亲和层析法

● 1 原理： 要有一对具有高亲和性的分子

● 2 亲和吸附剂： 有很多亲和性吸附剂可利用

● 3 金属螯合层析法： 利用分子与金属的吸引力

亲和色谱

原理：酶与载体之间的特异性作用。

亲和洗提

酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上，然后用适当的底物特异地洗提。

■ 亲和层析法的四项要素：

(2)

SpecificBindingSubstance (B)

洗脱Elution

(4)

配 体Ligand (A)

耦合反应 (3)Coupling Reaction

杂质B

B

B

B

(1)

Solid Matrix

B

■ 亲和层析法的作用机理：

固相载体

(1) (2) (3)

A

B

Sample

Washing Elution

X B

亲和基团配体

XB

A A

■ 典型的亲和层析操作：

Activity

Elution volume

Protein

pH 2.05

*

II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction

■ 专一性作用力的种类：

I. Conformational Match: Van der waals interaction

+Kd

两分子间因构象互补所造成的吸引力是由范德华力所贡献

+ -

=O…H-N-

B

A

■构型互补所产生的吸引力：

Van der Waal interactions

between non-polar surfaces

vdw vdw范德华键数目够多就足以产生亲和

力

■ 生化分子的反应基团：

-NH2胺 基-COOH羧 基-HC=O醛 基

-O-醚

氰 基 -C N

-OH醇 基 -SH硫醇基

-CH3烷 基

●●●●●

●●●

X

●●

●

●

■ 可与各种配体基团反应的载体：

配体基团 親 和 性 载体 反应基团 反应方式 直接反应加 EDC*

直接反应直接反应加 EDC*

直接反应直接反应DTT 活化 直接反应

-C≡N

-COOH

N-OH-succinimide

Oxirane 环氧己烷-NH2

oxirane

oxirane

-S-S-R

-G-S-S-R

CH-Sepharose 4B 或活化型

CNBr-activated Sepharose 4B

Epoxy-activated Sepharose 4B

AH Sepharose 4B

Epoxy-activated Sepharose 4B

Epoxy-activated Sepharose 4B

Thiopropyl-Sepharose 4B

Activated thio-Sepharose 4B

-NH2

-COOH-OH

-SH

* EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl

Pharmacia

■ 亲和性载体的反应基团：

spacer arm

- O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C - COOH

- OH

- O - C N

NH2 - Protein

- NH -C-C-C-C-C-C- NH2

- NH -C-C-C-C-C-C- COOH

- O - C - NH - Protein

NH

Epoxy

N-Succinimide琥珀酰亚胺

Carboxylic

Amino

CNBr activated

- NH -C-C-C-C-C-C- C - O-N

O

O

O

- O - C NCNBr

■ 各种亲和性载体及其专一性基团：

免疫吸附剂，大多自行合成

单株抗体纯化对 -D- 葡萄糖、甘露糖基有专一性 Heparin Sepharose CL-6B

Blue Sepharose CL-6B

5'AMP-, 2', 5'ADP-Sepharose 4B

用来纯化 lectin

酶的专一性结合

Oligo (dT)-cellulose

配 体 親和性分子 说 明

( 还有更多其它 亲和配体和载体 )

Oligo (dT)

抗体 底物或抑制剂Protein A

Con A 刀豆素Heparin

Cibacron-BlueAMP, ADP

单糖及衍生物

对应的酶对应的抗原

Lectin

NAD(P)+ 结合酶NAD(P)+ 结合酶

mRNA

部分 IgG

糖蛋白凝血蛋白等

Pharmacia

■ 金属螯合层析法：

Ni 固相载体His HisHis

Protein

Metal Chelate Affinity Chromatography

imidazole

elution-O-C-C-C-O-C-C-C-NOH

C-COOH

C-COOHOH

Juang RH (2004) ECX

■ 亲和层析法实例的原始材料：

CHOM鸡蛋粘多糖蛋白

OO

CH2OH

OH

NH2

OO

CH2OH

OH

NH

O=CH3

Chitin Trypsin

SDS-PAGE

■ 以亲和层析法纯化 Trypsin ：

CHOM

Trypsin

A B C&D

Disc-PAGE

A B C = D以凝胶电泳检验亲和层析操作过程各步骤样品→

Chitin

■ Hydroxyapatite 吸附剂：

Bio-Rad CHT

(Ca5(PO4)3OH)2羟基磷灰石

可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件

●疏水性层析法： 利用分子间的疏水性引力

●液相分配： 分子在两液相间的分配比例不同

■ 蛋白质表面的极性或非极性分布：

Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig. 21-36

Superxoidedismutase(SOD)

Activie site

Hydrophobic area

Reverse Phase Chromatography (liquid-liquid)

Using ion-exchanger

Polarsolvent

■ 疏水性及反相层析法原理：

HIC (liquid-solid)

Using non-polar groups as a stationary phase

Polarsolvent

Non-polararea

Hydrophobic groupPolar area

Non-polararea

Non-polarsolvent

++

+++++++ ++

Polar phase

C18 = -C18H37

C6 = -C6H13

Phenyl = -C6H6Juang RH (2004) ECX

■ Hydrophobic interaction 色析法：

Elution volume (mL)

0

10

20

30

40

50

5

10

15

20

25

100 200 300 400

Eth

yle

ne g

lyco

l (%

)

Ammonium sulfate (% sat.)

Pro

tein

con

centr

ati

on

BA

Pharmacia HIC

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