السكرياتعن االختبارات للكشف

دكتور يوسف الشريك

Dr. Yousef Elshrek

للكربوهيدرات وصفية اختبارات•

:االختبارات من الغرض•

عن مختلفة كمواد الكربوهيدرات على التعرف1. .والبروتين اللبيدات

.المختزلة وغير المختزلة السكريات بين التمييز2.

.والعديدة والثنائية االحادية السكريات بين التمييز3.

.الكيتوزي والسكر االلدوزي السكر بين التمييز4.

الخماسية االحادية السكريات بين التمييز5. السداسية األحادية والسكريات (البنتوزات) ( الهكسوزات)

: للكربوهيدرات ما يليالوصفية اللونية وتتضمن االختبارات • اختبار الذوبانية• اختبار موليش • اختباراالنثرون• اختباربندكت • اختبار حمض البكريك • اختباربيال• اختبار بارفويد • اختبار تكوين بلورات االوزازون • اختبارسلفانوف • . اختبار اليود • اختبار فهلينج• اختبار سيلفانوف•

الذوبانية اختبار• :االختبار من الغرض•

والسكريات جهه من والثنائية األحادية السكريات بين التمييز• .أخرى جهة من (الالسكريات) العديدة

:االختبار أساس•

الماء في للذوبان قابلة والثنائية األحادية السكريات•

شحيحة فإنها جزيئاتها لكبر فنظرا العديدة السكريات أما • تكون فإنها ذابت وإذا الماء في الذوبان عديمة أو الذوبان .ما نوعا معكرة وتظهر غروية محاليل

:العمل طريقة •

من قليلة كمية برج وذلك حدة على مادة كل ذوبانية اختبر • .الساخن الماء مع ثم أوال البارد الماء مع المادة

اللونية االختبارات• الكربوهيدرات عن للكشف موليش اختبار

السكرية البروتينات مع إيجابية تفاعالت يعطي أن يمكن•

سكر وجود عدم على التفاعل سلبية تدل•

والسكر السكرالخماسي، مع المركز الكبريتيك حامض يتفاعل • من الفورفورال وينتج ، الماء جزيئات بعض وينزع السداسي،

من فـــــــــــــورفورال ميثيل وهيدروكسي ، الخماسي السكر . السداسي السكر

مركب يتكون حيث نفثول، الفا مع يتفاعل أن منهما لكل يمكن• ينزع) االنفصال سطحي بين كحلقة يظهر ، بنفسجي أحمر

الذي الفرفورال مركب لينتج ماء جزيئات 3 الكبريتيك حامض (. اللون بنفسجية حلقة ويكونا نفثول األلفا مركب مع يتحد

موليش إلثبات وجود السكر طريقة إختبار أساسيات اإلختبار المواد المطلوبة

حامض الكبريتيك المركز1.

مل 100+ جم من ألفا نفتول 5% )5ألفا نفتول 2.

.كحول اإليثيلي

لونا لتعطي نيفتولتتفاعل السكريات مع ألفا

بنفسجيا

طريقة العمل

.مل من المحلول السكري في أنبوبة األختبار 2يضع 1.

.نفثولقطرات من ألفا 3 – 2يضاف 2.

.مل من حامض الكبرتيك المركز 1يضاف بهدوء على السطح الداخلي لألنبوب 3.

الطبقتينيالحظ تكوين لون بنفسجي عند السطح الفاصل بين 4.

Anthrone Test االنثرون اختبار•Anthrone is a tricyclic aromatic ketone.

•It is used for a popular Cellulose assay and in

the colorimetric determination of carbohydrates

الطرق أسهل من Anthrone االنثرون اختبار طريقة تعتبر•

الكربوهيدرات عن للكشف اللونية

يميل أخضر لونا وتنتج الكربوهيدرات كل مع المادة هذه تتفاعل•

.Blue-green للزرقة

الكلية الكربوهيدرات تقدير حالة في ومفيد سريع األنترون اختبار•

.المختلفة السكريات أنواع لمعرفة الحاجة عدم عند أو

إلثبات وجود السكر إنثرون إختبار أساسيات اإلختبار المواد المطلوبة

حامض الكبريتيك المركز1.

حامض كبرتيك مركز2.

جم من اإلنثرون ويكمل 0.2يضاف % ) 0.2إنثرون 3.

(مل 100حامض الكبرتيك المركز إلى

مع حامض تعطي السكريات

الكبرتيك لونا أزرق مخضر بعد

تسخينها مع حامض الكبرتيك

المركز

طريقة العمل

االختبارأنبوبة مل من المحلول السكري في 1 – 0.5ما بين يضع 1.

.مل من كاشف اإلنثرون 4يضاف 2.

يمزج جيدا3.

.دقائق 10يسخن األنبوب في حمام مائي لمدة 4.

يالحظ ظهور اللون األزرق المخضر5.

الغذائية المواد في الكربوهيدرات عن الكشف :األجهزة•

األلوان لتقدير ولومب بوش جهاز1.

اختبار، أنابيب الجهاز، أنابيب 2.

.يغلي مائي حمام3.

:Reagents المحاليل

مادة من جم1.0 أذب :(%72 كبريتيك حامض في %0.1) االنثرون محلول 1.

وهذا .لتر 1 إلى واكمل المبرد (%72) الكبريتيك حامض محلول في االنثرون

إذا المحلول طرح ويجب م،4 حرارة درجة في حفظ إذا أيام لعدة ثابتا يكون المحلول

.جديد محلول وعمل األخضر إلى لونه تغير

.(%0.02) الجلوكوز محلول2.

pH الـ وتضبط فقط ماء مل76 في الكالسيوم كلوريد جم55) كلورايد كالسيوم محلول 3.

.(2 إلى الثلجي الخليك حمض بواسطة

الحامض من جمTrichloroacetic acid (100 الكلور ثالثي الخليك حمض محلول4.

.(مقطر ماء مل100 في

.%80 ايثيلي كحول5.

:Procedure طريقة

( Duplicate) اختبار أنبوبة في العينة من ملجم 400 توزن1.

.جافة كانت إذا العينة إلى الكحول من مل 2 يضاف2.

العينة إلى الكالسيوم كلوريد محلول من مل12 يضاف3.

جلتنة تتم حتى دقيقة، 30 لمدة يغلي ماء حمام في االختبار أنبوبة تسخن4.gelatinization الكربوهيدرات وذوبان النشا:

المادة جلتنة لتفادي آلخر حين من زجاجي قضيب بواسطة العينة خلط يجب1) .الغرفة حرارة درجة إلى بارد ماء في األنبوبة تبرد .األنبوب قاع في الغذائية

األنبوبة وتغسل مل100 سعة معياري دورق إلى كميا األنبوبة مكونات تنقل2) .الدورق إلى الغسيل ويضاف مقطر بماء مرات عدة

إلى مقطر بماء ويخفف الكلور ثالثي الخليك حامض محلول من مل5 يضاف3) .العالمة

عدة الدورق تقليب بواسطة جيدا المكونات وتخلط المعياري الدورق يقفل4) مرات

.مترسب بروتين أي من للتخلص 42 رقم واطمان ورقة على المكونات ترشح5)

اختبار أنبوبة إلى الدورق من مل 0.5 ،0.2 ،0.1 تنقل4.

مل 0.5 تحوي التي األنبوبة إلى المقطر الماء من مل 0.5 تضاف5.

.مل1 األنابيب جميع حجم لتوحيد الراشح من

(%0.2) الجلوكوز محلول من مل1 و 0.8 ،0.5 ،0.4 ،0.2 تنقل 6.

.اختبار أنابيب إلى

أيضا .مل1 إلى الحجم ليكمل أنبوبة كل إلى المقطر الماء يضاف7.

مقطر ماء مل1 من (بالنك) الكنترول أنبوبة تحضر8.

التسخين أثناء عليها للتعرف األنابيب جميع على عالمة تضع9.

.والتحليل

.بارد ماء في األنابيب جميع تغمر10.

من للتأكد جيدا األنبوبة وترج االنثرون محلول من مل 4 تضاف11.

.األنبوبة قاع حتى كلها المكونات خلط

10 لمدة وتسخن يغلي ماء حما في األنابيب توضع4.

درجة إلى بارد ماء في جيدا األنابيب تبرد ثم دقيقة،

.الغرفة جرارة

تركيز حسب تدريجية بطريقة اللون ظهور من تأكد5.

الكنترول التجربة تكون أن ويجب الجلوكوز محلول

.األلوان أخف

Spectronic 20) األلوان تقدير جهاز يشغل6.Colorimeter)

.االستخدام بدء قبل ليدفأ دقائق 10 مدة يترك7.

نانومتر 620 إلى الموجة طول يضبط8.

:التالي الشكل في العينات تحضير طريقة9.

-:طريقة حساب تركيز السكر بالمعادلة التالية

الكربوهيدرات عن للكشف اختباراليود• amylose and أميلوبكتين و أميلوز إلى النشاء تجزئية يمكن•

amylopectin

%90 – 80 و أميلوز % 20- 10 من طبيعيا النشاء يتكون• أميلوبكتين

.(4-1)ألفا بروابط يرتبط الجلوكوز من خطي (بوليمر) أميلوز•

عن عبارة منها وحدة كل الوحدات من آالف عدة من يتركب • الجلوكوز

.النشاء مركبات أحد من يعد أنه كما•

يذوب ال ) أميلوبكتين هضم سرعة بنفس النشاء أميلوز يهضم ال• ولذلك أقل حجما يشغل لكنه و للنشاء، الثاني المركب ،(الماء في النبات عند للتخزين يفضل فإنه

هو المسؤول عن تكوين اللون األزرق الداكن عند تفاعل اليود مع Amyloseأميلوز

The iodine molecule slips inside)النشا ، بسبب تسلل اليود داخل لفات األميلوز

of the amylose coil )

طريقة اختباراليود

(وجود النشاء الكشف عن) اليود إختبار أساسيات اإلختبار المواد المطلوبة

من محلول اليودإلى 0.005يضاف -:اليود محلول1.

من الجلوكوز % 1من محلول يود البوتاسيوم إلى % 3

، السكروز ، الجليكوجين ، السليلوز

مع اليود اللون يعطي النشاء1.

األزرق الداكن المعقد

يعطي جلوكوز اللون البني 2.

المحمر

ويعطي اليود اللون البني ألى 3.

بنفسجي مع الجاليكوجين

وينتج اللون األزرق مع ديكسترين 4.

الناتج من تحلل النشاء

طريقة العمل

مل من المحلول المراد الكشف عن النشائ فيه 1يضع في أنبوب اختبار 1.

اليود قطرات من محلول 5 – 4يضاف 2.

يمزج جيدا، ويالحظ تشكيل اللون من عدمه3.

المعدل اختبار بارافويد•MODIFIED BARFOED’S TEST

يستخدم هذا االختبار للتمييز بين السكريات األحادية والثنائية•

ويتطلب في هذ االختبار بأن تحتوي النشويات على سكريات المختزلة•

وعليههه يعطههي اختبههار بههارافود سههرعة تكههوين اللههون مههع السههكريات األحاديههة • ( سكريات المختزلة) أسرع من السكريات الثنائية ( سكريات المختزلة)

.قد تكون أو ال تكون السكريات الثنائية غير المختزلة لونا مع محلول بارافود•

يتكههون محلههول بههارفود مههن أسههيتات النحههال وحههامض الخليههك ، الههذي يسههبب •إلهى مركهب +Cu2اختزال مركب النحال الهذي يحمهل ثنائيهة الشهحنة الموجبهة

Cu2Oليكون أكسيد النحال +Cuأحادي الشحنة الموجبة

وهذا يحدث بسبب أكسدة السكريات األحادية في المحلول الحامضي الضعيف•

ويمكن أيضا أختزال السكريات الثنائية أيونات النحال ، ولكن أبطأ من إختهزال • السكريات األحادية ، وينتج عن ذلك اللون األحمر البني في المحلول

إلى مولببديك فوسفو بولي حامض اختزال األحادية السكريات وتقوم•

األزرق فوسفومومولبيدينيوم اللون ليكون فوسفومولبيديت لون

.المختزلة األحادية السكريات والفراكتوزمن الجلوكوز من كل يعتبر•

بارفورد محلول مع الداكن األزرق اللون تكون السكريات هذه•

ولكن بارفورد محلول مع الداكن األزرق اللون يكون سوف مالتوز سكر•

.والفركتوز الجلوكوز مع تكوينه بسرعة ليست

على دليال الداكن األزرق اللون تكوين يعتبر ال الحالة هذه مثل ففي •

.التفاعل ايجابية

، بارفود محلول مع سكروز تفاعل نتيجة الداكن األزرق اللون يتكون وال• .مختزال غير سكرا يعتبر ألنه

األحادية السكريات من والفراكتوز الجلوكوز من كل يعتبر•

.المختزلة

محلول مع الداكن األزرق اللون تكون السكريات هذه•

بارفورد

محلول مع الداكن األزرق اللون يكون سوف مالتوز سكر•

والفركتوز الجلوكوز مع تكوينه بسرعة ليست ولكن بارفورد

الداكن األزرق اللون تكوين يعتبر ال الحالة هذه مثل ففي

.التفاعل ايجابية على دليال

مع سكروز تفاعل نتيجة الداكن األزرق اللون يتكون ال•

.مختزال غير سكرا يعتبر ألنع ، بارفود محلول

غير المعدلة( للتمييز بين السكريات األحادية والثنائية) Barfoedبارفود إختبار

أساسيات اإلختبار

كاشف بارفورد مكونات

(cupric acetate)جم من أسيتات النحاس 13.3يذاب

مل من الماء 200في

Glacial)مل من حامض الخليك الثلجي 8يصاف إليه

acetic acid)

السكريات بين للتمييز بارفود اختبار يطبق

يتكون والذي الثنائية والسكريات األحادية

أحمر راسب تكوبن سرعة خالله من

، دقائق 5 خالل (النحاسي أكسيد) يجوري

12 – 7 إلى الثنائية السكريات تحتاج بينما

دقيقة

طريقة العمل

مل من المحلول السكري في انبوبة االختبار 1يضع 1.

مل من الكاشف بارفورد2يضاف 2.

يخلط جيدا3.

بمحتوياته في حمام المواد المطلوبةيضع األنبوب 4.

دقائق 5ماء يغلي لمدة

يالحظ ظهور احمر يجوري من عدمه. 5

)SELIWANOFF’S TEST ( Aldoses اختبار سيلفانوف للتمييز

بين الكيتونات واأللدهيداتيعتمد هذا االختبهار بهان سهرعة تهأثير الحهرارة علهى الكيتونهات أسهرع مهن تأثيرهها علهى •

(األلدهيدات)ألدوزات

وعليههه فهههو يسههتخدم فههي التمييههز بههين الكيتونههات وألههدوزات التههي تعتمههد علههى سههرعة •

التفاعل لكل منهما

األلدهيداتلقد وجد بأن سرعة تفاعل في وجود الكيتونات أسرع من وجود •

5إلهى ( تجفيهف)بنهزع المهاء ketohexosesيحهول محلهول سهيلفانوف كيتوهيكسوسهات•

هيدروكسي فورفورال

ريزورسينول مع فورفورال هيدروكسي 5 يتفاعل ذلك بعذ•resorcinolليكون المحلول مكونات ضمن من الموجود

وعشرة الكيتونية سكريات مع دقيقتين خالل األحمر اللون .Aldohexoses ألدوهيكسوسات مع دقائق

سيلفانوف للتمييز بين السكريات الكيتونية األلدهيديةإختبار أساسيات اإلختبار

من الريزورسينول إلى 0.05يتكون الكاشف من إضافة

حامض هيدروكلوريك المركز

وجود في (كيتوني) فركتوز سكر يعطي

األحمر اللون سيلفانوف كاشف

من أكثر ليس قصير وقت في الوردي

دقيقتين

السكريات مع اللون نفس ويعطي

.دقائق 10 بعد األلدهيدية

طريقة العمل

مل من محلول السكري المراد اختباره 1إلى انبوبة االختبار ينقل1.

مل من الكاشف 2يضاف عليع 2.

يمزج جيدا3.

دقائق 5يضع في حمام مائي يغلي لمدة 4.

يالحظ ظهور اللون5.

يحسب زمن بداية ظهور اللون6.

مجموعة على تحوي أي مختزلة سكريات معنى•

بين يميز الذي هو السلفانوف ... كيتونية أو ألدهيدية

مع إيجابية نتيجة يعطي حيث والكيتونية األلدهيهية .الكيتونية السكريات

أنه مع جفهلن باختبار سلبية نتيجة أعطى السكروز•

(كيتوني) والفركتوز (ألدهيدي) الجلوكوز من يتألف

األلدهيدية مجموعةال بين يتم اإلرتباط ألن وذلك

... المخنزلة الصفة إخفاء إلى أدى مما والكيتونية

بوسط بالتسخين يتم فإنه السلفانوف باختبار أما•

الجلوكوز إلى وزرالسك فصل إلى يؤدي مما مضياح .إيجابية نتيجة إعطاء إلى أدى مما والفركتوز

ال يحدث أي تغير في اللون األزرق كيتون

يتكون راسب من أكسيد النحال أحمر داكن اللون ألدهيد

فهلينج اختبار• األساسيات، نفس لهما االلتان بنديكت محلول أو فهلينج محلول ستخدام•

.القلوي المحلول في المعقدة Cu+2 النحال ايونات على يحتويان وكالهما

أيونات مع ، المعقدة Cu+2 النحال أيونات على فهلينج محلول يحتوي•

هيدروكسيد ترسب يمنع الذي الصوديوم هيدروكسيد محلول في ترترات

.النحال

السيترات أيونات مع المعقد النحال أيونات على يحتوي بنديكت محاليل•

النحال أيونات من المعقد المكون .الصوديوم كربونات محلول في

. النحال كربونات ترسيب يمنع والسيترات

ألدهيد من قطرات بضعة تضاف بحيث الطريقة، بنفس المحاليل كل تستخدم•

مائي حمام في بلطف تسخين مع جيدا ووخلطهما كاشف، إلى كيتون أو

:.التالية النتيجة يعطي دقائق لبضع الساخن

في +1Cuإلى Cu+2تختزل األلدهيدات أيونات النحاس من •

المحلول القلوي، وفي نفس الوقت تتأكسد األلدهيدات لتكون :ملحا كما هو موضحا في التفاعالت التالية

• 2Cu2+complexed+2OH− +2e - →Cu2O+H2O

:وضع األلدهيدات في المحلول القلوي كالتالي•

• RCHO+3OH−→RCOO−+2H2O+2e−

معادلة التفاعالت النهائية•

•RCHO+2Cu+2complexed+5OH−→RCOO−+Cu2O+3H2O

فهلينجإختبار أساسيات اإلختبار المواد

من جم 7 يذاب (أ) فهلينج محلول•

CuSO4.5H2O على يحتوي الذي المقطر الماء في

المخفف الكبرتيك حامض من قطرتين

البوتاسيوم الترترات من جم 35 يذاب (ب) محلول•

ماء مل 100 في الصوديوم هيدروكسيد من جم 12و

مقطر

البدء قبل مباشرة المحلوالن من الحجم نفس يمزج•

العمل في

م 60 درجة عند مائي حمام•

مع المختزلة السكريات تعطي

أحمر راس فهلينج كاشف

النحاس أكسيد من

طريقة العمل مع بعضهما( ب)و ( أ)مل لكل من المحلولين 15يخلط 1.

مل من خليط الكاشفين في أنبة اختبار فارغة2يضاف 2.

نقط من المحلول المراد اختباره إلى األنبوب 3يضاف 3.

عند النتيجة اإليجابية يالحظ ظهور اللون اللون األخضر معلقة في المحلول وراسب أحمر اللون دليل 4.

على وجود السكر المختزل

Bial's testاختبار بيال للكشف عن السكريات الخماسية• pentoseيستعمل هذا االختبار للكشف عن السكريات الخماسية •

-:يحتوي هذا االختبار المواد الكيمائية التالية•

أرسينول1.

حامض الهيدرو كلوريك 2.

وكلوريد الحديديك3.

في حالة وجوج السكر الخماسي سوف ينزع منه الماء بواسطة حامض الهيدروكلوريك • ليكمو الفورفورال

(وقد يشكل راسبا) يتفاعل الفورفورال مع األرسينول ليكونا اللون األخضر المزرق •

يعطي المحلول درجتان لطول الموجي لإلمتصاص أحدهما في المنطقة الحمراء بين • Dبالقرب من خط اآلخر CوBو Fraunhoferخطوط فراونهوفر

.فراونهوفرويمكن تقدير الطول الموجي ذات الصلة بهذا االختبار من خالل خطوط •

بيال للسكريات الخماسيةإختبار أساسيات اإلختبار المواد المطلوبة

مل حامض 10جم من األرسينول في 1.5يذاب 1.

الهيدروكلوريم المركز

قطرة من محلول كلوريد 30 – 20يضاف 2.

%(.10)الحديديك

حامض كبرتيك مركز3.

جم من اإلنثرون ويكمل 0.2يضاف % ) 0.2إنثرون 4.

(مل 100حامض الكبرتيك المركز إلى

الخماسية مع تعطي السكريات

كاشف بيال لونا أخضر مزرق،

في حين تعطي السكريات

السداسية اللون البني المصفر

طريقة العمل

االختبارأنبوبة كاشف بيال في مل من 2 يضع 1.

.مل من المحلول السكري 2إليه يضاف 2.

يمزج جيدا3.

.حتى ظهور اللونيسخن األنبوب في حمام مائي 4.

األخضر المزرقيالحظ ظهور اللون 5.

اختبار حامض البيكريك للسكريات المختزلة [C6H2(NO2)3OH] الصيغة الكيماائية .trinitrophenol (TNP)-2,4,6بعرف سابقا باسم

وهو عبارة عن بلورات صفراء اللون سامة يتفاعل مع المعادن ليكون راسبا معدنيا

ماهوجانييكون مع محاليل السكريات المختزلة اللون األحمر تضاف كربونات الصوديوم إلى المحلول ليصبح قاعديا

وعليه تقوم السكريات المختزلة ، إختزال حامض البكريك ذات اللون

الماهوجانياألصفر إلى حامض بكراميك ذات اللون األحمر أو األحمر

الجدول التالي يوضح األلوان الناتجة من التفاعالت السكريات المختزلة

وغير المختزلة

حامض البكريك للسكريات المختزلةإختبار أساسيات اإلختبار المواد المطلوبة

جم من حامض البكريك في الماء المقطر 13يذاب 1.

كربونات الصوديوم% 210.المختزلو اللون تعطي السكريات

األحمر أو األحمر الماهوجاني

طريقة العمل

مل من المحلول السكري في أنبوبة االختبار 1يضع 1.

.مل كربونات الصوديوم 0.5مل من حامض البكريك و1يضاف إليه 2.

يمزج جيدا3.

.يغلييسخن األنبوب في حمام مائي 4.

اللون األحمر أو األحمر الماهوجاني مع السكريات المختزلة يالحظ ظهور 5.

واألصفر غير المختزلة كما موضحة في الجدول السابق