Určení rodičů(analýza paternity)

Techniky

• Dříve minisatelitový DNA fingerprinting alozymy, mtDNA

• Dnes převážně mikrosatelity

• Další možnosti:AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting

mikrosatelity

• Tandemová opakování krátkých motivů

• Např. (CTTT)n

• Někdy i složitější (CTTT)n (CA)n

• Vysoce polymorfní

• Jednoduchá dědičnost

• Využití: analýza paternity, identity, populační struktury…

CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

CTTTCTTTCTTTCTTTC

CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

PCRPolymerase chain reaction

(jak z málo DNA udělat hodně)

PCR

• Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá.

• Co se bude množit? To určí primery.

• Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu.

primer AGGGGACGTACACTCAGCTTTtemplát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA

primer

primer

DNAtemplátu

tento úsek se bude množit

Denaturace (obvykle 95°C)

při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA

Při ochlazení dojde k reasociaci

Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu

Některé se dostanou do blízkosti komplementárních míst

Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA

(obvykle 50 - 65°C)

V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena

Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu)

Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken

Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty

Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií

Při dalším zahřátí…

Ochlazení – nasednutí primerů 72°C vznik nových fragmentů

95°C denaturace

Alely se liší délkou

CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

CTTTCTTTCTTTCTTTC

CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

+

Fragmentační analýza

Probíhá v sekvenátoru

Elektroforéza

gel

kapilára

Elektroforéza

gel

kapilára

detektorlaserovýpaprsek

CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

CTTTCTTTCTTTCTTT

GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAprimer primer

GAAAGAAAGAAAGAAAprimerprimer

Fluorescenční značení

Multiplex

Více dvojic primerů v jedné reakci

Různé značení

Analýza se standardem

standard

Určení paternityMatka Otec Mládě 1 Mládě 2

Určení paternity prostým vyloučením

(simple exclusion)

Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4

55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439

56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297

57 90 98 230 254 212 232 267 297

58 98 98 188 254 216 232 233 275

59 90 90 184 195 196 204 233 273

60 98 98 130 195 220 232 233 439

Možní otci                 

73 94 98 200 243 184 188 305 379

1004 90 90 256 264 212 224 228 256

1005 90 90 228 274 180 196 245 289

1006 90 98 176 234 216 220 347 410

1007 90 98 146 214 216 220 267 297

25 90 90 168 230 204 212 267 301

1003 90 98 184 217 204 204 212 273

genotypy

Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4

55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439

56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297

57 90 98 230 254 212 232 267 297

58 98 98 188 254 216 232 233 275

59 90 90 184 195 196 204 233 273

60 98 98 130 195 220 232 233 439

                 

73 94 98 200 243 184 188 305 379

1004 90 90 256 264 212 224 228 256

1005 90 90 228 274 180 196 245 289

1006 90 98 176 234 216 220 347 410

1007 90 98 146 214 216 220 267 297

25 90 90 168 230 204 212 267 301

1003 90 98 184 217 204 204 212 273

Identifikace mateřských alel u mláďat(na prvním lokusu málo alel – nebudeme se jím zabývat)

Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4

55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439

56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297

57 90 98 230 254 212 232 267 297

58 98 98 188 254 216 232 233 275

59 90 90 184 195 196 204 233 273

60 98 98 130 195 220 232 233 439

                 

73 94 98 200 243 184 188 305 379

1004 90 90 256 264 212 224 228 256

1005 90 90 228 274 180 196 245 289

1006 90 98 176 234 216 220 347 410

1007 90 98 146 214 216 220 267 297

25 90 90 168 230 204 212 267 301

1003 90 98 184 217 204 204 212 273

Zjištěni shody otcovských alel s alelami sociálního partnera→ nalezení mimopárových mláďat

Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4

55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439

56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297

57 90 98 230 254 212 232 267 297

58 98 98 188 254 216 232 233 275

59 90 90 184 195 196 204 233 273

60 98 98 130 195 220 232 233 439

                 

73 94 98 200 243 184 188 305 379

1004 90 90 256 264 212 224 228 256

1005 90 90 228 274 180 196 245 289

1006 90 98 176 234 216 220 347 410

1007 90 98 146 214 216 220 267 297

25 90 90 168 230 204 212 267 301

1003 90 98 184 217 204 204 212 273

Dohledání genetických otců mimopárových mláďatmládě 57

Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4

55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439

56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297

57 90 98 230 254 212 232 267 297

58 98 98 188 254 216 232 233 275

59 90 90 184 195 196 204 233 273

60 98 98 130 195 220 232 233 439

                 

73 94 98 200 243 184 188 305 379

1004 90 90 256 264 212 224 228 256

1005 90 90 228 274 180 196 245 289

1006 90 98 176 234 216 220 347 410

1007 90 98 146 214 216 220 267 297

25 90 90 168 230 204 212 267 301

1003 90 98 184 217 204 204 212 273

Dohledání genetických otců mimopárových mláďatmládě 59

Databáze na internetu

DATABÁZE

Primární databáze DNA sekvencí

GenBank (Amerika) EMBL (Evropa) DDBJ (Japonsko)

Databáze genů

Entrez GeneRefSeq

Databáze genových expresních dat

UniGeneGEO

Databáze genomů

NCBIEnsemblUCSC Genome Browser

Důležité odkazy

PROGRAMY

BLASTNa stránkách NCBI, Ensembl

BLATNa stránkách USCS

Primer3 – navrhování primerů

In Silico PCR

RepeatMasker

NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tam najdu skoro vše: GenBank, Entrez Gene, UniGene, MapViewer, BLAST…

ENSEMBL - http://www.ensembl.org/Genome Browser, BLAST

USCS – http://genome.ucsc.edu/Genome Browser, BLAT, In Silico PCR

FASTA

>gi|gi-number|gb|accession|locus – description

GATCCTCCATATACAACGGTATCTCCACCTCAGGTTTAGATCTCAACAACGGAACCATTGCCGACATGAGACAGTTAGGTATCGTCGAGAGTTACAAGCTAAAACGAGCAGTAGTCAGCTCTGCATCTGAAGCCGCTGAAGTTCTACTAAGGGTGGATAACATCATCCGTGCAAGACCAAGAACCGCCAATAGACAACATATGTAACATATTTAGGATATACCTCGAAAATAATAAACCGCCACACTGTCATTATTATAATTAGAAACAGAACGCAAAAATTATCCACTATATAATTCAAAGACGCGAAAAAAAAAGAACAACGCGTCATAGAACTTTTGGCAATTCGCGTCACAAATAAATTTTGGCAACTTATGTTTCCTCTTCGAGCAGTACTCGAGCCCTGTCTCAAGAATGTAATAATACCCATCGTAGGTATGGTTAAAGATAGCATCTCCACAACCTCAAAGCTCCTTGCCGAGAGTCGCCCTCCTTTGTCGAGTAATTTTCACTTTTCATATGAGAACTTATTTTCTTATTCTTTACTCTCACATCCTGTAG

GenBank

• Obsahuje velmi podrobnou informaci o sekvenci:

Locus Základní vlastnosti sekvence (název, délka, typ)

Definition Výpis genů v sekvenci

Accession Databázové přístupové číslo

Version Verze dané sekvence

Keywords Pod kterými klíčovými slovy ji lze najít

Source organism Zařazení v systému

Reference Článek, kde byla daná sekvence publikována

Features Podrobný popis jednotlivých genů včetně jejich pozic

Origin Sekvence

Sekvence v genetické bance

• Jsou známy nějaké sekvence mamuta?• Z jakého druhu mamuta jsou známé sekvence?

(nejlépe cytochrom b)

NCBINational Centre for Biotechnology Information

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

• Chceme-li vyhledat sekvenci nejpodobnější k námi osekvenovanému neznámému vzorku, využijeme BLAST, opět na stránkách NCBI

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Čemu je tato sekvence podobná?

BLASTBasic Local Alignment SearchTool

===========================================

• Hledá lokální (částečné) podobnosti

• Na rozdíl od klasického alignmentu umožňuje velmi rychle a efektivně prohledávat velké databáze

Úloha

• Ze zbytků potravy medvěda v Pyrenejích jsem získal dvě sekvence. Čemu jsou tyto sekvence podobné?

• >sekvence1 atgaccaatattcgaaaaactcacccactaataaaaattgtaaacaacgcattcattgacctcccagctccgtcaaacatctcatcatgatgaaactttggctccctcctaggcatctgc

• >sekvence2 ctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctgaatcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatttctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagcctt cataggctatgtcctcccgtgaggacaaatatcattctga

• Postup: Na stránce NCBI zadám, že chci použít BLAST. Pod možnostmi Basic BLAST vyhledám nucleotide BLAST a zadám tuto možnost.Do okénka vložím sekvenci například ve FASTA formátu. V možnosti Database zadám Others. Spustím BLAST.