微生物生长与繁殖 衡量微生物生长的指标

(1) 群体的重量

(2) 群体的数量

第七章 微生物生长与生活环境

群体水平

胡健 扬州大学环境科学与工程学院Email:huj@yzu.edu.cn

第七章 微生物生长与生活环境

第一节 微生物纯培养

第二节 微生物纯培养群体生长规律

第三节 微生物的生活环境

第一节 微生物纯培养

一、微生物纯培养的概念

实验室条件下，由一个微生物细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。

第一节 微生物纯培养

二、微生物纯培养技术

纯培养基本步骤：　　　　　

稀释平皿法划线法单细胞挑取法

纯培养方法

(2) 　 培　　养

　 (1) 　分　　离

第一节 微生物纯培养

二、微生物纯培养技术

1 、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。

基本过程：（ 1 ）梯度稀释过程；（ 2 ）分离培养过程

涂布倾注梯 度 稀 释 过 程

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

第一节 微生物纯培养

二、微生物纯培养技术

4) 操作要点： 无菌操作

稀释平板分离法使用过程中的几个问题

1) 梯度稀释度的确定：

需分离微生物在样品中的数量

2) 选择菌落接种的依据：

a 、菌落特征； b 、菌体的特征

3) 微生物纯培养的标准：

菌落特征一致性

2 、单细胞挑取法：

从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。

第一节 微生物纯培养

二、微生物纯培养技术

3 、平皿划线法 (P １３９图７ - ４ )

用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。

第一节 微生物纯培养

二、微生物纯培养技术

第一节 微生物纯培养

三、目标微生物纯培养筛选的基本思路

１、待分离样品的确定

２、培养基的选择

３、纯化过程环境条件的控制

　（温度、空气、 P Ｈ、抑制剂）

（Ｐ１３８－１４１）

（一）纯培养的保存试管斜面培养基低温、干燥、隔绝空气

第一节 微生物纯培养

四、纯培养的保存与复壮

1 、灭菌彻底

2 、棉塞大小要合适

3 、无菌操作

保存过程的注意点：防止杂菌污染。

（二）纯培养的衰退与复壮

第一节 微生物纯培养

四、纯培养的保存与复壮

衰退的原因：衰老、变异

衰退的表现：生长缓慢　　　　　　优良性状的丧失　　　　　　抗逆性下降

衰退的预防：控制继代频率　　　　　　创造良好的培养条件　　　　　　采取有效的保存方式

复　　壮狭义（被动）

广义（主动）

复壮方法：选　　优　　　　　汰　　劣

第二节 微生物纯培养群体生长规律

微生物生长的指标( 生物量的测定 )

细胞群体数量的增加

细胞群体总重量增加

从群体水平上衡量( 间接的测定方法 )

一、微生物生长量的测定

第二节 微生物纯培养群体生长规律

微生物生长量的测定

微生物数量的测定

显微镜直接计数法稀释平板计数法最大概率法比浊法

称重法含 N 量测定法DNA 含量测定法ATP 含量测定法代谢活性法

微生物重量的测定

( 一 ) 微生物数量的测定 1 、显微镜直接计数法 使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。

一、微生物生长量的测定

第二节 微生物纯培养群体生长规律

( 一 ) 微生物数量的测定 2 、稀释平板计数法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点：传统计数方法。对设备要求不高。

一、微生物生长量的测定

第二节 微生物纯培养群体生长规律

10-3

10-5

10-4

10-6

( 一 ) 微生物数量的测定 ３、比浊计数法　　　根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。 优点：简便，直接。

一、微生物生长量的测定

第二节 微生物纯培养群体生长规律

( 二 ) 微生物重量的测定 1 、称重法 用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。

　　 优 点：简单可靠。

一、微生物生长量的测定

第二节 微生物纯培养群体生长规律

在活性污泥法中采用的指标：

（ 1 ）混合液悬浮固体 (MLSS) （粗放测定）

污泥—干燥 ---- 称重 (W1)

（ 2 ）挥发性悬浮固体 (MLVSS) （相对准确）

上述已称重污泥 -----马福炉 (500 度 2 小时 )----冷却 --- 称重 (W2)

( 二 ) 微生物重量的测定 2 、含氮量测定法 根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。

一、微生物生长量的测定

第二节 微生物纯培养群体生长规律

原理：（ 1 ）微生物蛋白质含量稳定

（ 2 ）氮是蛋白质的稳定成分

(蛋白质量 =6.25× 总含 N 量 )

优点：测定准确。

二、细菌分批培养群体生长规律

第二节 微生物纯培养群体生长规律

分批培养：将少量的细菌接种到一定体积的液体培养基中，在适宜的条件下培养，最后一次性收获的过程。

生长曲线：细菌在新的适宜的环境中生长、繁殖、衰老、死亡的动态变化。

根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：

第二节 微生物纯培养群体生长规律

缓慢期 　对数期 　　　稳定期 　　 衰亡期

二、细菌分批培养群体生长规律

第二节 微生物纯培养群体生长规律

缓慢期（延迟期、滞留适应期）

滞留适应期

二、细菌分批培养群体生长规律

特 点：分裂迟缓、代谢活跃。

产生原因：

（ 2 ） 细胞分裂必需因子的缺乏

（ 1 ）接种时的机械损伤引

第二节 微生物纯培养群体生长规律

缓慢期（延迟期、滞留适应期）

4 、菌株的遗传性滞留适应期

二、细菌分批培养群体生长规律

研究滞留适期长短的意义？

影响滞留适应期长短的因素

1 、培养基成分

2 、接种物菌龄

3 、接种量

第二节 微生物纯培养群体生长规律

对数期（指数生长期）

特点： （ 1 ）代谢活性强 （ 2 ）世代时短而稳定

对数生长期

二、细菌分批培养群体生长规律

第二节 微生物纯培养群体生长规律

对数期（指数生长期）

对数生长期

二、细菌分批培养群体生长规律

见教材 P93

Nt=2n N0

n=3.33(lgNt-lgN0)

G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0)

n—— 繁殖代数

G——世代时 (每繁殖一代所需的时间 )

N0—— 对数生长期开始微生物数量

Nt—— 对数生长期经过时间 t 后微生物数量

第二节 微生物纯培养群体生长规律

稳定期（最高生长量期）

最高生长量期特 点：1 、细菌数量增加率为 0 。2 、部分细菌大量积累代谢产物。

细菌数量增加率为 0 的原因 ?

二、细菌分批培养群体生长规律

第二节 微生物纯培养群体生长规律

衰亡期

特 点：菌体活性降低、大量死亡； 细胞畸变、自溶 革兰氏染色不稳定

衰亡期

二、细菌分批培养群体生长规律

什么时期菌体代谢产物最多

什么时期细菌细胞代谢活性最强

什么时候细菌细胞总数最多

什么时期细菌细胞生长速度最快

什么时期世代时间短而稳定

对数生长期

最高生长量

最高生长量

对数生长期

对数生长期

第二节 微生物纯培养群体生长规律

小 结

二、细菌分批培养群体生长规律

第二节 微生物纯培养群体生长规律

三、连续培养

以一定流速输入新鲜培养液并流出培养物，确保流出的老菌数等于新增殖数，使培养保持对数生长的过程。

优 点：一定生理状态实验材料

提高工业生产效益

保持细菌培养液浊度

恒浊培养

第二节 微生物纯培养群体生长规律

三、连续培养

保持细菌培养液营养物质浓度

恒化培养

分批培养与连续培养特征的比较

第二节 微生物纯培养群体生长规律

相同点：群体培养特征

不同点：分批培养：经历四个时期

连续培养：理论上 , 对数生长期

第二节 微生物纯培养群体生长规律

三、同步培养

通过诱导或选择，使所有细胞处于同一生长阶段。

低于适温度 适温培养

2 、选择法：滤膜过滤

1 、诱导法：控制温度、培养基成分等

获得同步培养的方法

硝酸纤维薄膜法

同步培养生长曲线特点

第二节 微生物纯培养群体生长规律

三、同步培养

群体生长是一次性跳跃过程

维持的代数 1-2 代（？）

第三节 微生物的生活环境

极端环境条件对微生物的影响 死 亡

环境条件一定范围的变化，影响

形态生理生长繁殖

温度O2

氧化还原电位水分辐射化学药物pH

影响微生物生长的主要环境因子

第三节 微生物的生活环境

一、温度

1 、温度对微生物生长的影响

微生物的生长温度类型低 温 型中 温 型高 温 型

温度对微生物生长的影响

高温：蛋白质变性 酶失活 核糖体解体

致死时间、致死温度

低温：酶活性下降、新陈代谢缓慢

微生物的三种基本温度最低生长温度最高生长温度最适生长温度

第二节 微生物的生活环境

2 、高温灭菌

一、温度

高温灭菌

湿热灭菌

干热灭菌：干燥条件， 160℃维持 1-2h 。

高压蒸汽灭菌法：密闭条件下，水加热蒸发形成高压 的同时产生高温。利用高温杀死菌。

巴斯德消毒法：采用 60-70℃的温度处理 15-30min 的消毒方法。

间歇灭菌法： 100℃， 30-60min 冷却， 37℃培养 1d 反复三次

第二节 微生物的生活环境

3 、低温保藏

一、温度

菌种保存（试管斜面或孢子砂土管）

食品保藏

特例：流感杆菌、脑膜炎球菌

第二节 微生物的生活环境

二、氧化还原电位 (Eh)

好气性微生物 　　　 Eh>0.1V ，而以 0.3-0.4v为宜兼性厌气微生物　　　　 Eh<0.1V 行厌气性呼吸　　　　　　　　　　　 Eh>0.1v 行好气呼吸厌气性微生物　　　　　 Eh值— 0.1V 以下

第二节 微生物的生活环境

三、水分

1 、水分对微生物生长的影响：

细菌最适水的活度值： 0.93-0.99

酵母菌最适水的活度值： 0.88-0.91

霉菌最适水的活度值： 0.80

2 、应用：干燥法保存物品 食品的冷冻干燥

水的活度小于 0.60-0.70时

休眠、部分出现细胞脱水、蛋白质变性 ( 多数微生物 )

第二节 微生物的生活环境

三、辐 射

辐射：能量通过空间传递的一种物理现象。

1 、可见光：（ 400nm—800nm ） 对微生物的作用：

光氧化作用：有氧条件下，光线被细胞内色素吸收，使酶或其它敏感成分失活引起的微生物死亡。

（ 3 ）光氧化作用。

（ 1 ）能源（ 2 ）刺激担子菌子实体形成

2 、紫外线：

杀菌波长范围： 240—300nm

杀菌力最强范围： 255—265nm

第二节 微生物的生活环境

三、辐 射

紫外线杀菌特点： 穿透力弱，用作表面消毒或空气灭菌

3 、电离辐射

第二节 微生物的生活环境

三、辐 射

高能电磁波照射后发生的电离作用。

电离辐射对微生物的作用：

粮食、果蔬、畜禽产品、饮料以及卫生材料杀菌处理

低剂量 (500伦琴 ) ：促进生长、诱发变异

高剂量（ 10万伦琴）：杀菌作用

实际应用：

（ X射线、 γ射线等）

第二节 微生物的生活环境

四、化学药物

1 、重金属盐类

杀菌机理：

杀菌机理：与带阴电荷的菌体蛋白质结合使其变性（ Hg 、 Ag盐，与细菌酶蛋白的巯基结合）

2 、有机化合物（酚、醇、醛）

蛋白质变性

损伤细胞壁和膜

抑制酶系统 (脱氢酶、氧化酶等 ) ；

第二节 微生物的生活环境

四、化学药物

杀菌机理： 使蛋白质巯基氧化 ( 成二硫基 )

2R—SH+2X R—S—S—R+2XH

杀菌机理：

漂白粉 [Ca(OCl)2]及氯气 ：产生次氯酸盐和原子氧；

碘：与酶分子中的酪氨酸结合。

3 、氧化剂（高锰酸钾、过氧化氢、过氧乙酸）

4 、卤素（ Cl 、 I常见）

具有降低表面张力效应的物质。

第二节 微生物的生活环境

四、化学药物

直接干扰病原微生物的生长繁殖并用于治疗感染性疾病的化学药物。 （选择性的杀菌或抑菌）

5 、表面活性剂（新洁尔灭、消毒宁等）

杀菌机理：影响细胞生长、分裂

6 、化学治疗剂

抑制叶酸合成 如：磺胺类药物等。

杀菌机理：

抑制蛋白质合成 如：链霉素，红霉素、四环素、氯霉素等抑制肽聚糖合成 如：青霉素，万古霉素等。