1 מס' בביוכימיה מעבדה דו"ח

עמיר & בוטבול דויד המבורגר

ניסוי הכנת תמיסת-מגן

מטרת הניסוי:

תכנון והכנה של תמיסת-מגן )בופר( אצטט. כמו כן נבדוק את יכולת העמידות של הבופר (כאשר0.1M שלו, ואת עמידות הבופר בריכוז קבוע )Pka קרוב ל PHבריכוזים שונים, כאשר ה

משתנה.PHה

שיטות העבודה:

נשאר קבוע.PH( כאשר ה 2( כאשר הריכוז נשאר קבוע. 1נחלק את שיטות העבודה לשתיים: וב 0.1M חוליות התבקשו להכין תמיסת בופר בעלת ריכוז קבוע של 7בניסוי זה (1 PH

יפורט בסעיף התוצאות(. הבופר הוכן מחומצה אצטית ומהמלחPHשונים )טווח ה שבחוברת11 הרצוי השתמשנו בנתוני הטבלה בע"מ PHשלה כאשר על מנת להגיע ל

המעבדה. מיליליטר10( ו HCl מיליליטר של חומצה חזקה )10לכל אחת מתמיסות הבופר הוכנסו בנפרד

בשני המקרים.PH. בטבלה ריכזנו את השינוי ב (NaOH)של בסיס חזק חוליות אחרות התבקשו להכין בופר ב 4בניסוי זה (2 PH ובריכוזים משתנים כפי4.8

הוכנסו כאן גם בטבלה. חזק,10שמתואר ובסיס חזקה חומצה של מיליליטר רוכזו בטבלה. בניסוי זה טטרנו לצורך השואה בלבד מים על ידיPHוההפרשים ב

אותם חומרים על מנת שנוכל לראות את ההבדלים בכושר העמידות של בופר לעומתמים.

תוצאות:

: נוסחה מנחה

1 תוצאות עבור חלק

PH רצוי

ΔPH בפועל

ΔPH לאחר2הוספת ל"מ NaOH

ΔPH 2לאחר הוספת

ל"מ HCL

3.63.630.641.59

43.990.331.51

4.44.350.460.33

4.84.720.370.34

5.25.320.650.27

5.65.656.130.63

ב גרפי של השינויים ב PH תיאור בופר ובסיס חזקים לתמיסות בעת הוספת חומצה PH משתנה:

NAOH טיטור של הבופר ע"י

שינוי ב ph הבופר כתוצאה מהוספת בסיס ]בופרים בעלי PH שונה[

01234567

36.3 99.3 53.4 27.4 23.5 56.5

HP רמת ה

HP

הת

מבר

י נו

שיה

ישנה טעות מדידה מאחר ולא יתכן שינוי גדול יותר בבופר הנ"ל מאשר בקודמו שהנו Ph 4.4ב PH נמוך יותר, כאשר אנו צופים המגמה כללית יורדת.יתכן והטעות נובעת מקריאת מד Phב

שגויה,כיול שגוי של המכשיר,כלים לא נקיים.

HCL טיטור של הבופר ע"י

`

שינוי בPH הבופר כתוצאה מהוספת חומצה ]בופרים בעלי PH שונה[

0

5.0

1

5.1

2

36.3 99.3 53.4 27.4 23.5 56.5

HP רמת ה

HP

ב י

נושי

ה

ב Ph 4.8 ישנה טעות מדידה מאחר ולא יתכן שינוי גדול יותר בבופר הנ"ל מאשר בקודמו נמוך יותר, כאשר אנו צופים המגמה כללית יורדת.יתכן והטעות נובעת מקריאת מדPhשהנו ב

PH.שגויה,כיול שגוי של המכשיר,כלים לא נקיים

: 2 תוצאות עבור חלק

ΔPHריכוזלאחר הוספת

HCl 2 מל'

ΔPHלאחר הוספתNaOH 2 מל'

0.10.300.370.050.080.030.0252.456.820.012.656.68

3.956.22מים מזוקקים

גרפי של השינוי ב ובסיס חזקים, לתמיסות בופר בריכוזים PH תיאור בעת הוספת חומצה משתנים:

NAOH טיטור של הבופר ע"י

השינוי ב PH כתוצאה מהוספת בסיס חזק בריכוזי בופר שונים

0

1

2

3

4

5

6

7

8

מים מזוקקים1.050.0520.010.0

]M[ ריכוז הבופר

HP

ב

ויינ

שה

ישנה טעות מדידה מאחר ולא יתכן שינוי קטן יותר בבופר הנ"ל מאשר בקודמו0.01בריכוז

שגויה,כיול שגוי של המכשיר,PHשהנו בריכוז גבוהה יותר.יתכן והטעות נובעת מקריאת מד כלים לא נקיים.

HCL טיטור של הבופר ע"י

השינוי ב PH כתוצאה מהוספת חומצה בריכוזי בופר שונים

0

5.0

1

5.1

2

5.2

3

5.3

4

5.4

מים מזוקקים1.050.0520.010.0

]M[ ריכוז הבופר

HP

ב י

נושי

ה

דיון ומסקנות:

של תמיסות בופר המורכבות מחומצה אצטית ומהמלח הצמוד שלהPH בדקנו את השינוי ב שונים, זאת על מנת לבדוק את כושר העמידות של תמיסות הבופרPHבריכוזים שונים וב

לסביבה בה יתרחשו , ולדעת איזו היא תמיסת הבופר המתאימה ביותרPHהשונות לשינויי התהליכים.

המצבים :2הדיון מתייחס ל משתנה.PH וב (0.1M) בדיקה של תמיסות בופר בעלות ריכוז קבוע .1 קבוע וריכוז משתנה.PHבדיקה של תמיסות בופר ב .2

: 1 חלק של החומצה החלשה , השינוי בPka של הבופר קרוב יותר ל PHבחלק זה ראינו שככל שה -

PH קטן יותר, ועם התרחקות מאזור ה Pka )4.74( גדל השינוי ב PH.עד כדי פריצת הבופר הקרוב ביותר לPHכלומר, כושר העמידות של הבופר הוא הגבוה ביותר כאשר התמיסה היא ב

Pka.של החומצה שלה. PKa הקרוב ביותר ל PHכך שתמיד ע"מ ליצור תמיסת מגן יעילה עלינו לבחור ב

: 2 חלק בחלק זה של הניסוי ראינו בבירור, כי ככל שריכוז הבופר גבוה יותר, כך גדל כושר העמידות שלו, וככל שריכוזו נמוך יותר כך הוא רגיש יותר לשינויים. עובדה זאת ניתנת להסברה על ידי חישוב כמות המולים הקיימים בבופר של החומצה והמלח שלה, כאשר ככל שהריכוז שלהם גבוה יותר כך גם גדל מספר המולים בתמיסה ו"בנק היונים" הבסיסיים והחומציים למעשה גדול

רצוי.PHיותר-דבר המאפשר לתמיסת המגן לשמור על טווח מסקנות:

מן התוצאות עולה, כי בופר יהווה תמיסת מגן טובה ביותר כאשר הריכוז הוא אופטימאלי, שלו הקרוב Pkaכלומר הגבוה ביותר שניתן מבלי שישפיע על הריאקציה הנבדקת, וכאשר ה

ביותר שמתאפשר לסביבת הריאקציה המקורית, לדוגמה: האנזימים המפרקים בקיבה נמצאים ולכן כאשר נרצה לבדוק אותם במעבדה, עלינו להכין בופר מחומצהPH-2בסביבה חומצית של

.PH ככל הניתן. כל זאת על מנת לקבל את השינויים הקטנים ביותר ב 2 שלה קרוב ל Pkaשה בטבלה לראות שניתן כמו מזוקקים. מים של העמידות לכושר ניתנת נוספת התייחסות

היו דרמטיים, דבר המעיד על אי יכולתם של המים להוות תמיסת מגן.PHהשינויים ב כאן המקום לציין כי ישנה מגבלה לריכוז הבופר שנבחר , מאחר ומצב בו נכניס כמות גדולה של מלח לתמיסה יזיק לרקמות הביולוגיות מאחר ומלח הוא חומר שסופח מים ועלול להפריע

לרגולציית המים הנורמאלית הקיימת ברקמות.

קביעת נקודה איזואלקטרית של קזאין

תיאוריה: הנקודה האיזואלקטרית היא הנקודה בה המטען הכולל של החלבון שווה לאפס. בנקודה זונעה בהשפעת שדה חשמלי לא דהיינו-היא אינה מראה תכונות חשמליות, המולקולה והאינטראקציות שלה עם מולקולות המים הן מינימליות. לפיכך בנקודה זו רמת המסיסות של החלבון במים היא נמוכה ביותר. עקרון קביעת הנקודה האיזואלקטרית מתבסס על כך שככל שנתרחק מנקודה זו )הנקודה האיזואלקטרית ( יתגברו האינטראקציות עם מולקולות

המים והקזאין יתמוסס בצורה טובה יותר, ובנקודה האיזואלקטרית עצמה נקבל משקע.מטרה:

קביעת הנקודה האיזואלקטרית של קזאין.מהלך הניסוי:

. 5.6 עד 3.6 עולה מ PH מבחנות שמכילות בופרים ב 11העברנו תמיסת קזאין ל בסופה של המעבדה ביצענו הבחנה באופן ויזואלי בשקיעת הקזאין בכל אחת מהמבחנות.

תוצאות:על להצביע אין אפשרות איכותי, בניסוי ומדובר הייתהPHהיות בו השקיעה מסוים

בו לקזאין הייתה שקיעה מרבית.PHמקסימלית, אולם נוכל להצביע על טווח ה )4.8- 4.6המבחנה בה נצפתה שקיעה מרבית היא PHעל מנת לקבוע את הנקודה . )

בופר אחרות צורך להכניס את תמיסת החלבון לתמיסות יש האיזואלקטרית המדויקת ולבצע מדידה ושקילה מדויקים יותר של המשקעיםPHבעלות הפרשים קטנים יותר ב

השונים שהתקבלו במבחנות השונות.דיון ומסקנות:

PH(. כלומר, טווח ה PH )4.7הערך הספרותי של הנקודה האיזואלקטרית של קזאין הוא שהתקבל אצלנו בניסוי תואם את הערך הספרותי.

שצוין בסעיףPHאפשר לומר בוודאות כי לקזאין מטען אפס, או קרוב לאפס בטווח ה התוצאות מאחר ובמקום להתמוסס הוא שקע. כמו כן נוכחנו לראות בצורה ברורה כיצד משפיע מטען של מולקולה על יכולת המסיסות שלה, ולהבין, שככל שמטען המולקולה קטן

יותר ככה קטנה גם יכולת ההתמוססות שלה מאחר והמים הם ממיס קוטבי.. דבר נוסף שיכול להשפיע על שקיעת החלבון הוא פיזור מטענים שונים לאורך שרשרתושליליים יכול להיות חלבון בעל מטענים חיובים החלבון. כלומר, חלבון שמטענו אפס בחלק מהשרשראות הצדדיות שלו,אשר נמצאות במרחק זו מזו, אותן שרשראות טעונותנטו של א.ם המטען אפילו על מסיסות החלבון, יכולות להשפיע או אחרת זו במידה יכולים לקיים אינטראקציות עם מולקולות והשיירים כולה הוא אפס מאחר המולקולה

המים באזור המקומי שלהם.

קביעת מרכיבי החלב: קביעה כמותית של חלבון החלב

מטרה:קביעה כמותית של אחוז הקזאין בחלב טרי.

מהלך הניסוי:..לפני הניסוי שקלנו כוס כימית ריקה יחד עם נייר סינון

6% מ"ל של חומצת חלב 1 מ"ל חלב טרי לכוס, ואליה הוספנו 20הוספנו . בדקנוPH בעזרת נייר – PH.את התוצאות השוונו אל מול הכרטסת . דקות.5שפינו את התמיסה למבחנת סירכוז והכנסנו לצנטרפוגה קלינית ל .קיבלנו שכבה של נוזל עילי נפרד שהוסר מהמבחנה, ומשקע של קזאין ושומן מ"ל ריאגנט 20הוספת folch .עד לשטיפה של כל המשקע מהמבחנה .סינון דרך משפך ביכנר דרך נייר סינון שהורטב גם הוא בריאגנט לתוך בקבוק מינק מ"ל נוספים של הריאגנט דרך נייר הסינון.20הוספת .העברת נייר הסינון יחד עם המשקע לכוס הכימית שנשקלה בהתחלה מעלות לאידוי הנוזלים.60חימום למשך לילה שלם ב .צינון ושקילה

תוצאות: גרם 32.232משקל כוס כימית + נייר סינון:

גרם.32.974משקל כוס כימית + נייר סינון + משקע קזאין:

0.742gr=32.974-32.232 :חישוב משקל נטו של הקזאין

מ"ל: 100 נפח תמיסה מקורית של – חישוב אחוז הקזאין בחלב על פי הנוסחה המתאימה 0.742 gr * 5 =3.71%

דיון ומסקנות:

שלו.PIידוע לנו כי בחלב קיים חלבון הקזאין אשר נחקר בניסוי הקודם למציאת ה .1ל .2 התמיסה את הביאה לחלב, החלב חומצת הנקודהPHהוספת שהוא

נבין שבצענו, הקודם הניסוי סמך על הקזאין. חלבון של האיזואלקטרית שבנקודה זו חלבון הקזאין יהיה זה שישקע.

לתמיסה באה במטרה לבצע את ההפרדה בין משקע הקזאין folchהכנסת ראגנט .3 והשומן ששקעו יחד, על מנת לקבל משקל אמין של הקזאין בלבד.

אחוז. על הפי התוצאות שהתקבלו אצלנו2.8 – 2.4על פי הספרות אחוז הקזאין בחלב נע בין אחוזים742. % מדובר באחוז שגיאה של 3.71אחוז הקזאין הוא

:חישוב אחוז השגיאה

ההפרשים בין הערכים נובעים מכמה סיבות: בשל נסיון מועט בעבודת מעבדה קיימים אי דיוקים גסים יחסית של קריאתא.

מדידות לאורך הניסוי, כמו כן העברת החומרים מכוס אחת לאחרת מספרפעמים מפחיתה מכמויות הנוזל האמיתיות.

במשקע שקיבלנו לאחר הסינון נכחו חומרים נוספים פרט לחלבון שאותו רצינוב. לבדוק, כגון שומן שלא הופרד בצורה מושלמת על ידי הריאגנט, כפי שהוסבר

.2בסעיף זמן לאג. כי סירכזנו במשך יתכן ואף יחסית גסה בצנטרפוגה הנה ההפרדה

מספק.ייתכנו שגיאות בשקילה לאחר האידוי בתנור.ד.

אלקטרופורזה

הסבר תיאורטי:

באופן כללי, אלקטרופורזה מפרידה בין חלבונים שונים ע"פ גודלם. שחובר לחלבון ומקנה לו מטעןSDSבשיטה אנו עוטפים את מולקולות החלבון בחומר הקרוי

את החלבון אנו שלילי לכל אורכו ואף גורם לפריסתו בשל המטענים הזהים הדוחים זה את זה. מכניסים לג'ל הבנוי בצורה של מעין רשת תלת-ממדית בעלת ריווח מסוים שאותו ניתן לקבוע ע"פ ריכוז הג'ל, אז אנו משרים שדה חשמלי על האזור בו נתון הג'ל ומכניסים את התערובותבשל מוגבלת ומידת התקדמותן החיובי הקוטב אל נעות המולקולות הנ"ל.כעת אל השדה הרשת שיוצר הג'ל כך שחלבונים קטנים נעים למרחק רב יותר מאשר גדולים יותר שנעצרים ברשת התלת-ממדית. חשוב לציין כי מטען החלבון אינו משפיע על מידת ההתקדמות שלו-רק

משקל\גודל החלבון הוא זה שקובע את מרחק ההתקדמות. לבקרה אנו נוסיף תערובת של סמנים אשר את משקלם אנו יודעים מראש ואף את מרחק הנדידה שלהם ברשת,ולאחר זמן מה נשטוף את עודפי הצבע מהמשטח ונבדוק את הסימנים

שהשאירו החלבונים בג'ל ביחס לתערובת הסמנים הידועים לנו. מטרה:

זיהוי חלבונים על ידי אלקטרופורזה.

מהלך הניסוי:

הוכנסהSDSהוספנו כן כמו הג'ל. לבארות עם ואותה הכנסנו הנבדקת, לתמיסת החלבון תערובת סמנים מוכרים, והשדה החשמלי הופעל. בסופה של המעבדה הג'ל נשטף עד לקבלת

הצילום, המצורף כנספח לדוח זה.תוצאות:

טבלת נתונים של תערובת הסמנים

מרחקהחלבון נדידה)מ"מ(

משקלמולקול

רי

Log משקל מולקולרי

 Myosin219400

05.28

β-galactosidase

5110000

5.04

Bovine serum

albumin

7660004.81

Ovalbumin15450004.65Carbonic

anhydrase25290004.46

Soybeen trypsin

inhibltor

32201004.3

Lyzozyme42150004.17

Aprotinin5560003.77

תאור גרפי של תערובת הסמנים

לוג המשקל בדלטון כפונקציה של מרחק הנדידה במ"מ

4031.5 + x9420.0- = y

R 25949.0 =

3

5.3

4

5.4

5

5.5

0 01 02 03 04 05 06

מרחק נדידה במ"מ

טוןדל

בל

קש

מה

ג לו

ניתן לראות שהקורלציה הנה גבוהה בגרף שקיבלנו כך שנוכל להשתמש במשוואת הישר ע"מלחשב את משקלו של חלבון נעלם ע"פ מרחק הנדידה שלו-וכך לזהות את החלבון.

בניסוי זה הכנסנו תמיסת חלבון בבאר אחת וסמנים בשנייה. להלן ממוצעי מרחק הנדידה שלשני החלבון שאותרו בתמיסה זו.

ריכוז מרחקי הנדידה של החלבונים הנבדקים באלקטרופורזה

2חלבון 1חלבון

מרחק 1נדידה 4351]מ"מ[

מרחק 2נדידה 4451]מ"מ[

ממוצע43.551]מ"מ[

על מנת למצוא את המשקל המולקולרי של החלבונים הנבדקים נציב את ערכי ממוצע מרחקיהנדידה במשוואת הישר של הגרף.

-0.0249*43.5mm+5.1304 = 4.04725→inv log 4.04725 =11,149.36 gr/mole 1חלבון = לוג-0.0249*55mm+5.1304 = 3.4869→inv log 3.486 9= 5766.33 gr/mole 2חלבון = לוג

דיון ומסקנות:

ההשוואה של משקלי החלבונים תתבצע אל מול הטבלה שלעיל.הוא 1משקלו המולקולרי של חלבון מס' 11,149.36gr/moleנוכל לראות שהוא הכי קרוב .

גדולה יחסית,החלבון השני משקלוLyzozymeבמשקלו לחלבון למרות שהסטייה הנה 5766.33gr/moleניתן להניח, כי מדובר בחלבון ניתן לומר זאתAprotinin , ומכאן . לא

בוודאות מכיוון שקיימים אלפי חלבונים ויתכן מאוד כי ליותר מחלבון אחד יש משקל מולקולרי דומה. עם זאת נתחשב בעובדה שיש תכנון מסוים בבחירת תערובת הסמנים בהתאם לחלבון

הנבדק, נוכל להסיק שזהו אותו חלבון.

נבדוק את אחוז השגיאה בזיהוי החלבונים

חלבון ראשון

חלבון שני

השגיאות בתוצאות יכולות לנבוע מכמה סיבות: שגיאות גדולות במדידת המרחקים של החלבונים הנבדקים ושל תערובת הסמנים, בשל.1

בנתונים בעלי מגבלת קריאה וכן שימוש ו מלימטר דיוק של השימוש בסרגל בעל מדויקת מבחינת הרזולוציה שלהם. )בדף המצולם הסימנים אינם בעלי גבולות חדים

)כתמים( ומדויקים ולכן נבחרה נק' אמצע ממוצעת לכל סימן(.

החלבונים,SDSבמקרה שה .2 המקורי של את המטען הרצויה בצורה ביטל לא והמעבר שלהם בשדה החשמלי אשר בתוך המתקן הושפע גם מהמטענים הללו.

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Myoglobin.png