Особенности регуляции транскрипции у прокариот и...

Регуляция транскрипцииу прокариот и эукариот

Лаборатория молекулярной генетики микроорганизмовИнститут молекулярной генетики РАН

А.В. Кульбачинский

пары оснований

аденин-тимин

гуанин-цитозин

Структура ДНК

сахаро-фосфатная цепь

Каждая цепь ДНК имеетнаправление

Структура ДНК

Т

С

А

ДНК-белковые взаимодействия

Узнавание пар нуклеотидов аминокислотами

Узнавание специфической ДНК регуляторными белками

helix-turn-helixT - A

C - G

Расположение генов в геноме

Плазмида pBR322 Геном Pseudomonas aeruginosa

• Гены располагаются в разных цепях ДНК

• Между генами есть промежутки

ДНК РНК белоктранскрипция трансляция

репликация

Структура РНК

• Начало и окончание синтеза в специальных участках – промоторах и терминаторах

• Инициация синтеза РНК без затравки

• Использование рибонуклеозидтрифосфатов

• Копирование одной из цепей ДНК (матричная цепь)

• Направление синтеза от 5’- к 3’-концу РНК

• Синтез всей молекулы РНК сразу

нематричная ДНК

матричная ДНКРНК

5’

3’ 5’5’ 3’3’

РНК-полимераза

Особенности транскрипции

Транскрипционный цикл

Регуляторные факторы действуют на всех стадиях транскрипции

ТерминацияИнициация

Элонгация

-10-35

Кор-ферментα2ββ′ω σ2

TATAAT

σ4σ3

σ1

TTGACATATAAT

σ2

РНК-полимераза бактерий

Холофермент

Основные элементы промотора (-10 и -35) узнаются σ-субъединицей

Плавление ДНК осуществляется за счет контактов σ -субъединицы с нематричной цепью ДНК в районе старта транскрипции

Активный центр

-35σ4

-10σ2

Главный канал

Murakami et al., 2002

ДНК

РНКП T. aquaticus

σ1

Структурная модель промоторного комплекса

σ3

• РНК-полимераза по форме напоминает клешню

• ДНК связывается в главном канале

• Активный центр – в глубине молекулы

Трехмерная структура РНК-полимеразы

Nudler, 2008

РНК-полимераза – сложная молекулярная машина, состоящая из многих структурно-функциональных элементов:

- взаимодействие с ДНК и РНК

- синтез РНК (присоединение нуклеотидов)

- связывание регуляторных факторов

•Регуляторные белки•Малые молекулы•Антибиотики

σ70 – гены “домашнего хозяйства”σ32 – тепловой шокσ38 – стрессовые условия

σ54 – азотный обмен

Большинство бактерий содержат несколько σ-субъединиц, которые отвечают за узнавание разных типов промоторов и транскрипцию различных групп генов (регулон).

Escherichia coli:

Регуляция инициации транскрипции у прокариотОперон - группа генов, транскрибируемых в составе одной РНК; регулируются совместно и обычно обладают общей функцией.

оператор

Репрессиярепрессор

индуктор

оператор

Активация

Оператор – участок связывания регуляторного белка

Индуктор – молекула (клеточный метаболит - лактоза, галактоза), контролирующая связывание активаторов и репрессоров с операторами

Активаторы обычно привлекают РНКП к промотору Репрессоры – мешают связыванию РНКП с промотором

Белок-регулятор – связывается в промоторной области и влияет на инициацию транскрипции

активатор

индуктор

Регуляция инициации транскрипции у прокариот

Pazos et al., 2012

Примеры транскрипционных факторов

Helix-Turn-Helix Номеодомен

bZip Zn-finger

Взаимодействие с α-субъединицей

РНКП

СAP – catabolite activator protein

Активация катаболитных

оперонов

cAMP (синтезируется

в отсутствие глюкозы)

TGTGAACACT

TCACA AGTGT


R

R

R


Активация специфического оперона

СAP

индуктор

1. Связывание белка-активатора2. Удаление белка-репрессора

Регуляция элонгации транскрипции у прокариот

Паузы и скорость транскрипции:

- узнавание специфических сигналов в РНК и ДНК

- действие регуляторных факторов

• Воздействие на активный центр РНК-полимеразы

• Закрывание-открывание главного канала РНК-полимеразы

тРНК

Синтезируемая РНК способна образовывать различные вторичные структуры, что имеет важное регуляторное значение

Регуляция элонгации транскрипции у прокариот

Механизмы терминации транскрипции

ρ-независимая терминация ρ-зависимая терминация

Паузы, Терминация

Регуляция транскрипции у прокариот: аттенюация

гены биосинтеза Trp

Мало Trp:нет Trp-tRNA,

пауза трансляции

Много Trp:есть Trp-tRNA,

нет паузы трансляции

РНКПРибосома

Промотор

Аттенюатор

Регуляция транскрипции у прокариот:рибопереключатели (riboswitches)

происходит синтез полноразмерной РНК

В отсутствие метаболита

Vitreschak et al., 2002

образуется структура терминатора транскрипции

В присутствии метаболита

Регуляция транскрипции у прокариот: рибозимы

Консервативный элемент в 5’-концевой области гена glmS B. subtilis:

В присутствии метаболита происходит активация рибозима и расщепление РНК

Рибозимы – молекулы РНК, обладающие каталитической активностью

5’ 3’библиотека

NNNNNN ConstConst

связывание

ампл

ифик

ация

разделение

Аптамеры

Искусственный отбор функциональных молекул РНК и ДНК

Сравнение транскрипции у прокариот и эукариот

Про- Эу-

-Одна РНК-полимераза (5 субъединиц)

-Уровень транскрипции определяется промотором

-Связь с трансляцией

-Гены непрерывны

-Каждая мРНК обычно кодирует несколько белков

-Три РНК-полимеразы (10-14 субъединиц)

-Уровень транскрипции определяется регуляторными участками (энхансеры)

-Трансляция независима от транскрипции

-Гены состоят из экзонов и интронов, процессинг РНК

-Каждая мРНК обычно кодирует один белок

-ДНК организована в хроматин

РНК-полимераза I – синтез рРНК

РНК-полимераза II – синтез мРНК

РНК-полимераза III – синтез тРНК

Промоторы РНКП II эукариот

Три типа промоторных элементов:

– Основные промоторные элементы (-45 to +40)• Связывание главных транскрипционных факторов (GTF)

– Проксимальные промоторные элементы (-1 kb to +200)• Связывание белков-регуляторов, участвующих в активации

или репрессии транскрипции (для больших групп генов)

– Энхансеры/сайленсеры (десятки тыс.п.н.)• Связывание белков-регуляторов, участвующих в активации

/репрессии транскрипции (уникальны для данного промотора)

Taatjes et al., 2004

Классы активаторов транскрипции:

3. Взаимодействуют с ДНК.4. Передают активационный сигнал на РНК-полимеразу.5. Изменяют структуру хроматина.

энхансеры (сайленсеры)

основной промотор

проксимальные элементы

Промоторы РНКП II эукариот

Ввод Выход

Создание синтетических регуляторных систем

- химические индукторы- регуляторные РНК- свет- механические воздействия

- окраска - флуоресценция

- морфология клеток- жизнеспособность клеток

Nandagopal and Elowitz, 2011


Weber et al., 2012


Системы с репрессорами / активаторами

Weber et al., 2012


Изменение структуры / стабильности РНК

Silva-Rocha et al., 2008


Логические операции

Shetty et al., 2008


Попытки создания стандартных функциональных элементов

Canton et al., 2008

Larson et al., 2011

Изучение отдельных молекул РНК-полимеразы

Изучение отдельных молекул РНК-полимеразы

Larson et al., 2011

• Свойства единичных молекул РНК-полимеразы различаются

• Можно исследовать паузы, терминацию в реальном времени

Pomerantz et al., 2005

РНК-полимераза – молекулярная машина

Итак:

РНК-полимераза – основная мишень для регуляции экспрессии генов на стадии транскрипции различными факторами: - белками, - регуляторными РНК,- малыми молекулами, - антибиотиками

1.

2. Использование существующих и создание новых регуляторных элементов позволяет контролировать активность РНК-полимеразы и уровень экспрессии генов в клетке и в бесклеточных системах

3. РНК-полимераза может быть использована в качестве молекулярной машины для перемещения объектов на наноуровне

Особенности регуляции транскрипции у прокариот и...

Documents

Transcript of Особенности регуляции транскрипции у прокариот и...