المستخدمةية واالختبارات الكيموحيو

في التعرف علي الجراثيم

Biochemical Tests

أستاذ الدكتور يوسف محمد الشريك

تستخدم مثل هذه االختبارات في التمييز بين األنواع المختلفة من •البكتيريا، حيث يختلف النشاط الكيموحيوي للبكتيريا باختالف

اإلنزيمات التي تنتجها

البعض منها تنتج إعدادا كبيرة من هذه اإلنزيمات 1.

. في حين أنواع أخري ال تنتج إال عدد قليال منها 2.

.أو قد ال تنتج أي منها3.

.األمر الذي يؤدي إلى اختالف في الخواص الكيموحيوية

تصنيف األحياء الدقيقة لالختبارات الكيموحيوية أهمية كبيرة في • إلى مجموعات

.وكذلك في التعرف الدقيق علي األنواع المختلفة منها •

-:وتشمل هذه االختبارات التالية •

: Indole Testاختبار االندول •

بعض أنواع من البكتيريا تقوم بتحلل حامض االميني تربتوفان •

tryptophan ألنها تنتج إنزيم التربتوفانيزtryptophanase.

ويمكن إجراء هذا االختبار للكشف عن مادة االندول في النمو •

البكتيري

كاشف ) وتكون حلقة حمراء اللون بعد إضافة إحدى الكواشف •

( Ehrlichsأو Kovacsكوفاك

.وعدم تغير اللون أو ظهور لون أصفر تكون النتيجة سالبة •

اختبار اإلندول حلقة حمراء على

مراقب على اليسار( الوسط)وحلقة صفراء السالبة( على اليمين)سطح البيئة الموجبة

Methyl Redاختبارات احمر الميثيل وفوكس بروسكاور

and Voges Proskauer Tests ) MR-VP : )

تخمر المعوية عائلة في وخصوصا البكتيريا من أنواع هناك• ذلك عن وينتج MR-VP النمو بيئة في الجلوكوز سكر السكسنيك وحمض الالكتيك حامض )عضوية أحماض تكون

. ( الفورميك وحمض الهيدروجيني األس درجة النخفاض يؤدي األحماض تلك وجود•

4.5 إلى أحمر لون إلى اللون يتحول الميثيل احمر محلول إضافة وعند•

. األحماض هذه إنتاج علي يدل مما

في حين هناك أنواع أخري من البكتيريا تستخدم سكر •

ويتكون مركب متعادل MR-VPالجلوكوز في بيئة النمو

acetyl methylهو أسيتيل ميثيل كربينول

carbinol .

وللكشف عن هذا المركب يتم إضافة بعض الكواشف حيث •

يظهر اللون األحمر بكامل األنبوبة خالل دقائق مما يدل علي

االيجابية

.وعدم تغير اللون تكون سالبة •

(التفاعل موجب) لون األحمر في األنبوبة على جهة اليمين

(التفاعل سالب) لون أصفر في األنبوبة على جهة اليسار

اليوريا تحلل اختبار•

: ( urease اليوريز أنزيم إنتاج )•

يؤدي األمينية األحماض من األمين مجموعة نزع• األمونيا غاز إنتاج إلى

البروتينية المواد لتحلل نتيجة ذلك يحدث كما • أنزيم تفرز التي البكتيريا من أنواع لبعض

. اليوريز

األس درجة رفع إلى األمونيا غاز يؤدي • القلوي إلى المتعادلة من الهيدروجيني

( 8.1pH )

اللون إلى الفينول أحمر دليل تغير وبالتالي • ( موجبة نتيجة ) األحمر

. اللون في تغير يحدث ال السالبة الحاالت في أما •

كريستينسين النمو بيئة الغرض لهذا ويستخدم•Christensen’s .

: Catalase Testاختبار الكاتاليز الهوائية األكسدة عملية أثناء تتكون قد•

hydrogen األكسجين الماء مادةperoxide

علي سام تأثير ذات المادة هذه أن وبما• بإفراز تقوم الهوائية البكتيريا فان الخاليا

الماء اختزال عل يعمل والذي اإلنزيم هذا غاز تصاعد مع ماء إلى األكسجين .الحر األكسجين

ذلك تنتج ال الالهوائية البكتيريا بينما• نموها وعدم لتسممها يؤدي مما اإلنزيم . الجوي للهواء تتعرض عندما

فقاقيع ظهور عند موجبا يكون االختبار • الماء إضافة فور األكسجين غاز

ومزجها بكتيرية مستعمرة علي األكسجين زجاجية ساق مستخدما المذكور بالمحلول

.كما يمكن أجراء االختبار باألنابيب •

هذا يجب المالحظة بعدم استخدام البكتيريا التي تنمو علي •

ألنها تعطي نتيجة كاذبة , أجار الدم

كما يجب عدم االعتداد بالنتائج التي ال يتصاعد فيها الغاز •

.فورا

: Oxidase Testاختبار االكسيديز البكتيريا لمعرفة يستخدم اختبار هو•

والذي اإلنزيم هذا إنتاج في القادرة

مباشرة األكسجين باستخدام يسمح

. لإليدروجين كمستقبل

لون الموجبة العينات تعطي•

ثواني 10 خالل غامق أرجواني

علي يحتوي اإلنزيم هذا الن فقط

. والنحاس الحديد أيونات

لونا تعطي قد السالبة العينات أما•

. بنفسجيا ورديا أحمر

: للعنقوديات ( Coagulase كواجيوليز ) التخثر اختبار• أن حين في اإلنزيم هذا بإفراز تقوم الممرضة الذهبية العنقودية•

إفرازه تستطيع ال الممرضة غير العنقوديات

. بينهم للتمييز االختبار هذا يستخدم لذلك •

: الطريقتين بإحدى ويجري•

أو األرانب بالزما من قطرة بوضع وذلك الزجاجية الشريحة باستخدام• الشريحة علي اإلنسان

قطرة مع جيدا بكتيرية مستعمرة مزج يتم بالتين عروة مستخدما ,• . البالزما

. ثواني بضع خالل تخثر يحدث الموجبة الحالة في•

(أخضر اللون)اختبار الستريت على اليمين سالب

(أزرق اللون)بينما على اليسار موجب

مل من 0.5باستخدام األنابيب وذلك بوضع •في محلول ملحي 1:5بالزما مخففة

Kahnفسيولوجي معقم بأنابيب كاهن

وإضافة بضع قطرات من بيئة النمو المرق • المغذي تنمو فيه العنقودية الذهبية

. ْم 37تحضن األنابيب عند •

دقيقة 60-30يحدث التخثر عادة خالل •

ساعات 6ولكن يجب حفظ األنابيب لفترة • .قبل اعتبارها سالبة

: السكريات استخدام علي البكتيريا قدرة اختبار•

المختلفة السكرية المواد تحليل في كبيرا اختالفا البكتيريا تختلف•

وغازا حمضا منتجة السكرية المواد أحد تخمر البكتيريا فبعض •

فقط حمضا تنتج أخري أنواع بينما •

ذلك تخمير أو تحليل تستطيع ال البكتيريا أنواع بعض حين في •

. السكر

علي التعرف في هامة السكرية المواد تخمر خاصية وتعتبر•

البكتيريا من المختلفة األنواع

% 0.5تستخدم المادة السكرية المراد اختبارها بتركيز •

تضاف لبيئة النمو ماء الببتون المحتوي علي دليل لمالحظة

تغير درجة األس الهيدروجيني عند تخمر المادة السكرية

الختبار Durham’s tubeوتوضع أنبوبة در هام •

.إمكانية إنتاج الغاز

ولمعرفة البكتيريا إذا ما كانت مخمرة أو مؤكسدة يتم إضافة •

-إلى بيئة النمو هيوج% 0.5سكر الجلوكوز بتركيز

. Hugh and Liefsonوليفسون

التغيرات في بيئة النمو لبن عباد الشمس

Litmus Milk :

.يضاف عباد الشمس كدليل إلي هذا بيئة النمو الذي يحوي اللبن –

.اللبن مادة غنية تنمو عليها العديد من أنواع البكتيريا –

وتختلف قدراتها علي إحداث التغيرات العديدة في بيئة النمو •

: وهي

تخمر سكر الالكتوز وإنتاج حمض يتغير لون الدليل إلى األحمر •

( . بكتيريا مخمرة )

. إنتاج قلوي ويتغير لون الدليل إلى األزرق الغامق •

إحداث تخثر حمضي لترسب مركبات الكالسيوم وذلك بتغير لون •

. الدليل إلى اللون األحمر

إنتاج تخثر مع غاز ويكون بوجود تخثر يتخلله فقاعات •

. غازية وتغير اللون الي األحمر

هضم كازين اللبن حيث يالحظ بان يصبح أعلي بيئة النمو •

.سائل صافي بني اللون وتخثر في قاع األنبوبة

لتغيرات في بيئة النمو أجار الحديد الثالثي

: Triple Sugar Iron Agar( TSI) السكر

وهو من بيئة النمو الهامة للتعرف علي البكتيريا التي •

بعائلة المعوية

ويحتوي علي ثالث مواد سكرية وهي الالكتوز •

.والسكروز والدكستروز أو الجلوكوز

للجزء العلوي slantتحضر بيئة النمو علي شكل مائل •

بأنابيب االختبار والجزء الغليظ من بيئة النمو بالقاع

. buttويسمي

:ومن أهم التغيرات التالية•

مائل قلوي أحمر اللون والجزء الغليظ حمضي أصفر اللون • . يدل علي تخمر سكر الجلوكوز أو الدكستروز فقط

مائل حمضي أصفر اللون وكذلك الجزء الغليظ بالبيئة •حمضي أصفر اللون يدل علي تخمر الالكتوز أو السكروز أو

. االثنين معا ويدل كذلك علي تخمر سكر الجلوكوز

ظهور لون أسود بالبيئة يدل علي إنتاج غاز كبريتيد •اإليدروجين وكذلك وجود الغاز يستدل عليه بوجود فقاعات

.هوائية

: Starch hydrolysisاختبار تحلل النشا

amylaseالبكتيريا التي تستخدم النشا تفرز أنزيم األميليز

.وتحول النشا إلي مالتوز وجلوكوز ودكسترين •

لمعرفة ذلك يتم إضافة قطرات من يود غرام إلى •

مستعمرات البكتيريا النامية في بيئة النمو أجار النشا

. ينتج عنها ظهور هاالت صافية حول المستعمرة

لذي ليس به مستعمرات بكتيرية يظهر جزء بيئة النمو ا•

وكذلك حول المستعمرات بلون ازرق لعدم قدرتها علي

.إفراز ذلك اإلنزيم

:اختبار إنتاج كبريتيد اإليدروجين

بعض أنواع البكتيريا تستخدم أحماض أمينية تحتوي علي •والسستين cystine كبريت مثل السستئين

Cystein ويتصاعد غاز كبريتيد اإليدروجين ذو الرائحة الكريهة

والذي يمكن الكشف عنه بوجود الرصاص والحديد حيث •يتفاعل معها مكونا كبريتيد الحديد أو الرصاص ذو اللون

.األسود

kliglersيستخدم لهذا الغرض بيئة النمو آجار كليغلر •agar الذي يحتوي علي كبريتات الحديدوز.

Liquefactionاختبار إسالة وتحلل الجيالتين

and hydrolysis of gelatin :

الجيالتين مادة بروتينية يمكن لبعض البكتيريا تحليلها

ويعتبر من االختبارات الهامة في تمييز أنواع البكتيريا •

.المختلفة وتصنيفها

% 12تستخدم بيئة النمو المرق المغذي المضاف إليه •

والبكتيريا القدرة علي إسالة تلك بيئة النمو تقوم جيالتين

وهذه اإلسالة ال , gelatinaseبإفراز إنزيم الجيالتينيز

.تتصلب بالتبريد

: fat Hydrolysisاختبار تحلل الدهن

عند نمو بعض أنواع البكتيريا مثل كلوستريديوم علي •

تتكون هاالت صافية حول , بيئة النمو أجار صفار البيض

المستعمرات

التي تعمل lecithinaseنتيجة إلفراز أنزيم اللستينيز •

.علي مادة اللستين الدهنية في صفار البيض

اختبارات قدرة البكتيريا علي تحلل البروتينات

واألحماض األمينية

:ويستدل عليها باآلتي : •

نمو بعض أنواع من البكتيريا في بيئة النمو اللحم المطبوخ •cooked meat يظهر اللون األسود لقطع اللحم والرائحة

. الكريهة نتيجة تحلل البروتين

بعض أجناس من البكتيريا تسبب تخثرا وانفصال السائل عنه في • .بيئة النمو لبن عباد الشمس نتيجة هضم الكازين

.إسالة الجيالتين وتخثر البالزما •

.تحلل الحمض االميني تربتوفان إلى أندول •

تصاعد غاز كبريتيد اإليدروجين نتيجة تحلل األحماض األمينية • .المحتوية علي كبريت

Nitrateاختبار اختزال النترات . 16

reduction test :

بعض أنواع من البكتيريا تستخدم األكسجين الموجود في النترات •

كمستقبل لإليدروجين

وبالتالي تختزل النترات إلى نيترايت ويحدث ذلك في وجود أنزيم •

. nitratase or reductaseنترتيز أو ريداكتيز

,تعطي العينات الموجبة لونا أحمر •

, أما العينات السالبة وللتأكد منها يضاف القليل من مسحوق الزنك •

)سالبة (فادا تحول اللون إلى األحمر يدل علي وجود النترات

وإذ لم يتغير اللون فهذا يدل علي عدم وجود النترات وبالتالي تم •

.اختزالها إلى أمونيا أو نيتروجين أو أمين الهيدروكسيد

بعض الطرق الحديثة المستخدمة في أجراء االختبارات • :الكيموحيوية للتعرف علي أنواع البكتيريا

يمكن دراسة تأثير نوع معين من البكتيريا علي عدد من المواد –السكرية وكذلك أجراء بعض االختبارات الكيموحيوية للتعرف

علي ذلك النوع في آن واحد باستخدام طرق حديثة مثل

• Enterotube Roche- api20A-api20E- apiStrep . تعتبر هذه الطرق اقتصادية وسريعة وذات

نتائج جيده وأفضل من استخدام الطرق القديمة في تحضير بيئة النموات والمواد التي تدخل في أجراء

.االختبارات الكيموحيوية