Post on 20-Aug-2019
Wichtige (Säulen-)chromatographische Trennmethoden in der Proteinanalytik: Gelfiltration
Trennung nach Molekülgröße Ionenaustauschchromatographie
Trennung nach Ladung Adsorptions-/Verteilungschromatographie
Trennung nach Molekülpolarität Affinitätschromatographie
Trennung nach spezifischen Eigenschaften
Gelfiltration:
Start
Proteingemisch
Elution
kleine Proteinedringen in dieMatrix ein
großen Molekülensteht nur das Volumenausserhalb der Matrixzur Verfügung
Trennung
Trennung nach Molekülgröße
Charakteristische Größen eines Chromatographie-Gels
Vt VxVo
Vt = +Vo Vx
Gesamt-Volumen
Volumen derGelmatrix
Volumen derumgebenden
Lösung
VeREV =
Vo
Ve
relatives Elutionsvolumen
K av =Vo
Vx
Ve -
Verteilungskoeffizient
Vo Vt
Säulenvolumen
Absorp
tion
Ve1
Elutionsvolumen der jeweiligenProteinkomponente
K av
REV:
:
:
Ve3
Ve5
Eichkurve fürSephadex G-200
zur Trennung eignet sich derannähernd lineare Bereich der Kurve:
Fraktionierungsbereich
K av
1,0
0,7
0,1
Ausschluss-volumen
log Mr
empirirsche Beziehung zwischen dem Verteilungskoeffizientenund dem Molekulargewicht der eluierten Substanz
Trennung von Proteinen an Superdex 200 HR 10/30
1
4
5
6
7
Thyreoglobulin (Mr 669 kDa)
Ferritin (Mr 440 kDa)
Human-IgG (Mr 150 kDa)
Human-Transferrin (Mr 81 kDa)
Ovalbumin (Mr 43 kDa)
Myoglobin (Mr 17,6 kDA)
Vitamin B12 (Mr 1355)
(Chromatogramm nach GE Healthcare)
2
3
0.30
0.20
0.10
0
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
Volume (ml)
0
A 280 nm
Materialien für die Gelfiltration
Bezeichnung Materialtyp
Sephadex Dextran Sepharose Agarose Bio-Gel A Agarose Bio-Gel P Polyacrylamid
Zum Teil werden die Gele durch kovalente Quervernetzungen strukturell stabilisiert (Sephadex z.B. ist mit Epichlorhydrin quervernetzt). Die Porengröße ist abhängig von der Konzentration an Gelmaterial und Quervernetzer. So könne Gele mit optimalen Trennbereichen für unterschiedliche Proteine hergestellt werden, z.B.:
Bezeichnung Trennbereich (kDa)
Sephadex G-25 1,5 – 5,0 Sephadex G-50 1,5 – 30 Sephadex G-75 3,0 – 70 Sephadex G-200 5,0 - 800
Kationen-Austausch-Chromatographie
R
R
Träger-material
(poröse) Trägermaterialien:- Polystyrol-Harze,- Dextran - und Agarose-Gele
Ligand
+
3
Substituenten R:anionische Gruppen, z.B.
-SO (starker Austauscher)-COO (schwacher Austauscher)
Trennung von physiologisch im Blut vorkommenden Aminosäurendurch Kationenaustauschchromatographie
(Detektion mit Ninhydrin)
Anionen-Austausch-Chromatographie
R
R
Träger-material
(poröse) Trägermaterialien:- Polystyrol-Harze,- Dextran - und Agarose-Gele
Ligand
+
Substituenten R:kationische Gruppen, z.B.
-C H -NH-(C H ) + Diethylaminoethyl, DEAE( )
2 5 2 5 2schwacher Austauscher
+
-C H -N(CH ) + quarternäre Trimethyl-aminoethyl, Q(starker Austauscher)
2 5 3 3
Adsorptionschromatographie:
Verteilungschromatographie:
Trennung von Substanzen durch unterschiedlicheAdsorption/Desorption an Oberflächen
Trennung von Substanzen durch Verteilung zwischenzwei unterschiedlichen flüssigen Phasen
Si
Si
OH
OH
O
Si
Si
OH
OH
O
O
O
O
O
O
H
H
H
H
HH
H
H
H
H
CHCl3
CHCl3
Adsorptions-/Verteilungschromatographie
Probe
Probe
“ ” ChromatographieNormal Phase “ ” ChromatographieReversed Phase
stationäre Phase:meist Kieselgel (+ Wasserfilm)
polar stationäre Phase:(derivatisiertes Kieselgel)
unpolar
mobile Phase:(z.B. Wasser/Acetonitril)
polarmobile Phase:( z.B. Chloroform)
unpolar
Reversed-Phase-Chromatographie
Derivatisierung des Kieselgels mit Silanen: Oberfläche wird unpolar
stationäre Phase mobile Phase
unpolar polar
Die Phasen sind im Vergleich zur“normalen” Chromatographie an Kieselgelumgekehrt, daher der NameReversed-Phase-Chromatogaphie(RP-Chromatogaphie)
+ ClSi OH Si
R
R
2( )CH 17 CH3 Si O Si
R
R
2( )CH 17 CH3
HCl
R
Si O
O
Si O
SiR
R2
( )CH 17 CH3
SiR
2( )CH 17 CH3
CH3 CN H O2/
Silan
Analyt
-
Abs
orpt
ion
[220
nm]
Retentionszeit [min]
0.05
0.01
20 40 600
Sta
rt
Trennung tryptischer Peptide von Ferritin durchReversed-Phase-Chromatographie
Isokratische Elution, Gradientenelution
isokratisch:
Die Zusammensetzung des Fließmittelsbleibt während der Trennung konstant
Die Zusammensetzung des Fließmittelsändert sich während der Trennung hinzu höherer Elutionskraft
Gradient:
A BC
D
A B C D
A B C D
Zeit
Abs
orpt
ion
Abs
orpt
ion
Abs
orpt
ion
Zeit
Fließmittel 2(höhere Elutionskraft)
Fließmittel 1
Zeit
Det
ekto
r-S
igna
l
t R2t R1t 0
Zeit
Det
ekto
r-S
igna
l
t R2t R1t 0
Zeit
Det
ekto
r-S
igna
l
t R2t R1t 0
schlechte Auflösung,breite Peaks
gute Auflösung,scharfe Peaks (aufgrundhöherer Bödenzahl)
gute Auflösung aufgrundhöherer Selektivität
HPLC
Hochdruckgradientensystem (pro Fließmittel eine Pumpe)
Niederdruckgradientensystem
(High Pressure Liquid Chromatography,)Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Affinitätschromatographie Der Reinigungseffekt basiert auf der
- spezifischen Erkennung eines Proteins durch einen Antikörper oder - spezifischen Affinität eines Enzyms zu einem Inhibitor, Substrat oder Cofaktor
(bei Enzymen) Antikörper können direkt chemisch an geeignete Säulenmaterialien gekoppelt
werden. Das zu isolierende Proteine bindet beim Passieren der Säule an den Antikörper, die übrigen Proteine werden durch Waschen entfernt. Das gebundene Protein wird mit einem geeigneten Puffer, der den Komplex dissoziiert, isoliert.
Alternativ kann der Antikörper-Protein-Komplex über Protein A- oder Protein G-
gekoppelte Säulen isoliert werden.
Protein A and Protein G sind bakterielle Zellwandkomponenten, die primär die Fc-Region von Immunoglobulinen binden. Meist werden rekombinante Formen verwendet.
Species Subclass Protein A
binding Protein G binding
Human IgA variable — IgD — — IgE — — IgG1 ++++ ++++ IgG2 ++++ ++++ IgG3 — ++++ IgG4 ++++ ++++ IgM* variable — Goat — ++ Horse ++ ++++ Mouse IgG1 + ++++ IgG2a ++++ ++++ IgG2b +++ +++ IgG3 ++ +++ IgM* variable — Rabbit ++++ +++ Rat IgG1 — + IgG2a — ++++ IgG2b — ++ IgG3 + ++ Sheep +/— ++ * Purified using HiTrap™ IgM Purification HP columns Tabelle aus GE Healthcare Data File 18-1012-91 AC, zu Protein G Sepharose 4 Fast Flow