和步骤？6.6.未分化植株再生植株的两种系统？未分化植株再生植株的两种系统？7.7.如何进行杂种细胞的鉴别和选择？如何进行杂种细胞的鉴别和选择？8.8.生物技术在作物育种中的应用前景？生物技术在作物育种中的应用前景？

第十五章生物技术应用

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