Post on 27-Dec-2019
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Ceren TAŞ
DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL
ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ADANA, 2009
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Ceren TAŞ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 30/06/2009 tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oybirliği/oyçokluğu ile kabul edilmiştir. İmza:……………… İmza:……………… İmza:……………… Doç.Dr.M.Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Doç. Dr. Sertaç Özer Danışman Üye Üye Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No:
Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve mühür
Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF 2008 YL 19 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ
I
ÖZ
YÜKSEK LİSANS
DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
Ceren TAŞ
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
Danışman : Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL
Yıl : 2009, Sayfa : 47 Jüri : Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL
Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Doç. Dr. M. Sertaç ÖZER
Bu çalışmada, Çukurova bölgesinde yetiştirilen Domat çeşidi zeytinden izole
edilen ve kısmen saflaştırılan polifenol oksidaz enziminin (PFO) optimum sıcaklık,
optimum pH, kinetik parametreler, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi gibi
biyokimyasal özellikleri araştırılmıştır.
Substrat olarak 4-metil kateşol kullanılmış ve enzimin Km değerinin 14.52
mM, Vm değerinin ise 1.73 Abs/dk olduğu bulunmuştur. PFO aktivitesi için optimum
pH değeri 4,5 olarak bulunmuş ve optimum pH’dan sonra enzim aktivitesinde hızlı
bir düşüş görülmüştür. Enzimin optimum sıcaklığı 30°C olarak bulunmuştur. Enzim
20-50°C gibi sıcaklık aralığında %70’in üzerinde aktivite göstermiştir. Enzimin
aktivasyon enerjisi (Ea) ve Z değerleri sırasıyla, 121 kj.mol-1 (r²=0.9496) ve 18.55°C
(r²=0.9532 olarak hesaplanmıştır. Denenen inhibitörlerden en düşük inhibisyon etkisi
askorbik asit’te görülmüştür.
Anahtar Kelimeler: Zeytin, enzimatik esmerleşme, polifenol oksidaz, kinetik,
termal inaktivasyon.
II
ABSTRACT
MSc THESIS
DETERMINATION OF BIOCHEMICAL PROPERTIES OF POLYPHENOL OXIDASE FROM DOMAT OLIVE
Ceren TAŞ
DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
UNIVERSITY OF ÇUKUROVA
Supervisor : Assoc. Prof. Dr .M. Ümit ÜNAL
Year : 2009, Pages : 47 Jury : Assoc. Prof. Dr. M. Ümit ÜNAL
Prof. Dr. Sadık DİNÇER Assist. Prof. Dr. M. Sertaç ÖZER
This research was undertaken to determine some of the biochemical
properties (substrate specificity, optimum pH, optimum temperature, heat
inactivation, and effect of inhibitors) of polyphenol oxidase (PPO) which was
isolated from Domat olives grown in Çukurova region and partially purified.
4-methylcatechol was used as substrate and Km dand Vm values of the
enzyme were found to be 14.52 mM and 1.73 Abs/dk, respectively. The optimum pH
and temperature for PPO activity was found to be 4.5 and 30°C, respectively. After
the optimum pH enzyme activity declined rapidly. The enzyme had more than 70%
activity between 20-50°C. Energy of activation (Ea) and Z values were found to be
121 kj.mol-1 (r²=0.9496) and 18.55°C (r²=0.9532), respectively. Of the inhibitors
tested, ascorbic asid was the least effective inhibitor.
Key Words: Olive, enzymatic browning, polyphenol oxidase, kinetics,
thermal inactivation.
III
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim boyunca, çalışmanın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi
ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren, bana yol gösteren ve
destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danışman hocam Sayın Doç.
Dr. M. Ümit Ünal’a teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmamın her aşamasında yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen;
Araştırma Görevlisi Aysun Şener’e ve değerli arkadaşım Murat Yılmaz’a,
İlgi, sabır ve maddi manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen babam
Ahmet Taş, annem Hatun Taş ve ablam Derya Taş’a,
Destek ve katkılarından dolayı Çukurova Üniversitesine ve Gıda
Mühendisliği Bölümü personeline teşekkürlerimi borç bilirim.
IV
İÇİNDEKİLER SAYFA
ÖZ........................................................................................................................ I
ABSTRACT........................................................................................................ II
TEŞEKKÜR........................................................................................................ III
İÇİNDEKİLER.................................................................................................... IV
ÇİZELGELER DİZİNİ........................................................................................ VI
ŞEKİLLER DİZİNİ............................................................................................. VII
1.GİRİŞ……........................................................................................................ 1
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR................................................................................ 3
2.1.Dünya Zeytin Üretimi ve Türkiye’nin Bu Üretimdeki Payı...................... 3
2.2. Türkiye Zeytin Ağacı Varlığı ve Üretim Durumu.................................... 4
2.3. Zeytin Danesinin Yapısı........................................................................... 6
2.4. Zeytinin Bileşimi...................................................................................... 6
2.5. Polifenol Oksidaz Enzimi......................................................................... 8
3.MATERYAL ve METOT……….………………………………………….... 20
3.1.Materyal………………………...…………..…………………………..... 20
3.1.1.Analizlerde Kullanılan Araç-Gereç ve Kimyasal Maddeler………… 20
3.2.Metot……………….……………………………………………………. 20
3.2.1.Polifenol Oksidaz Ekstraktının Hazırlanması ……………………… 20
3.2.2.Enzimin Kısmi Saflaştırılması………………………………………. 21
3.2.3. İyon Değişim Kromatografisi ile Saflaştırma……………………….. 21
3.2.4.Protein Tayini………………………………………………………… 21
3.2.5.Enzim Aktivitesinin Ölçümü…………………………………………. 22
3.2.6.Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi………………….. 22
3.2.6.1.Optimum pH………………………………………………….. 22
3.2.6.2.Optimum Sıcaklık………………………………….…………. 22
3.2.6.3.Kinetik Parametreler……………………………………..…… 23
3.2.6.4.Termal İnaktivasyon………………..………………………… 23
3.2.6.5.İnhibitörlerin Etkileri………………………………...……….. 25
V
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA……………………………... 26
4.1.Enzimin Saflaştırılması……….………………....……….……………... 26
4.2.Optimum pH……………………………………………………...……... 27
4.3.Optimum Sıcaklık………………...…………………………...………… 29
4.4.Kinetik Parametreler…………………………………………………...... 31
4.5.Termal İnaktivasyon………………………………………….…………. 32
4.6. İnhibitörlerin Etkisi..………..………………………………………….. 34
5.SONUÇ.............................……………........................................................... 37
KAYNAKLAR…………………………………………………………….... 38
ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………. 47
VI
ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1 Dünya Zeytin Alanlarının Ülkelere Göre Dağılımı.................... 3
Çizelge 2.2. Dünya Zeytin Üretiminin Ülkelere Göre Dağılımı..................... 3
Çizelge 2.3. Ülkemizde Bölgeler İtibariyle Zeytin Üretimi........................... 5
Çizelge 2.4. Zeytin Tanesinin Ortalama Bileşimi........................................... 7
Çizelge 4.1 Zeytin PFO’sunun Saflaştırma Çizelgesi.................................... 28
Çizelge 4.2. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enziminin
Optimum pH Değerleri............................................................... 30
Çizelge 4.3. Çeşitli Ürünlerden Elde Edilen Polifenol Oksidaz Enzimlerinin
Optimum Sıcaklık Değerleri…………………………………… 32
Çizelge 4.5. Çeşitli Ürünlerin Polifenol Enzimlerinin Km Değerleri ……… 34
Çizelge 4.6. Beyaz Kiraz Polifenol Oksidaz Enziminin Termal İnaktivasyon
Parametreleri …………………………………………………… 34
Çizelge 4.7. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enzimlerinin
Aktivasyon Enerjileri ………………………………………….. 35
Çizelge 4.8. İnhibitörlerin Beyaz Kiraz Polifenol Oksidaz Enzimine
Etkileri ………………………………………………………… 36
VII
ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA
Şekil 2.1. Türkiye’nin Zeytin Üretim Alanlarını Gösteren Harita.............. 5
Şekil 2.2. Zeytin Danesinin Yapısı............................................................. 6
Şekil 2.3. Zeytinin Temel Fenolik Bileşenlerinin Kimyasal Yapısı........... 8
Şekil 2.4. Enzimatik Esmerleşme Mekanizması......................................... 11
Şekil 4.1. DEAE-selüloz İyon Değişim Kromotografisi ile Zeytin
PFO’sunun Saflaştırılması………………….............................. 27
Şekil 4.4. Sıcaklığın Zeytin PFO’suna Etkisi …………………………… 31
1. GİRİŞ Ceren TAŞ
1
1. GİRİŞ
Zeytin ağacı, tarihin her aşamasında Akdeniz’de kurulan bütün uygarlıkların
vazgeçilmez bir parçasını oluşturmuştur. Anadolu’nun en eski kültür bitkilerinden
olan zeytin, oleceae familyasının, Olea cinsinin Oleaeuropa türünün Oleaeuropa
sativa alt türünü teşkil etmektedir. Akdeniz iklim kuşağında en iyi yetiştirme
koşullarını bulmuş olan zeytinin gen merkezinin, Güneydoğu Anadolu’da Hatay,
Kahramanmaraş ve Mardin üçgeninde olduğu ve buradan da dünyaya yayıldığı
birçok yazar tarafından doğrulanmaktadır. Güneydoğu Anadolu’dan önceleri Batı
Anadolu’ya yayılan zeytin, Ege Adaları yoluyla Yunanistan, İtalya, Fransa ve
İspanya’ya kadar ulaşmıştır (Bozdoğan, 2002). Dünya üzerinde ekonomik olarak
zeytin yetiştiriciliği 300–450 kuzey ve güney enlemleri arasında yapılmaktadır (Ulaş,
2001).
Geleneksel olarak zeytin hasadı elle yapılmaktadır. Bu işlemin fiyatı
işlenmemiş zeytin fiyatının % 50-70’ini oluşturmaktadır. Son zamanlarda ise zeytin
hasadı büyük makinelerle zeytin ağaçlarının sallanması veya küçük makinelerle
zeytin ağacı dallarının hareketi ile mekanik olarak yapılmaktadır. Ancak mekanik
yöntem hasat sırasında zeytinlere zarar verip ezme ve berelenmelere neden
olabilmektedir. Yeşil zeytinlerin mekanik olarak toplanması istenmez çünkü yeşil
zeytinin mekanik olarak hasadı sırasında zedelenmeler nedeni ile zeytinlerde
kahverengi lekeler oluşmaktadır. Bu durum zeytinlerin kalitesinin düşmesine ve
istenmeyen görünüm nedeni ile tüketici açısından kabul görmemesine neden
olmaktadır. Zeytinlerde görülen kahverengi lekeler esmerleşme reaksiyonlarından
kaynaklanmaktadır (Segovia-Bravo ve ark., 2007).
Hasat sonrası depolama veya meyve ve sebzelerin işlenmesi sırasında
mekanik zedelenmelerden kaynaklanan esmerleşme reaksiyonları çok sık
görülmektedir. Meyve ve sebzelerde görülen bu esmerleşme reaksiyonları polifenol
oksidaz (PFO) enziminin fenolik bileşiklerle reaksiyonu sonucu meydana
gelmektedir (Godfrey ve West, 1996).
Fenol bileşiklerinin miktarı ve çeşidi zeytinin olgunlaşmasına çeşidine, yağış
miktarına, sıcaklığa bağlı olarak değişmektedir. Bu nedenle bazı çeşitler fenol
1. GİRİŞ Ceren TAŞ
2
bileşenlerce zengin bazı çeşitler ise fakirdir. Zeytinde bulunan başlıca fenolik
bileşenler; oleuropein, verbaskosid, ligrosit gibi fenolik glikozitler ile flavonoidler,
flavonol glikozitleri, antosiyaninler ve glikozitleri, fenolik asitler ve diğer
bileşenlerdir (Ryan ve Robards, 1998; Keçeli, 2000).
Fenolik bileşiklerin oksidasyonla esmerleşmesi sonucu oluşan renk, sofralık
siyah zeytin için istenilen bir değişimdir. Polifenollerin oksidatif kararması, zeytinde
bulunan enzimlerin (difenoloksidaz) veya zeytinde bulunmayan ve dışarıdan katılan
metal katyonlarının katalitik etkisiyle oluşmaktadır (Garcia ve ark., 1996; Robards ve
ark., 1999).
PFO, oksidoredüktaz grubuna giren enzimlerdir ve bakır içerirler. Substratları
fenolik bileşiklerdir. Özellikle bitkiler âleminde yaygın olarak bulunan PFO’lar
hayvansal dokular ve küf mantarlarında da bulunmaktadırlar. Substratlarını oksijen
eşliğinde esmer renkli bileşiklere oksitlemektedirler. Bu olay gıda teknolojisinde
enzimatik esmerleşme olarak da bilinmektedir (Godfrey ve West, 1996).
Bu çalışmada Domat zeytini kullanılmıştır. Domat zeytini Türkiye’nin en
önemli yeşil sofralık çeşididir. Meyvesi iri, silindirik yapıda olup, saptan meyve
ucuna doğru bir sırt bulunur. Kilogramdaki ortalama dane adedi 180–200 arasında
değişir. Et- çekirdek oranı 5/1 ve yağ miktarı %20–22 dir. En uygun hasat zamanı
Ekim ayıdır. Zeytinler hasattan sonra tatlandırılır ve fermantasyon kaplarında
stoklanır. Fermantasyonunu tamamlamış zeytin karakteristik bir sarı renk alır.
Ülkemizde zeytin PFO’su üzerine çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmanın
amacı zeytinden PFO enzimini ekstrakte ederek kısmen saflaştırmak ve enzimin
optimum pH, sıcaklık, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi ve kinetik
parametreler gibi özelliklerini belirlemektir.
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
3
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
2.1. Dünya Zeytin Üretimi ve Türkiye’nin Bu Üretimdeki Payı
Dünya zeytin üretiminin yaklaşık % 97’sini karşılayan Akdeniz havzası
ülkelerinin başında İtalya, İspanya, Yunanistan, Türkiye, Tunus, Portekiz ve Fas
gelmektedir (Bozdoğan, 2002). İspanya dünyada en fazla zeytin alanına sahip ülke
durumundadır (Çizelge 2.1). FAO kaynaklarına göre 2004 yılı Dünya zeytin üretimi
15 340 488 ton olup, ülkemizde ise 1 800 000 ton’dur (Çizelge 2.2). Dünya zeytin
üretimi bakımından Türkiye, % 10.7’lik bir payla 4. sırayı almaktadır (Bozdoğan,
2002).
Ülkemizde zeytin üretiminin hala ilkel yöntemlerle yapılması nedeniyle üründe
büyük zararlar oluşmakta ve kalitesi düşmektedir. Bu nedenle Avrupa ülkelerine olan
zeytin dış satımımız yok denecek kadar azdır. Bu ülkeler zeytin gereksinimini daha
çok diğer Akdeniz ülkelerinden sağlama yoluna gitmektedir. Türkiye ise ihracatının
büyük çoğunluğunu Doğu Bloğu ülkelerine gerçekleştirmektedir (Öksüz, 1998).
Çizelge 2.1 Dünya Zeytin Alanlarının Ülkelere Göre Dağılımı (Anonim, 2004)
Alan (Ha)
Yıllar 2000 2001 2002 2003 2004
Yunanistan 765 151 767 144 765 000 765000 765 00 İtalya 1 136 627 1 142 579 1 140 546 1 140 685 1 140 685 İspanya 2 300 000 2 400 000 2 300 000 2 400 000 2 400 000 Tunus 1 387 240 1 377 700 1 377 700 1 500 000 1 500 000 Türkiye 594 072 599 400 599 000 597 000 597 000
Çizelge 2.2. Dünya Zeytin Üretiminin Ülkelere Göre Dağılımı (Anonim, 2004)
Üretim (ton)
Yıllar
2000 2001 2002 2003 2004
Yunanistan 2 273 000
2 249 430 2 573 835 2 050 260 2 300 000
İtalya 2 821 000 2 894 097 3 231 300 3 149 830 3 149 830
İspanya 4 943 800 6 762 600 4 290 700 7 290 900 4 556 000
Tunus 550 000 150 000 350 000 500 000 350 000
Türkiye 1 800 000 600 000 1 800 000 900 000 1 800 000
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
4
2.2. Türkiye Zeytin Ağacı Varlığı ve Üretim Durumu
Ilıman iklim zeytin ağacı için uygundur, çok kurak ve çok sulak yerler pek
uygun değildir. -7 derecenin altındaki sıcaklıklarda ve 400 mm’nin altında yağış alan
bölgelerde yetiştirilmesi ekonomik olmamaktadır. Toprak istekleri bakımından fazla
seçici olmadığından dolayı birçok bitkinin yetiştirilemediği alanların
değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (Ulaş, 2001).
Zeytin meyvesinin besi dokusu bol miktarda yağ içermektedir. Zeytin ağacı en
fazla 15–20 m’ye kadar boylanmakta ve çapı ise 5–6 m’ye kadar ulaşmaktadır. Ağaç
ömrü ortalama olarak 1000 yıl kadardır. Zeytin meyvesi ham ve olgun halde
salamura yapılarak yenmekte; ayrıca ezilerek yağı çıkarılmaktadır. Yağ çıkarıldıktan
sonra geriye kalan “pirina” olarak adlandırılan küspe; gübre ve hayvan yemi şeklinde
değerlendirilmektedir (Öksüz, 1998).
Türkiye’de işlenen tarım alanlarının % 4.1’inde zeytin tarımı yapılmaktadır.
DİE 2007 yılı istatistiklerine göre Ülkemizde yaklaşık 597 000 ha alanda, 90 000 000
adedi meyve veren, 9 000 adedi meyve vermeyen olmak üzere toplam 99 000 000
adet zeytin ağacı olmakla birlikte bu rakam dünyadaki zeytin ağacı varlığının (700
milyon) yaklaşık % 13’üne karşılık gelmektedir.
İklim ve toprak özellikleri bakımından büyük bir zeytin üretimi potansiyeline
sahip olan Türkiye’de zeytin üretimi Marmara, Ege, Akdeniz ve Güneydoğu
Anadolu Bölgelerinde yoğunlaşmıştır. Yetiştirilen zeytinlerin ortalama % 30’u
sofralık, % 70’i ise yağ üretiminde kullanılmaktadır. Gerek zeytin ağacı varlığı
gerekse zeytin üretimi bakımından sırasıyla Ege (% 75), Akdeniz (% 14), Marmara
(% 10) Bölgeleri ilk sıralarda gelmektedir. Ancak Ege ve Akdeniz Bölgesi yağlık
zeytin çeşitleri, Marmara Bölgesi ise sofralık zeytin çeşidi bakımından öndedir
Ülkemizde yaygın bulunan zeytin çeşitleri Memecik, Tavşan yüreği, Ayvalık,
Domat ve Gemliktir. Zeytin üretimi, sofralık ve yağlık olmak üzere iki farklı şekilde
yapılmaktadır. Sofralık çeşitlerde meyve tam olgunlaşmadan (yağ içeriği % 18–22)
hasadı yapılarak değişik yöntemlerle tüketiciye iletilmektedir. Yağlık çeşitler ise
meyve olgunlaştıktan sonra (yağ içeriği % 30–40) hasadı yapılarak
değerlendirilmektedir (Aydın, 2000).
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
5
Çizelge 2.3. Ülkemizde Bölgeler İtibariyle Zeytin Üretimi (Anonim, 2001)
Bölgeler
Toplam Ağaç Sayısı
Meyve Veren Yaştaki Ağaç
Sayısı
MeyveVermeyen Yaştaki
Ağaç Sayısı
Üretim (Ton)
Ege 70 382 781 65 880 590 4 502 191 1 384 667
Akdeniz 15 920 254 12 961 205 2 959 049 298 081
Marmara 10 368 825 9 608 980 759 845 106 342
Ortagüney 125 055 112 480 12 575 4 119
Güneydoğu 205 161 164 296 40 865 2 079
Kuzeydoğu 180 750 156 900 23 850 1 855
Karadeniz 203 085 154 699 48 386 1 365
Orta Kuzey 220 479 138 755 81 724 1 331
Ortadoğu 163 610 22 095 141 515 161
Türkiye Toplamı
7 770 000 89 200 000 8 570 000 1 800 000
Şekil 2.1. Türkiye’nin Üretim Alanlarını Gösteren Harita 1.Ege, 2. Marmara, 3. Akdeniz, 4. Güneydoğu Anadolu, 5. Karadeniz
(Numaralar bölgelerin ağaç sayısı ve üretim miktarlarına göre çoktan aza doğru verilmiştir.)
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
6
2.3. Zeytin Danesinin Yapısı
Şekil 2.2. Zeytin Danesinin Yapısı (Boskou, 1996)
Oval olan zeytin meyvesi perikarp (etli kısım) ve endokarptan (çekirdek)
oluşmuştur. Perikarp ise epikarp (kabuk) ve mezokarptan (etli kısım) meydana
gelmiştir. Meyve eti meyvenin yaklaşık % 68-83’ünü, çekirdek ise % 13-30’unu
teşkil etmektedir. Meyvedeki su oranı % 70’lere kadar çıkabilse de genellikle % 50
civarındadır. Bunun yanında meyvede % 1.6 protein, % 20 yağ, % 20 karbonhidrat,
% 5–6 selüloz, % 1.5 kül bulunmaktadır (Boskou, 1996).
2.4. Zeytinin Bileşimi
Zeytin, çeşidine göre şekli ve rengi değişen, besin değeri açısından oldukça
zengin bir üründür. Zeytinin yapısında önemli miktarda su ve yağ bulunurken
protein, selüloz, şeker, mineral maddeler, hidrokarbonlar, fenolik bileşikler ve
tokoferoller de bulunmaktadır (Çizelge 2.7). Bunlar arasında zeytinde iz miktarda
bulunduğu halde özellikle yağı oksidasyona karşı koruyarak antioksidan özellik
gösteren fenolik bileşikler, yağın rengi, lezzeti, oksidatif stabilitesi ve besin değeri
açısından önemli rol oynamaktadır (Kritsakis, 1998).
%%11––22 EEppiikkaarrpp ((kkaabbuukk))
%%6633--8866 MMeessookkaarrpp ((mmeeyyvvee eettii))
%%1100––3300 EEnnddookkaarrpp ((ççeekkiirrddeekk)) %%22––66 ÇÇeekkiirrddeekk iiççii
MMeeyyvvee ssaappıı
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
7
Çizelge 2.4. Zeytin Tanesinin Ortalama Bileşimi (Kiritsakis, 1998)
Bileşim Miktar (%)
Su 50
Yağ 22
Protein 1.5
Şeker 19.1
Selüloz 5.8
Mineral Madde (Kül) 1.6
Zeytinde bulunan fenol bileşikleri, sofralık zeytin veya zeytinyağının oksidatif
stabilitesini ve duyusal özelliklerini etkilediği için oldukça önemlidirler. Bunun
dışında fenol bileşenlerinin beslenme ve farmokolojik etkileri doğal antioksidatif ve
antimikrobiyel özellikleri bulunmaktadır. Ayrıca bu işlemler renk ve tadı
etkilediğinden meyvenin işlenmesinde de önemlidirler (Esti ve ark., 1998).
Meyvenin doğal savunma sisteminin oluşturulmasında da fenol bileşenleri önemli rol
oynamaktadır (Siciancalepore ve Longone; 1984; Brenes-Balbuena ve ark., 1995;
Robards ve ark., 1999).
Fenolik bileşikler, meyvenin duyusal özellikleri açısından önemli
parametrelerdir ve özellikle o-difenoller, meyve veya yağın oksidasyona karşı
dayanıklılığında antioksidan olarak görev yapmaktadır (Keçeli ve Gordon, 2001).
Zeytin; başlıca oleuropein, verbaskosit, ligrosit ve flavonollerin glikozit türevleri ile
flavonlar, antosiyaninler ve glikozitleri ve fenolik asitleri içermektedir (Montedoro
ve ark., 1993; Esti ve ark., 1998; Saija ve ark., 1998; Tsimidou, 1998; Keçeli ve
Gordon, 2001). Zeytinin temel fenolik bileşenlerinin kimyasal yapısı Şekil 2.3’de
verilmiştir.
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
8
Şekil 2.3. Zeytinin Temel Fenolik Bileşenlerinin Kimyasal Yapısı (Keçeli, 2000)
2.5. Polifenol Oksidaz Enzimi
PFO, bitki ve hayvan dokularında yaygın olarak görülen bir enzimdir.
Bitkilerde tüm kısımlarda bulunabilirken, gelişmiş hayvanlarda deri, saç, tüy ve
gözlerde bulunur. Bitkisel dokularda öncelikle latent (inaktif) formlar halinde
sentezlenmekte ve zamanla çeşitli etkenlerle, örneğin dokuda doğal olarak bulunan
proteazlar veya etilen gibi birtakım solunum metabolitlerince aktif hale
getirilmektedirler (Yemenicioğlu ve ark., 1997).
Sağlıklı meyve ve sebze dokularında, PFO enzimlerinin substratları olan
fenolik bileşiklerle teması, yok denecek kadar sınırlıdır. Bunun başlıca nedeni, enzim
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
9
ve substratlarının bitkisel hücrenin farklı kısımlarında yer almalarıdır. Nitekim PFO
enzimlerinin bir kısmı sitoplazmada serbest halde bulunurken, büyük bir kısmı
hücrenin tilakoid ve kloroplast gibi unsurlarında, membrana bağlı olarak
bulunmaktadır. Buna karşın, fenolik bileşiklerin neredeyse tamamı vakuollerde
yoğunlaşmış halde bulunmaktadır. Ancak doku olgunlaşmasının ileri aşamalarında
hücredeki pektinazların faaliyetiyle, doku kontrollü ve sınırlı bir şekilde doğal olarak
değişimlerle uğrar. Ayrıca, hasat, taşıma ve işleme sırasındaki etkiler veya uygulanan
çeşitli işlemlerle hücre ve buna bağlı olarak doku bütünlüğü bozulmaktadır. Böylece,
PFO enzimleri kendi substratları olan fenolik bileşiklerle ve havadaki oksijen ile bir
araya gelmektedirler (Muchuweti ve ark., 2006).
Meyve ve sebzelerin olgunlaşmasına paralel olarak, gerek PFO aktivitesinde,
gerekse bunların substratları olan fenolik bileşiklerin konsantrasyonunda önemli
değişimler görülmektedir. Örneğin elmalarda PFO substratı niteliğindeki o-difenolik
bileşiklerin konsantrasyonu ve kateşol oksidaz aktivitesi, olgunlaşmayla beraber
sürekli düşüş gösterirken şeftalilerde olgunlaşmayla birlikte o-difenollerin miktarında
önce büyük bir artış ve bunu takip eden sınırlı bir düşüş, kateşol oksidaz
aktivitesinde sürekli bir düşüş fakat lakkaz aktivitesinde sürekli bir artış
görülmektedir. Aynı şekilde zeytinlerde olgunlaşmayla birlikte PFO aktivitesinde
sınırlı bir düşüş, ancak buna karşın o-difenollerin konsantrasyonunda sürekli olarak
devam eden büyük bir artış görülmektedir. Buna göre, hasat zamanında zeytinlerin
esmerleşmeye büyük bir eğilim göstermesinin nedeni kolaylıkla anlaşılmaktadır.
Yine mantarlarda olgunlaşmayla birlikte PFO aktivitesinde büyük bir düşüş
görülmekte ancak bu durum onların esmerleşmeye eğilimini azaltmamaktadır (Ben-
Shalom ve ark., 1977; Ingebrigtsen ve ark., 1989).
Birçok meyve ve sebzelerde gerek hasat veya tasıma sırasında mekaniki bir
zedelenme sonucu, gerekse bunların herhangi bir ürüne islenmesi aşamasında
uygulanan doğrama, parçalama ve ezme gibi işlemler sırasında renkte esmerleşme ve
bozulmalar meydana gelmektedir. Bu olay polifenol oksidaz enziminden
kaynaklanmaktadır. Enzimatik esmerleşme denilen bu reaksiyon; hem polifenol
oksidaz aktivitesi hem de fenolik madde konsantrasyonuyla ilgilidir. Polifenol
oksidazlar, gıda endüstrisinde genellikle istenmeyen enzimlerdir. Enzimatik
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
10
esmerleşme ürünün duyusal özelliklerini bozar, satın alınabilirliğini azaltır ve aynı
zamanda besin değerinde azalmaya neden olur (Coseteng ve Lee, 1987).
PFO’lar meyve ve sebzelerin hasat, depolama ve işlenme kalitesi ve
ekonomisini belirleyen çok önemli enzimlerdir. Oksijen geçişine neden olan hasat,
depolama ve işleme sırasındaki zedelenme, kesilme ve diğer mekanik zararlar çoğu
meyve ve sebzelerde melanin oluşumuna, bu da hızla esmerleşmeye neden olur.
Esmerleşme yüzünden meyvelerde önemli kayıplar olmaktadır. Ürün renginin
değişmesi, kötü tat ve besin değeri kaybı tüketici açısından kabul edilemez
hususlardır. Muz, şeftali, kayısı, elma, üzüm, çilek ve bazı tropik meyveler ve suları
ayrıca patates, marul ve diğer yapraklı sebzelerde esmerleşme görülmektedir. Buna
karşılık çay, kahve, kakao, siyah üzüm ve siyah incirlerde PFO aktivitesi istenen bir
durumdur (Casado-Vela ve ark., 2005).
PFO tirosinaz, fenolaz, kateşoloksidaz, kateşolaz, o-difenoloksidaz, mono
fenoloksidaz ve kresolaz olarak da bilinir ve ilk olarak Schoenbein tarafından
1856’da keşfedilmiştir. PFO Uluslar arası Biyokimya Birliği’nin sınıflandırmasına
iki kez girmiştir: EC 1.14.18.1 (monofenol, L-dopa: oksijen oksidoredüktaz)
monohidroksifenolü (ör.p-kresol) o-pozisyonuna hidroksile eder. EC 1.10.3.1 (1,2-
benzendiol: oksijen oksidoredüktaz) o-dihidroksifenolleri (ör: kateşol) okside edip
hidroksil grubundan hidrojenleri uzaklaştırarak benzokinonlar oluştururlar. Bu enzim
iki çeşit oksidatif reaksiyonu katalizler: Monofelik bileşiklerin o-difenollere
hidroksilasyonu (kresolaz aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara
oksidasyonudur (kateşolaz aktivitesi) (Cash ve ark., 1976). Uluslar arası enzim
sistematiğine göre; kresolaz aktivitesi;‘monofenol monooksigenaz’, kateşolaz
aktivitesi ise “difenol oksidaz” ismi ile anılan enzimlerce gerçekleştirilmektedir
(Rocha ve ark., 1998).
Enzimatik esmerleşme olayı, iki farklı mekanizmaya göre gelişmektedir.
Bunlardan birisi, monofenolik bileşiklerin o-difenollere hidroksilasyonu (kreşolaz
aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara oksidayonudur (kateşolaz aktivitesi)
(Şekil 1).
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
11
OH
R (1)
monofenol 0-difenol o-kinon
OHOH
RH2O
R
O
O
(2)
1/2 O21/2O2
(çoğunlukla renksiz) (çoğunlukla renksiz) (çoğunlukla kırmızı)
Şekil 2.4. Enzimatik Esmerleşme Mekanizması (Cemeroğlu ve Ark., 2001) (1) Kreşolaz aktivitesi (hidroksilasyon) (2) Kateşolaz aktivitesi (oksidasyon)
PFO gıdalarda yol açtığı enzimatik esmerleşmeyle önemli kalite kayıplarına
neden olmaktadır. PFO’nun meyve ve sebzelerden izole edilip biyokimyasal
özelliklerinin belirlenmesi depolama ve işleme sırasında kalite kayıplarının en aza
indirilmesi ve böylece daha kaliteli ürünlerin üretilmesine olanak sağlayabilir. Bu
nedenle PFO enzimi üzerinde çok sayıda araştırma yapılmış, çok değişik meyve ve
sebzelerdeki PFO enziminin özellikleri belirlenmiştir.
Zeytin PFO’su üzerinde yapılmış çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Domat
çeşidi zeytindeki PFO enzimi üzerine ise herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır.
Zeytin PFO’su ve enzimatik esmerleşme üzerinde yapılmış araştırmalar aşağıda
özetlenmiştir.
Segevia-Bravo ve ark. (2007), Manzanilla çeşidi zeytinden PFO enzimini
saflaştırmışlar ve bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Enzimin optimum pH’sı 6.0
olarak bulunmuştur. Termodinamik parametrelerin pH’ya bağlı olduğu bildirilmiştir.
Sciancalepore ve Longone (1984), yeşil zeytinlerde PFO ve esmerleşmeyi
inceledikleri çalışmalarında enzim aktivitesi ile esmerleşme derecesi arasında pozitif
bir korelasyon bulmuşlardır.
Goupy ve ark. (1991), 10 farklı zeytin çeşidinde enzimatik esmerleşme,
oleuropein içeriği ve PFO arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Esmerleşme
kapasitesinin PFO aktivitesi ve oleuropein arasındaki karmaşık ilişkiye bağlı olduğu
bildirilmiştir.
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
12
Zeytin dışındaki ürünlerden izole edilen PFO üzerine çok sayıda araştırma
yapılmış ve bunlardan bazıları aşağıda verilmiştir.
Yemenicioğlu ve Cemeroğlu yaptıkları çalışmada (1996), “Hale Haven”
şeftalilerinde polifenol oksidaz (PFO) enziminin niteliklerini araştırmışlardır. Ham,
yarı olgun ve tam olgun şeftalilerden öncelikle aseton tozu hazırlanmıştır. Aseton
tozundan hazırlanan enzim çözeltisinde optimum pH, Michaelis sabiti (Km),
maksimum hız (Vm) ve enzim aktivitesinin termal inaktivasyonu incelenmiştir.
Olgunluk durumuna göre enzimin optimum pH derecesi 6.0-6.5 arasında
bulunmuştur. Tam olgun şeftalilerde elde edilmiş enzimin pH 6.2 de Km değerinin
14.3 mM ve Vm değerinin 1.25 Abs.dk-1. mL-1 olduğu saptanmıştır. Enzimin termal
inaktivasyon kinetiği 70°C’de araştırılmıştır. Her enzim ekstraktının termal
inaktivasyon kurvesinin, başlangıçta dik bir doğru, sonra daha yatık bir doğru olmak
üzere iki bölümden oluştuğu belirlenmiştir. Bu nedenle şeftali PFO enziminin ısıya
dirençli farklı iki izoenzimden oluştuğu sonucuna varılmıştır.
Aydemir ve arkadaşları yaptıkları çalışmada (2003), polifenol oksidaz (PFO)
enzimini yer elmasından izole etmişlerdir. PFO, kateşol, L-dopa, DL-dopa’ya karşı
aktivite göstermiş fakat bir monofenol olan L-tirozine karşı aktivite göstermemiştir.
Yer elmasından izole edilen PFO’nun optimum pH ve sıcaklık değeri sırasıyla 7.0 ve
25 °C’dir. Enzim nötr pH civarında oldukça kararlıdır. 60 ve 80°C’deki aktivitenin %
50 inaktivasyonu için gerekli olan zaman sırasıyla, 40 ve 20 dakika olarak
bulunmuştur. Kateşol için Km ve Vm değerleri sırasıyla, 5.88 mM ve 25.402
IU/mg.dk’dır. Ayrıca, yapılan çalışmada en etkili inhibitörlerin potasyum siyanid, β-
merkaptoetanol ve tiyoüre olduğu belirlenmiştir.
Yemenicioğlu ve ark. (1997), altı elma çeşidinin (Golden Delicious, Starking
Delicious, Granny Smith; Gloster, Starcrimson ve Amasya) PFO’larının ısıl
inaktivasyon kinetiklerini üç sıcaklıkta (68°, 73° ve 78°C) çalışmışlardır. PFO
aktivitesi başlangıçta artmış ve daha sonra ısıcaklıktaki artışla beraber birinci
dereceden kinetik modele uyarak azalmıştır. Aktivitedeki artış bağlı PFO’nun
varlığını göstermektedir. İnaktivasyon eğrisinin lineer bölümü için regresyon
katsayısı inaktivasyon parametrelerini belirlemek için hesaplanmıştır. 78°C’de
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
13
Amasya elması PFO’sunun en az, Starking Delicious cinsi PFO’nun ise en yüksek
ısıl-dirence sahip olduğunu göstermiştir.
Saygılı ve arkadaşları (1998), Türkiye Şeker Fabrikaları A.Ş. Şeker Enstitüsü
(Ankara) deneme tarlalarında yetiştirilen Evita, TŞ. Poly, Gisela, Adonis ve Agra
adlı şeker pancarı çeşitlerindeki polifenoloksidaz (PFO) aktivitesini incelenmişlerdir.
PFO enzim aktivitesi substrat olarak kateşolün kullanıldığı dolaylı bir yöntemle
ölçülmüştür. Absorbans-zaman grafiğinin eğimi toplam enzim aktivitesi olarak
değerlendirilmiştir. Bazı şeker pancarı çeşitlerinde (Evita, T.Ş. Poly) ortalama PFO
aktivitesinin yüksek olduğu ve aynı çeşit örneklerdeki enzim aktivitesi değerlerinin
çok geniş sınırlar arasında değiştiği belirlenmiştir. Fakat Adonis çeşidi için ortalama
PFO aktivitesi ve standart sapma değerleri oldukça düşük bulunmuştur. Tam doğal
şeker (Whole Sugar) üretiminde pancardaki polifenol oksidazlar ürün rengini
olumsuz etkilemekte ve bu nedenle üretimin ilk aşamasında PFO buharla inaktive
edilmektedir. Bu tür düşük PFO aktivitesine sahip çeşitlerin kullanımı ile proseste ve
ürün kalitesinde iyileştirme sağlanabilecektir.
Wissemann ve Lee (1981), üzümden elde ettikleri PFO’nun niteliklerinin
belirlenmesi ile ilgili yaptıkları çalışmada, iki farklı üzüm çeşidi kullanmışlar (Ravat
51 ve Niagara) ve her iki üzüm çeşidinde optimum pH ve sıcaklık değerlerinin 5.5 ve
25°C olduğunu bildirmişlerdir. Niagara üzümünden elde edilen PFO’nun, Ravat
51’den elde edilen üzüm PFO’suna göre ısıya karşı daha dirençli olduğu
bildirilmiştir. Enzim üzerine çeşitli inhibitörlerin etkisi denenmiş ve en etkili
inhibitörler L-sistein ve sodyum dietilditiyokarbomat olarak bulunmuştur.
Nakamura ve ark. (1983), Japon çeşitlerinden Koshu üzümlerinden aseton tozu
yöntemi ile ekstrakte ettikleri PFO enzimini amonyum sülfat çöktürmesi ve kolon
kromatografisi ile saflaştırmışlar ve enzimin bazı özelliklerini belirlemişlerdir.
Enzimin molekül ağırlığının 39000-41000, optimum pH’sının 6.0 ve optimum
sıcaklığının ise 25°C olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca, enzim o-difenolik bileşiklere
yüksek aktivite gösterirken, monofenollere hiç aktivite göstermemiştir.
Ünal (2007), Anamur muzundan polifenol oksidaz enzimini saflaştırıp, enzimin
karakteristik özelliklerini belirlemiştir. PFO’nun muz için optimum sıcaklığı 30°C
bulunmuştur. Enzimin optimum pH derecesi 7.0 olarak bulunmuştur. 60-75°C’deki
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
14
termal inaktivasyon çalışmalarından, enzimin yarı ömür değeri 7.3 ve 85.6 dakika
arasında değişmektedir. Ea ve Z değerleri, sırasıyla, 155 kj.mol-1 ve 14.2°C olarak
hesaplanmıştır. Km ve Vm değerleri sırasıyla 8.5 mM ve 0.754OD410 dak-1’dır.
İnhibitör testlerinde ise askorbik asit ve sodyum metabisülfit en etkili inhibitör olarak
tespit edilmiştir.
Rapeanu ve arkadaşları (2006), Güney Afrika’da yetişen Viktorya
üzümlerinden ekstrakte edilen PFO enziminin biyokimyasal tanımlanmasını ve
kimyasal stabilitesini araştırmışlardır. McIlvaine tamponu ile hazırlanmış 10 mM
kateşol substratı ile üzüm PFO aktivitesi için optimum pH ve sıcaklık sırasıyla 5.0 ve
25°C olarak bulunmuştur. 10 mM kateşol substrat olarak kullanıldığında Kmax ve Vm
değerleri sırasıyla 52.6±0.00436 mM ve 653±24.0 OD400 nm/dk’dır. Çalışmada sekiz
inhibitör test edilmiş ve en etkili inhibitörlerin askorbik asit, L-sistein ve sodyum
metabisülfit olduğu bulunmuştur. Kinetik çalışmalar, Viktorya üzümleri PFO’sunun
termal inaktivasyonunun, Ea =225±13.5 kj/mol’lük bir aktivasyon enerjisi ile birinci
dereceden kinetiğe uyduğunu göstermiştir.
Yemenicioğlu ve arkadaşları Taro yumrularından ekstrakte edilmiş peroksidaz
(POD) ve polifenol oksidaz (PFO) enzimlerinin 50–80°C arasındaki ısıl
inaktivasyonunun birinci dereceden reaksiyon kinetiğine uygun olarak geliştiğini
saptamışlardır. Her iki enzimin, ısıl dirençleri birbirinden farklı iki izoenzimden
oluştuğu belirlenmiştir. 60–70°C aralığında, ısıl direnci yüksek olan fraksiyonun
oranı POD için; %33–34 ve PFO için; %67–72 olarak bulunmuştur. Diğer taraftan,
bu enzimlerin Ea ve Z değerlerinin sırasıyla POD için 19.4 kcal.mol-1 ve 25.9°C ve
PFO için ise 21 kcal.mol-1 ve 25.5°C olarak saptanmıştır. Aynı şekilde, pH
optimumu POD için 5.9 ve PFO için 6.5 olarak belirlenmiştir. Bu enzimlerin
yumrudaki dağılımı da incelenmiş ve POD enziminin yumruların yüzey kısımlarında,
buna karsın PFO enziminin ise daha çok merkez kısımlarında yoğunlaştığı
saptanmıştır. PFO enziminin kateşol oksidaz ve floroglusinol oksidaz aktivitesi
içermesine karşı, lakkaz aktivitesine sahip olmadığı görülmüştür. EDTA, SO2, NaCl
ve askorbik asidin PFO enzimi üzerindeki inhibe edici özellikleri de belirlenmiştir.
Gόmez (2002), gıda işleme operasyonları sırasında yol gösterici olarak yararlı
bilgi sağlamak amacıyla iki avokado çeşidinden (Booth 1 (B1PFO) ve Julio Millian
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
15
(JMPFO)) elde edilen kaba PFO enzimi üzerinde çalışmıştır. İki ekstrakt için de
optimum aktivitenin görüldüğü pH 7.5-7.6 bulunmuştur. 67-84ºC arasındaki ısıl
aktivasyon enerjisinin, 21.4-64.1 kcal/mol arasında değiştiği bildirilmiştir.
Yağar (2004), çalışmasında, pH 7’de, 0.1M fosfat tamponu kullanarak kereviz
köklerinden PFO ekstrakte etmiştir. Substrat spesifikliği denemeleri, kateşol,
pirogallol, L-DOPA, p-kresol, resorsinol ve tirozin kullanılarak yapılmıştır.
Pirogallol, kateşol ve L-DOPA için Km değerleri 25°C’de sırasıyla; 4.5, 8.3 ve 6.2
mM bulunmuştur. Optimum pH ve sıcaklık kateşol, pirogallol ve L-DOPA ile
belirlenmiştir. Optimum pH kateşol ve L-DOPA için 7, pirogallol için 7.5’dir.
Maksimum PFO aktivitesi için optimum sıcaklıklar; pirogallol için 25°C, kateşol için
40°C ve L-DOPA için 45°C bulunmuştur. Isıl inaktivasyon çalışmaları, 60°C’nin
üzerinde enzimatik aktivitede düşüş olduğunu göstermiştir. İnhibitörlerin etki sırası
şu şekilde bulunmuştur: L-sistein>askorbik asit>glisin>resorsinol>NaCl.
Sabancılar ve ark. (2007), yaptıkları çalışmada Denizli Narından PFO enzimi
Afinite Kromatografisi yardımı ile saflaştırmış ve karakterizasyonunu yapmışlardır.
Denizli narından saflaştırılan polifenol oksidaz enzimi afinite kromatografisi
kullanılarak 67 kat saflaştırılmıştır. Enzimin optimum pH’sı 7.5 optimum sıcaklığı
40°C olarak bulunmuştur. Enzimin kinetik parametreleri olan Vm ve Km değerleri ise
Linewearver-Burk grafiğinden saptanmıştır.
Gülçin ve ark., (2005) ısırgan PFO’nun saflaştırılması, karakterizasyonu ve
bazı inhibitörlerin enzim aktivitesine etkisini inceledikleri çalışmada, amonyum
sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma yapmışlardır.
Saflaştırdıkları enzime 8 farklı substratın etkisini denemişler ve en uygun substratın
L-tirozin olduğunu bulmuşlardır. Optimum pH ve sıcaklık değerleri sırası ile 4.5 ve
30°C olarak bulunmuştur. Km ve Vm değerleri ise 7.90x10–4 mM ve 11290 EU/mL
olarak bildirilmiştir. Ayrıca, birkaç inhibitörün etkisi denenmiş ve en etkili
inhibitörün sodyum dietil ditiyokarbomat olduğu saptanmıştır.
Orenes-Pinero ve ark. (2006), ayva PFO’sunu kısmi olarak saflaştırmışlar ve
bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlemişlerdir. Araştırmacılar amonyum sülfat
çökeltmesi uygulayarak kısmi saflaştırma yapmışlar ve 0.5 g/dm3 sodyum dodesil
sülfat (SDS) varlığında ve asidik pH’da enzimin maksimum aktivite gösterdiğini
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
16
bulmuşlardır. SDS varlığında enzimin maksimum hız değerinin 15 kat daha fazla ve
optimum pH değerinin 5.0 olduğu, her iki durumda da Km değerinin 1.2 mM olduğu
bildirilmiştir. Araştırmacılar birkaç inhibitörün etkisini denemişler ve en etkili
inhibitörün tropolon olduğunu bulmuşlardır.
Yağar ve Sağıroğlu (2000), ayvadan ekstrakte ettikleri PFO enzimini
(NH4)2SO4 çökeltmesi ile kısmen saflaştırılmıştır. Substrat spesifikliği denemeleri,
kateşol, pirogallol, L-DOPA, p-kresol, resorsinol ve tirozin kullanılarak yapılmıştır.
Kateşol en iyi substrat olarak belirlenmiştir. Michealis sabiti kateşol, pirogallol, L-
DOPA için, sırasıyla 4.54 mM, 7.35 mM, 1.78 mM olarak bulunmuştur. Optimum
pH ve sıcaklık, spesifik substrat olan kateşol için sırasıyla 8.0 ve 40ºC olarak
belirlenmiştir. Sekiz çeşit inhibitör test edilmiş ve ayva PFO’su üzerinde en etkili
olanlarının L-sistein, askorbik asit, potasyum siyanid olduğu tespit edilmiştir.
Ziyan ve Pekyardımcı (2003), polifenol oksidaz enzimini amonyum sülfat
çökelmesi, jel filtrasyon ve diyaliz yöntemi ile yerli armut çeşidi olan Ankara
armudundan izole etmişlerdir. Amonyum sülfat çökeltmesinden sonra diyalizde elde
edilen enzimin biyokimyasal özelliklerini belirlemiştlerdir. Optimum pH değerleri,
pirogallol için 8.2, 4-metil kateşol için 7.2, kateşol için 7.0, D-tirosin için 5.6, p-
kresol için 5.0, L-dopa için 4.8 olarak belirlenmiştir. Optimum sıcaklık 4-metil
kateşol için 35ºC olarak bulunmuştur. 4-metil kateşol, klorogenik asit, kafeik asit iyi
substratlar olmasına karşın, kateşol en etkili substrat olarak saptanmıştır. Ayrıca, 6
farklı inhibitörün PFO üzerindeki etkisi araştırılmıştır. L-askorbik asit, L-sistein ve
Dietilditiyokarbomat en etkili inhibitör olarak tespit edilmiştir. Km ve Vm değerleri
sırasıyla kateşol için 5.55 mM ve 344.5 IU/mL olarak hesaplanmıştır. Termal
inaktivasyon çalışmalarında aktivasyon enerjisi 0.19 kal/mol olarak belirlenmiştir.
Ankara armudu PFO’sunun üç izoenzimi polikirilamid jel elektroforezindeki
aktivitesiyle tespit edilmiştir. Molekül ağırlıkları ise sodyum dodesil sülfat PAGE
için 60, 20, 28 kDa olarak bulunmuştur.
Mazzafera ve Robinson (2000), kahve yaprakları ve kahve endosperminin
kısmen saflaştırılmış ekstraktından PFO enzimini karakterize etmişlerdir. PFO
aktivitesi meyve endospermi ve yaprakların ikisinde de, erken gelişme safhasında
daha yüksek oranda bulunmuştur. PFO proteaz uygulamalarıyla aktive edilememiştir
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
17
ve bağlı değildir. PFO aktivitesi 0.35-1.75 mM sodyum dodesil sülfat (SDS) ile %10-
15 civarında arttırılmıştır. Ancak, daha yüksek konsantrasyonlarda çalışmalar
deterjansız kontrol yöntemleriyle benzerdir. Tripsin veya proteinaz K ile ekstraktın
uzun inkübasyonu PFO aktivitesini inhibe etmiştir ancak pepsinin hiçbir etkisi
olmamıştır. Proteinaz K ile PFO inhibisyonu SDS varlığında artmıştır. İki dokudaki
PFO aktivitesi pH 6-7’de ve 30°C’de en yüksektir. Substrat olarak klorojenik asit
0.882 mM (PFO-L) ve 2.27 mM (PFO-E) Km ile en yüksek aktiviteye sahiptir.
Hekzadekil trimetil-amonyum bromid polivinilprolidon 40, sinnamik asit ve
salisihidroksamik asid her iki dokudan PFO’su her iki dokudan inhibe etmiştir.
Espin ve arkadaşları (1997) enginardan elde edilen PFO enziminin
monofenolaz aktivitesini incelemişlerdir. Enginar PFO’su aseton tozu gibi basit bir
yöntem kullanılarak izole edilmiştir. Enzim ekstraktı hem monofenolaz hem de
difenolaz aktivitesi göstermiştir. Enzim monofenolaz aktivitesi, substrat olarak çiftli
bir nükleofil olarak 3-metil-2-benzothiazolinon ile birlikte 4-hidroksianisol,
kullanılarak tanımlanmıştır. Bu metot yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik
göstermiş ve PFO’nun mikro miktarlarını tespit etmede faydalı olabilecek olan, bir
kalibrasyon eğrisi elde etmeye izin vermiştir.
Doğan ve arkadaşları (2002), kurutma işlemleri için en uygun patlıcan çeşidini
tanımlamak için, farklı patlıcan çeşitlerinden elde edilen PFO enziminin
biyokimyasal özelliklerini araştırmışlardır. PFO kateşol, 4-metilkateşole karşı
aktivite göstermiş, fakat L-tirozin ile aktivite göstermemiştir. Çeşit I (Vm=3333.3
EUdk-1 ml-1, Kmax=8.7 mM ve Vm/Kmax= 384.9 dk-1) ve çeşit III (Vm 1000 EU dk-1
ml-1, Kmax=9.3 mM ve Vm/Kmax= 107.5 dk-1) için en iyi substrat kateşol bulunurken,
çeşit II için (Vm=5000 EU dk-1 ml-1, Kmax=35.5 mM ve Vm/Kmax= 140.8 dk-1) en iyi
substrat 4-metilkateşoldür. Kateşol için optimum pH 7, 4-metilkateşol için optimum
pH 6’dır. Isıl inaktivasyon çalışmalarına göre 40°C’nin üzeri sıcaklıklarda enzim
aktivitesi düşmüştür. Kateşol ve 4-metil kateşol substratları için maksimum aktivite
elde etmek için optimum sıcaklık, kateşol kullanılan ve optimum sıcaklığı 20°C
bulunan çeşit I dışında, tüm patlıcan çeşitleri için 30°C olarak bulunmuştur.
Katalizlenen PFO reaksiyonları üzerine Tropolon, D, L-ditiotreitrol ve glutation gibi
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
18
bileşenlerin inhibitör olarak etkileri test edilmiş ve genelde en etkili inhibitör olarak
tropolon bulunmuştur.
Serradell ve ark. (2000), çilek PFO’sunu amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon
değişim kromatografisi kullanarak saflaştırmışlar ve karakterizasyonunu
çalışmışlardır. Substrat olarak prokateşol kullanılmış ve bu substratta Km değeri 11.2
mM, optimum pH değeri 50°C’de SDS varlığında 7.2 ise olarak bulunmuştur.
Sanchez-Ferrer ve ark. (1988), Monastrell üzümlerinden izole edip kısmen
saflaştırdıkları PFO enziminin kateşolaz ve kresolaz aktivitelerini incelemişlerdir.
Kateşolazın sıcaklık ve pH optimum aralıkları sırasıyla 20-40°C ve 3.5-5.0 arasında
bulunmuştur. Kresolaz aktivitesinde lag periyodu gözlenmiştir. Enzim
konsantrasyonu, sıcaklık veya pH’daki artış lag periyodununda düşmeye neden
olurken substrat konsantrasyonunun artırılması artışa neden olmuştur.
Sanchez-Ferrer ve ark. (1989), Monastrell ve Airen üzüm tanelerinde gelişme
ve olgunlaşma sırasında kateşolaz ve kresolaz aktivitelerini araştırmışlardır.
Monastrell üzümü PFO’nun kateşolaz aktivitesi ölçümde kullanılan pH’ya bağlı
olarak artmış veya azalmıştır. Airen üzümlerinde ise pH’dan bağımsız olarak sürekli
artmıştır. Monastrell üzümlerinde ağır yağmurlu gün ve ben düşme döneminde daha
yüksek kateşolaz aktivitesi gözlenmiştir.
Gauillard ve Richard-Forget (1997), yaptıkları çalışmada armuttan elde
ettikleri PFO’yu saflaştırmış ve bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Saflaştırma için
amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi kullanılmıştır.
Saflaştırma sonunda F1 ve F2 olmak üzere iki farklı fraksiyon elde edilmiştir. F1,
124 kat ve F2 ise 36 kat saflaştırılmıştır. Her iki fraksiyon da benzer Km değeri
göstermiştir. Km değeri 5-11 mM arasında değişmiştir. Ayrıca, değişik substratlar
denenmiş ve en iyi substrat klorojenik asit olarak bulunmuştur.
Ding ve ark. (1998), yenidünyadan elde ettikleri PFO enziminin bazı
biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ile ilgili yaptıkları çalışmada enzimi
amonyum sülfat çökeltmesi, jel değişim ve iyon değişim kromatografisi kullanarak
157 kat saflaştırmışlardır. Saflaştırma sonunda enzimin optimum pH’sı 4.5, optimum
sıcaklığı 30ºC ve enzimin stabil olduğu pH aralığı 4-8 olarak bulunmuştur. Ayrıca,
araştırmacılar substrat olarak klorojenik asit ve neoklorojenik asit kullandıkları
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ
19
çalışmada enzimin Km değerinin 0.105 ve 0.425 mM olduğunu ve inhibitörlerin
etkisini çalışmada ise sodyum L-askorbik asit, sodyum dietil ditiokarbomat ve
sodyum metabisülfitin enzimi tamamen inhibe ettiğini bildirmişlerdir.
Rocha ve ark. (1998), elmadan elde ettikleri PFO’ın bazı biyokimyasal
özelliklerini belirlemişlerdir. Araştırmacılar farklı substratların etkisini denemişler ve
en etkili substratın klorojenik asit olduğunu bulmuşlardır.
Weemaes ve ark. (1998), yaptıkları çalışmada elma, avokado, armut ve erikten
PFO enzimi izole etmişler ve bazı biyokimyasal özelliklerini belirlemişlerdir. En
yüksek PFO aktivitesi avokadodan elde edilen PFO’da bulunmuştur.
Arslan ve ark. (2004), duttan elde ettikleri PFO’yu amonyum sülfat ve affinite
kromatografisi kullanarak saflaştırmışlardır. Araştırmacılar substrat olarak kateşol, 4-
metil kateşol ve pirogallol kullanmışlardır. Optimum pH ve sıcaklık değerlerinin bu
3 substrat için 4.5-8.0 ve 20-45°C arasında değiştiğini bildirmişlerdir.
3.MATERYAL VE METOT Ceren TAŞ
20
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3. 1. Materyal
Denemelerde Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Araştırma ve
Uygulama Bahçesinden temin edilen Domat zeytini kullanılmıştır.
3.1.1. Analizlerde Kullanılan Araç Gereç ve Kimyasal Maddeler
Aseton tozunun elde edilmesinde “Torrington HGBTWTS3 (Amerika)”
marka Waring blendor kullanılmıştır. Tamponların ayarlanmasında ve pH
ölçümlerinde cam elektrodlu “Inolab (Almanya)” marka pH metre kullanılmıştır.
Spektrofotometrik ölçümler, sıcaklık kontrol ünitesi olan “Shimadzu UV-1700”
marka (Japonya) spektrofotometrede gerçekleştirilmiştir. Enzim ekstraktının elde
edilmesinde “Nüve NM 110” marka karıştırıcı ve “Kubota 7780 (Japonya) marka
santrifüj kullanılmıştır. Enzimlerin saflaştırılmasında “Atto AC-5750 (Japonya)
marka fraksiyon kollektörü kullanılmıştır. Enzimlerin biyokimyasal özelliklerinin
belirlenmesi sırasında “Memmert WB14” ve “Nüve BM402” marka su banyosu
kullanılmıştır. Enzimin saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde
kullanılan triton X-100, sodyum metabisülfit, PVPP (polivinilpolipirolidon),
askorbik asit, commasie brillant blue (CBB) Merck (Darmstadt, Almanya)
firmasından temin edilmiştir. DEAE-Toyopearl 650-M Supelco (Montgomeryville,
Amerika) firmasından sağlanmıştır. PEG (polietilen glikol), PMSF (fenilmetilsülfonil
florid), 4-metil kateşol, sodyum disülfit, askorbik asit, L-sistein, aseton, amonyum
sülfat ve selüloz membran (76mm×49mm) Sigma-Aldrich (St. Louis, Amerika)
firmasından temin edilmiştir.
3.2. Metot
3.2.1. Polifenol Oksidaz Ekstraktının Hazırlanması
Dondurulmuş (-25ºC), zeytinlerden çekirdekleri çıkartıldıktan sonra 150 gr
alınmış, 1.875 g polietilen glikol (PEG) içeren 225 ml önceden soğutulmuş (-18ºC)
3.MATERYAL VE METOT Ceren TAŞ
21
aseton içerisinde 2 dk Warring blendorda homojenize edilmiştir. Homojenat vakumlu
filtreden geçirilmiştir. Elde edilen filtre keki 150 ml soğutulmuş aseton ile
karıştırılarak aynı işlemler uygulanmıştır. Filtre üzerinde kalan kısım, beyaz aseton
tozu elde edilene kadar 150 ml soğuk aseton kullanımlarıyla ekstrakte edilmiştir.
Elde edilen aseton tozu bir gece oda sıcaklığında kurutulduktan sonra cam kavanoz
içerisinde –25ºC’de saklanmıştır (Coseteng ve Lee, 1987).
3.2.2. Enzimin Kısmi Saflaştırılması
Elde edilen aseton tozundan 10g alınarak 10 mM askorbik asit, %0.1
polivinilpoliprolidon, %0.5 Triton X-100 ve 1mM PMSF (fenil metil sülfoni florid)
içeren 300 ml, 0.1 M, pH 6.8 fosfat tamponunda 40 saniye homojenize edilmiştir.
Homojenat 3 saat, +4ºC’de magnetik karıştırıcı ile karıştırılmış ve daha sonra 10.000
x g’de 45 dakika +4ºC’de santrifüjlenmiştir. Santrifüj sonrası, berrak kısma %90
amonyum sülfat çökeltmesi uygulanmıştır. Çökeltilen fraksiyonlar 10 000 x g’de 45
dakika, + 4ºC’de santrifüj edilerek ayrılmıştır. Çökelti, az miktarda 0.01 M pH 6.8
fosfat tamponunda çözülmüş ve +4ºC’de aynı tampona karşı bir gece boyunca diyaliz
edilmiştir (Serradell ve ark., 2000).
3.2.3. İyon Değişim Kromatografisi ile Saflaştırma
Diyaliz edilen enzim çözeltisi, 0.01 M pH 6.8 fosfat tamponu ile dengelenmiş
DEAE-Toyopearl 650-M iyon değişim kolonuna (2.5 x 30 cm) 0.5 ml.dk-1 hızla
verilmiştir. Enzim çözeltisi verildikten sonra 0.5 ml.dk-1 hızla yaklaşık 200 ml
başlangıç tamponu geçirildikten sonra 0.01–0.20 M, pH 6.8 fosfat tamponu
kullanılarak gradient elüsyon yapılmıştır. Toplam 40 ml enzim çözeltisi kolona
verilmiştir. Fraksiyonlar 4’er ml olacak şekilde toplanmış ve elde edilen
fraksiyonlarda enzim aktivitesi ve protein tayini yapılmıştır.
3.2.4. Protein Tayini
Enzimlerin protein içeriği standart olarak sığır serum albumini kullanılan
Bradford yöntemine göre belirlenmiştir (Bradford, 1976).
3.MATERYAL VE METOT Ceren TAŞ
22
3.2.5. Enzim Aktivitesinin Ölçümü
Enzim aktivitesi 30°C’de 410 nm’de 40 sn boyunca absorbanstaki artıştan
belirlenmiştir. Absorbans-zaman grafiğinin lineer kısmının eğiminden enzim
aktivitesi hesaplanmıştır. Ölçümler iki paralelli olarak yapılmış ve sonuçlar ortalama
değerler şeklinde ifade edilmiştir. Optimum pH’daki tampon ile hazırlanmış ve
30°C’ye ısıtılmış 0.9 ml substrat çözeltisi 0.1 ml enzim çözeltisi ile karıştırıldıktan
sonra absorbanstaki artış otomatik olarak kaydedilmiştir. Sadece inhibitörün etkisini
belirlemek için yapılan enzim aktivitesi ölçümlerinde 0.8 ml substrat, 0.1 ml
inhibitor ve 0.1 ml enzim çözeltisi kullanılmıştır. Kontrol olarak fosfat tamponunda
hazırlanmış substrat kullanılmıştır. 1 ünite PFO aktivitesi 30°C’de dakikada 0.001
birimlik absorbans artışına neden olan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır (Ünal ve
Şener, 2006).
3.2.6. Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi
Enzimin optimum pH ve sıcaklığı, kinetik parametreler, termal inaktivasyon,
inhibitörlerin etkisi gibi biyokimyasal özellikleri Ünal (2007)’a göre belirlenmiştir.
3.2.6.1. Optimum pH
Enzimin en yüksek aktivite gösterdiği optimum pH’yı bulabilmek için 3.04-
6.7 pH aralıklarında aktiviteler ölçülmüştür. pH 3.04-5.80 için 0.2 M sitrat tamponu,
pH 6.30-6.70 için 0.2 M fosfat tamponu kullanılmıştır. PFO aktivitesi farklı
tamponlarda, standart reaksiyon karışımı kullanılarak ölçülmüştür. Enzimin en
yüksek aktivite gösterdiği pH değeri optimum pH olarak belirlenmiş ve diğer
deneyler bu pH’da gerçekleştirilmiştir. .
3.2.6.2. Optimum Sıcaklık
Optimum sıcaklığı belirleyebilmek için 20-70°C’ler arasında enzim aktivitesi
ölçülmüştür. Bunun için optimum pH’daki tamponla hazırlanmış 0.9 ml 4-metil
kateşol çözeltisi ilgili sıcaklıkta su banyosunda 5 dakika bekletildikten sonra üzerine
3.MATERYAL VE METOT Ceren TAŞ
23
0.1 ml enzim çözeltisi ilave edilerek enzim aktivitesi ölçülmüştür. Maksimum enzim
aktivitesinin görüldüğü sıcaklık değeri optimum sıcaklık olarak belirlenmiştir.
3.2.6.3. Kinetik Parametreler
Enzimin Michaelis-Menten sabiti (Km) ve maksimum hız Vm değerlerini
bulabilmek için optimum pH ve sıcaklıkta değişik konsantrasyonlarda 4-metil kateşol
kullanılarak enzim aktiviteleri ölçülmüştür. Kinetik parametreler Lineweaver-Burk
metoduyla grafiksel olarak hesaplanmıştır. Bu amaçla 1/Substrat-1/Reaksiyon hızı
grafiği çizilmiş ve eğim ve y eksenini kestiği noktalardan Km ve Vm değerleri
hesaplanmıştır.
3.2.6.4.Termal İnaktivasyon
Sıcaklığın enzim stabilitesine etkisini belirlemek için enzim 65, 70 ve
75ºC’de (5, 10, 15 dk ) ısıtıldıktan sonra kalıntı enzim aktiviteleri belirlenmiştir.
Vidalı deney tüpü ilgili sıcaklıktaki su banyosunda 5 dk bekletildikten sonra içerisine
0.3 ml enzim konulup değişik sürelerde sıcaklığa maruz bırakılmıştır. Süre sonunda
enzim hızlı bir şekilde su banyosundan çıkarılıp buz banyosunda soğutulmuş,
ardından oda sıcaklığına getirildikten sonra enzim aktivitesi standart reaksiyon
karışımı kullanılarak ölçülmüştür. Kontrol olarak sıcaklığa maruz bırakılmayan
enzim kullanılmıştır. Sıcaklığa maruz kalan enzimlerdeki kalıntı aktivite (Et),
sıcaklığa maruz kalmamış enzimin aktivitesi (Eo) ile kıyaslanarak birinci dereceli
inaktivasyon sabiti (kd), yarı ömür (t1/2) , aktivasyon enerjisi Et, sabit bir sıcaklıktaki
enzim aktivitesinin %90’ını inaktive etmek için gereken süre (D değeri) ve D
değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için) gereken sıcaklık artışı (Z değeri)
hesaplanmıştır.
Bu değerlerin hesaplanması aşağıda özetlenmiştir. Belli bir zaman süreci
içerisinde doğal enzimin aktivitesindeki kayıplar ya da konsantrasyonundaki
azalmalar birinci dereceden kinetiğe uyar ve aşağıdaki gibi ifade edilebilir.
3.MATERYAL VE METOT Ceren TAŞ
24
kd
N D
Burada N doğal enzimi, D denatüre olmuş enzimi ve kd ise (1/zaman) enzim
için birinci dereceli inaktivasyon sabitini göstermektedir. Enzimlerin termal
inaktivasyonu genellikle birinci dereceden reaksiyonla ifade edilir:
Et= Eo. e-kdt
Et, t anındaki enzim aktivitesi ve Eo başlangıçtaki aktiviteyi, t ise ısıl işlem
uygulama süresini ifade eder. Sabit sıcaklıkta ln(Et / Eo)’ın süreye karşı grafiği
çizildiğinde, kurvenin eğimi – kd’dir.
Yarı ömür (t1/2) değeri, enzim stabilitesinin belirlenmesinde yaygın bir şekilde
kullanılan bir parametredir. Belli bir sıcaklıkta enzim aktivitesinin yarı yarıya
azalması için gereken süredir. Enzimlerin ısıl yolla inaktivasyonu çoğunlukla birinci
dereceden kinetiğe uyduğundan aşağıdaki formülden kolaylıkla hesaplanabilir:
(t1/2)=0.693/ kd
Sabit bir sıcaklıktaki orijinal enzim aktivitesinin %90’ını inaktive etmek için
gereken süre olarak tanımlanmaktadır. D değeri aşağıdaki formülden
hesaplanabileceği gibi,
D=ln(10)/ kd
log 10 (Et / Eo)’ın zamana karşı grafiğinin eğiminden de hesaplanabilir.
Eğer hız sabitleri farklı sıcaklıklarda elde edilirse denatürasyon için
aktivasyon enerjisi hesaplanabilir. Aktivasyon enerjisi aşağıda verilen Arrhenius
modeli yardımıyla hesaplanabilir.
ln kd = lnA-( Ea /RT)
A (1/zaman), kimyasal reaksiyonlar sırasında meydana gelen çarpışmaların
toplam sayısı ile ilgili bir parametredir. Ea (kj.mol-1), aktivasyon enerjisidir. R
(kj.mol-1.K-1), üniversal gaz sabiti ve T(K) mutlak sıcaklıktır.
Aktivasyon enerjisi ile yakından ilişkili bir parametre olan Z değeri, desimal
azalma süresinin (D) sıcaklığa bağımlılığını ifade eder ve enzimin ısıl direncini
yansıtan bir parametredir. Z değeri, D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma
için) gereken sıcaklık artışıdır. Log10D’nin sıcaklığa karşı grafiği çizildiğinde,
doğrunun eğimi 1/Z’dir (Marangoni, 2003).
3.MATERYAL VE METOT Ceren TAŞ
25
3.2.6.5. İnhibitörlerin Etkileri
İnhibitörlerin enzim aktivitesine etkisini belirleyebilmek için 0.01, 0.10 ve
1.00 mM konsantrasyonlarda 3 farklı inhibitör (askorbik asit, sodyum disülfit ve L-
sistein) kullanılarak enzim aktivitesi ölçülmüştür. Bunun için optimum pH’daki
tampon ile hazırlanmış 4-metil kateşol çözeltisinden 0.8 ml ve optimum pH’daki
tampon ile hazırlanmış değişik konsantrasyonlardaki inhibitör çözeltilerinden 0.1 ml
deney tüpüne konularak 5 dk 30 °C’de su banyosunda bekletilmiş ve daha sonra
üzerine 0.1 ml enzim ilave edilerek aktivite ölçümü yapılmıştır. Kontrol olarak
inhibitör kullanılmadan hazırlanan standart reaksiyon karışımında enzim aktivitesi
belirlenmiştir. İnhibisyon yüzdesi ise aşağıdaki formülden hesaplanmıştır:
İnhibisyon (%) = [(Ao – Ai)/Ao)]*100
Ao: İnhibitör kullanmadan belirlenen enzim aktivitesi
Ai: İnhibitör varlığında enzim aktivitesi.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
26
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
4.1. Enzimin Saflaştırılması
İyon değişim kromatografisinde elde edilen fraksiyonlarda absorbans (280
nm) ve enzim aktivitesi ölçümleri yapılmıştır. Aktivite ölçümleri pH’sı 4.98 olan 0.2
M sitrat tamponunda hazırlanmış, 100 mM 4-metil kateşol kullanılarak yapılmış ve
absorbans ve aktivite değerlerinden elde edilen grafik Şekil 4.1’de verilmiştir. Şekil
4.1’de görüldüğü gibi iki protein piki elde edilmiş, fakat bunlardan sadece bir
tanesinde enzim aktvitesi görülmüştür. Bu aktivite pikinde 21-26’ncı fraksiyonlar
birleştirilerek biyokimyasal özellikleri belirlenmiştir. Optimum pH değeri ( pH 4.5)
ve 50 mM 4-metil kateşol ile yapılan enzim aktivitesi ölçümlerine göre elde edilen
saflaştırma çizelgesi Çizelge 4.1’de verilmiştir. Çizelgeden de görüldüğü gibi PFO
enzimi % 24.5 verimle 11.7 kat saflaştırılmıştır.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
1 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100 109 118 127 136 145
Fraksiyon Sayısı
Abso
rban
s (2
80 n
m)
0
2000
4000
6000
800010000
12000
14000
16000
18000
PFO
akt
ivite
si (Ü
nite
/mL)
Absorbans (280 nm) PFO aktivitesi (Ünite/mL)
Şekil 4.1. DEAE-selüloz İyon Değişim Kromatoğrafisi ile Zeytin PFO’sunun Saflaştırılması.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
27
Çizelge 4.1 Zeytin PFO’sunun Saflaştırma Çizelgesi
Saflaştırma Adımları
Hacim (ml)
Toplam protein (mg)
Toplam aktivite (ünite)
Spesifik aktivite (ünite/mg protein)
Saflaştırma Katsayısı
Verim (%)
Kaba ekstrakt
270
67.446
3759210
55736.6
1.00
100.0
(NH4)2SO4 çökeltmesi ve diyaliz
40
20.6
494280
23994.2
0.43
13.1
DEAE-Toyopearl 650M
24
1.41
922320
654127.7
11.7
24.5
4.2. Optimum pH
Enzimlerin maksimum aktivite gösterdikleri bir pH veya pH aralığı vardır. Bu
optimum pH’nın altında ve üzerinde aktiviteleri düşer. Enzimler kuvvetli asit ve
bazlara fazla dayanıklı değildirler. Ortam pH’sındaki aşırı olmayan değişiklikler
enzimin ve çoğu kez de substratın iyonik durumunda değişikliklere neden olur.
Enzimler kendileri için aşırı pH değerlerinde aktivitelerini kaybederler. Enzimlerin
maksimum reaksiyon hızına sahip oldukları pH değerine optimum pH denir.
Optimum pH’nın altında ve üstündeki pH’larda enzim veya substratta mevcut
fonksiyonel grupların yapılarında değişmeler oluşur ve reaksiyon hızı da değişime
uğrar (Koolman ve Roehm, 2005). Kovalent olmayan elektrostatik bağlar, hidrojen
bağları, hidrofobik bağlar ve kovalent disülfit bağları enzimlerin üçüncül ve
dördüncül yapılarını stabilize eder. Enzim üzerindeki pozitif ve negatif gruplar
arasında oluşan elektrostatik bağlar pH’dan etkilenirler. Nötral pH'larda
iyonlaşabilen yan gruplar –COO-, H3N+ ve H2N-C gruplarıdır ve bunlar kuvvetli
elektrostatik bağlar oluşturabilirler. pH 3’ün altında karboksil grupları protonlanırlar
(-COOH) ve elektrostatik bağ oluşturamazlar. pH 10’un üzerinde ise amino grupları
protonlanırlar (-NH2) ve elektrostatik bağlar oluşturamazlar (Whitaker, 2003).
Optimum pH ‘daki bu değişiklikler, doku kültürlerinin yaşlanmasına, dokudaki stres
şartlarının artmasına ve enzimin deterjan, üre gibi, denatüre ajanlarla etkileşimine,
yüksek sıcaklığa veya kısa süreliğine asid pH'ya maruz kalmasına bağlıdır.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
28
Zeytin PFO’nun en yüksek aktivite gösterdiği optimum pH’sını belirleyebilmek
için standart reaksiyon karışımında pH’sı 3.04–6.70 arasında değişen tamponlar
kullanılarak enzim aktivitesi ölçülmüş ve sonuçlar % nispi aktivite olarak Şekil
4.2’de gösterilmiştir. Şekilden de görüleceği gibi pH 3.04’ten 4.50’a doğru aktivite
artmış en yüksek aktivite pH 4.5’te görülmüştür. Optimum pH’dan sonra enzim
aktivitesi önemli ölçüde azalarak % 20’lere kadar düşmüştür.
0
20
40
60
80
100
120
3.04 3.46 4.08 4.5 4.98 5.49 5.8 6.3 6.7
pH
Nis
bi
Akt
ivit
e (%
)
Şekil 4.2. pH’nın Zeytin PFO Aktivitesine Etkisi
Değişik ürünlerde PFO ile yapılan optimum pH çalışma sonuçları Çizelge
4.2’de verilmiştir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerden izole edilen
PFO’nun optimum pH değerleri 3–9 gibi geniş bir aralıktadır ve bu çalışmada elde
edilen sonuç (pH 4.5) literatürdeki değerlerle uyum içindedir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
29
Çizelge 4.2. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen PFO’ların Optimum pH Değerleri
*Enzimin iki optimum pH’sı bulunmuştur. 4.3 Optimum Sıcaklık
Kimyasal reaksiyonların hızı genellikle sıcaklıktaki artışla artar. Enzimlerle
katalizlenen reaksiyonların hızları da sıcaklıkla artmakla birlikte, yüksek
sıcaklıklarda enzimler protein yapılarından dolayı aktivitelerini kaybederler. Yüksek
sıcaklıklar enzimatik reaksiyonda rol oynayan fonksiyonel grupların disosiye olma
durumunu etkileyebilir; enzimin aktivatörlere ve inhibitörlere ilgisini etkileyebilir;
reaksiyonda substrat olabilecek oksijeninin çözünürlüğünü etkileyebilir. Bunların
dışında, yüksek sıcaklık enzimleri inaktive edebilir. Reaksiyon hızının maksimuma
Optimum pH
Ürün
Substrat
Kaynak
9.0 Fasulye Sürgünleri Kateşol
Nagai ve Suzuki, 2003
8.5 Kayısı (Malatya) Kateşol Arslan ve ark., 1998
7.5 Cassava kökleri Kateşol, L-Dopa Barthet,1997
7.0
Muşmula
4-Metil Kateşol
Ayaz ve ark., 2008
7.0 Patlıcan Kateşol Doğan ve ark., 2002
7.0 Anamur muzu Kateşol Ünal, 2007
5.0–7.5* Jonagored elması Kateşol Rocha ve Morais, 2001
5.0 Hint çay yaprağı Kateşol Hadler ve ark., 1998
4.0–7.0* Zambak Kateşol Yang ve Wang, 2008
3.0 Napolyon üzümü 4-tert-bütilkateşol
Delicado ve ark., 2007
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
30
eriştiği noktadaki sıcaklık derecesine optimum sıcaklık denir. Enzimlerin büyük
çoğunluğunun optimum aktivitesi 30–40 °C’dir ve 45 °C’nin üzerinde denatürasyon
başlar. Zeytin PFO’sunun en yüksek aktivite gösterdiği optimum sıcaklığı
belirleyebilmek için 20–80°C’ler arasında enzim aktivitesi ölçülmüş ve sonuçlar %
nispi aktivite olarak şekil 4.3’de verilmiştir. Ölçümlerde standart reaksiyon karışımı
kullanılmıştır.
0
20
40
60
80
100
120
20 30 40 50 60 70 80
SıcaklıkºC
% N
ispi akt
ivite
Şekil 4.3. Sıcaklığın Zeytin PFO’suna Etkisi
Şekilden de görüldüğü gibi enzim en yüksek aktiviteyi 30°C’de göstermiştir.
30°C’den itibaren sıcaklıktaki artışla beraber enzim aktivitesi azalarak % 30’lara
kadar düşmüştür.
Farklı bitkisel ürünlerde PFO ile yapılan optimum sıcaklık çalışma sonuçları
Çizelge 4.3’de verilmiştir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerden izole edilen
PFO’nun optimum sıcaklık değerleri 12-45 °C gibi geniş bir aralıktadır ve bu
çalışmada elde edilen sonuç (30°C) diğer araştırmacıların çalışmaları ile benzerlik
göstermektedir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
31
Çizelge 4.3. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen PFO’ların Optimum Sıcaklık Değerleri
Optimum Sıcaklık °C Ürün Kaynak 45 Dut Arslan ve ark., 2004 40 Fasulye Sürgünleri Nagai ve Suzuki, 2003 30 Muşmula Ayaz ve ark., 2008 30 Anamur Muzu Ünal, 2007 25 Enginar Aydemir, 2004 12 Ferula Bitkisi Erat ve ark., 2006
4.4. Kinetik Parametreler
Çeşitli ürünlerde bulunan PFO’ların substrat spesifikliği önemli bir farklılık
gösterirken, aynı ürünün farklı çeşitlerinde substrat spesifikliği büyük bir değişim
göstermeyebilir. Buna göre belli bir çeşitte PFO’nun öncelikli olarak kullandığı
fenolik bileşiklerin diğer çeşitlere kıyasla daha az bulunması durumunda, işleme
açısından bu çeşidin tercih edilmesi bir avantaj sayılabilir (Cemeroğlu ve ark., 2001).
Fenolik bileşikler PFO enzimi için birincil substratlardır. Birçok fenolik
bileşik PFO enzimi için substrat olarak görev yapar. Farklı bitki kaynaklarında çok
farklı türde ve miktarda doğal fenolik bileşikler bulunmaktadır. Örneğin klorojenik
asit üzüm ve çayda bulunan ana fenolik bileşiktir. Öte yandan klorojenik asit elma,
patates ve ayçiçeği gibi diğer birçok üründe bulunmaktadır. Kateşin, epikateşin ve
kafeik asit türevleri meyvelerde yaygın olarak bulunan fenolik bileşiklerdir. Ayrıca
muz pulpunda bulunan dopaminin endojen PFO etkisiyle oksidasyonu sonucu
enzimatik esmerleşme meydana geldiği bildirilmiştir. Bazı çalışmalarda farklı fenolik
bileşiklerin farklı esmerleşme derecesine sahip olduğu belirtilmiştir. Örneğin
üzümlerde bulunan monomerik kateşinler ve dimerik prosiyanidinler diğer fenolik
bileşiklerden daha çok esmerleşmektedir (Yoruk ve Marshall, 2003).
Substratın yan zincirinin doğası, hidroksil gruplarının sayısı ve benzen
halkasındaki pozisyonu enzimin katalitik aktivitesinde önemli etkiye sahiptir.
PFO’nun substrat spesifikliği bitki türüne ve bitkinin yetiştirme koşullarına da
bağlıdır. Örneğin, DeChaunac üzüm PFO’su kafeik asidi diğer substratlardan daha
hızlı okside etmektedir. Aynı zamanda 4-metil kateşol ve klorojenik aside karşı PFO
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
32
yüksek aktivite göstermektedir. Ancak, Koshu üzümünden elde edilen PFO
klorojenik asitte en yüksek aktivite göstermektedir ve bunu kafeik asit ve d-kateşin
izlemektedir. Öte yandan, Concord üzümü PFO’su kateşolü kafeik asitten daha hızlı
okside etmektedir (Yoruk ve Marshall, 2003).
Enzimin Km ve Vm değerlerini bulabilmek için 3.125mM-50mM arasında
değişen substrat konsantrasyonlarında enzim aktivitleri ölçülmüştür. Km ve Vm
değerleri, sırasıyla 14.52 mM ve 1.73 Abs/dk olarak hesaplanmıştır.
Değişik ürünlerden elde edilen PFO’ların Km değerleri Çizelge 4.4’te
görülmektedir. Görüldüğü gibi Km değerleri bu kaynağa göre büyük değişiklik
göstermektedir. Bu çalışmada elde edilen Km değeri bu değerlerle uyum içerisindedir.
Çizelge 4.4. Çeşitli Ürünlerin PFO’larının Km Değerleri
Ürün
Substrat
Km (mM)
Kaynak
Zambak Kateşol 3.40 Yang veWang, 2008
Anamur muzu Kateşol 8.50 Ünal, 2007 Enginar başı Kateşol 10.20 Aydemir, 2004
Hint çay yaprağı Kateşol 12.52 Halder ve ark.,1998 Cassava kökleri Kateşol 28.21 Barthet,1997
Fasulye sürgünleri Kateşol 71.00 Nagai ve Suzuki, 2003 Jonagored elması Kateşol 230.00 Rocha ve Morais, 2001
4.5. Termal İnaktivasyon
PFO’ın termal inaktivasyon kinetiği 65, 70 ve 75ºC’de 5, 10, 15 dk sürelerde
çalışılmıştır. Termal inaktivasyon parametreleri ısıl işleme maruz kalmış enzimlerin
aktivitelerinin ısıtılmamış örneğin aktivitesine kıyaslanmasıyla kD (inaktivasyon
sabiti), t1/2 (yarı ömür) ve D (desimal indigenme süresi) değerleri hesaplanmış ve
sonuçlar çizelge 4.5’de verilmiştir. Sıcaklık arttıkça kD değerleri artmış buna karşılık
enzim aktivitesini yarı yarıya azaltmak için gereken süre ve D değerleri azalmıştır.
65ºC’de enzimin yarı ömür değeri 31.9 dk iken 75ºC’de 9.24 dk olmuştur.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
33
Çizelge 4.5. Zeytin PFO’sunun Termal İnaktivasyon Parametreleri Sıcaklık (°C) kD (dak-¹) r² t½ (dak) D (dak)
65 0.0217 0.9556 31.9 106.1
70 0.0318 0.9983 21.8 72.4
75 0.0750 0.9808 9.24 30.7
Termal inaktivasyon çalışmalarının diğer önemli parametreleri aktivasyon
enerjisi (Ea) ve enzimin D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için)
gereken sıcaklık artışı ifade eden Z değeridir. Bu çalışmada, Z ve Ea değerleri
sırasıyla 18.6°C (r²=0.9532) ve 121.043 kj.mol-1 (r²=0.9496) olarak hesaplanmıştır.
Termal inaktivasyon parametrelerinin diğer araştırıcıların sonuçları ile
karşılaştırılması çalışılan sıcaklık ve sürelerdeki farklılıklar nedeniyle zordur.
Çizelge 4.6’da değişik ürünlerden izole edilen PFO enzimlerinin aktivasyon
enerjileri (Ea) değerleri görülmektedir. Bu değer ürüne göre ve hatta aynı üründe bile
önemli farklılık göstermektedir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerin
aktivasyon enerji değerleri 15.80-225.43 kj.mol-1 gibi geniş bir aralıkta
değişmektedir. Bu çalışmada bulunan Ea değeri literatürdeki değerlerle uyum
içindedir.
Çizelge 4.6. Çeşitli Ürünlerden izole edilen PFO’ların Aktivasyon Enerjileri
Ürün Ea
(kj.mol-1) Kaynak
Victoria üzümü 225.43 Râpeanu ve Bulancea, 2005
Anamur muzu 155.00 Ünal, 2007
Zambak 100.80 Yang ve Wang, 2008
Ananas püresi 82.80 Chutintrasria ve Noomhormb, 2006
Enginar başı 15.80 Aydemir, 2004
Z değerinin büyük olması enzimin ısıl dayanıklılığının diğer bir göstergesidir.
Yemenicioğlu ve arkadaşları yaptıkları çalışmada Taro yumrularından ekstrakte
ettikleri PFO enziminin Z değerinin 25.5°C olduğunu bulmuşlardır. Ünal (2007)
çalışmasında Anamur muzu PFO enziminin Z değerinin 14.2ºC olduğunu bulmuştur.
Chutintrasria ve Noomhormb (2006) çalışmalarında Ananas püresi PFO enziminin Z
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
34
değerini 21.5ºC bulmuşlardır. Râpeanu ve Bulancea (2005) Victoria üzümü PFO
enzimi ile yaptıkları çalışmada enzimin Z değerinin 9.66ºC olduğunu bulmuşlardır.
Domat zeytinindeki Z değeri ise bu değerlere yakın bulunmuştur.
4.6. İnhibitörlerin Etkisi
Enzimatik emerleşme nedeniyle meyve ve sebze ürünlerinde yıllık milyon
dolarlarca kayıplar meydana gelmektedir. Meyve ve sebze ürünlerinde olduğu kadar
deniz ürünlerinde de PFO nedeniyle meydana gelen esmerleşme reaksiyonları önemli
ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu nedenle ürünün raf ömrünü uzatmak ve
kalitesini korumak amacıyla bu enzimin kontrol altına alınması gerekmektedir. Zarar
görmüş dokuların esmerleşmesini önlemek veya azaltmak için deneysel bazı
yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu amaçla PFO aktivitesini önlemek için çeşitli
inhibitörler kullanılmaktadır. Kullanılan inhibitörler 5 grup altında toplanabilir
(Yoruk ve Marshall, 2003).
İndirgeyici ajanlar (askorbik asit ve analogları, sülfitler):
i. Çelat oluşturucu ajanlar (etilendiamintetraasetat (EDTA), sodyum
dietilditiokarbomat (DIECA), sodyum azid)
ii. Kompleks oluşturucu ajanlar (siklodekstrin, chitosan)
iii. Asitlendiriciler (askorbik asit, sitrik asit, malik asit, fosforik asit)
iv. Enzim inhibitörleri (substrat analogları, halidler)
v. Enzimatik uygulamalar (proteazlar, o-metiltransferaz)
Bu bileşikler aktif reaksiyon elementlerinden birini (enzim, substrat, bakır
veya o-kinonlar) reaksiyondan elimine etmek yolu ile esmerleşme reaksiyonlarını
inhibe eder veya azaltır (Yoruk ve Marshall, 2003).
İndirgeyici ajanlar gıda endütrisinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu
ajanlar 0-kinonların birikimini önlemek yolu ile melaninlerin oluşumunu inhibe eder
veya stabil renksiz ürünler oluştururlar. Bu ajanlardan en önemlisi sülfür dioksit
(SO2) veya sülfitlerdir (sodyum sülfit, sodyum bisülfit ve sodyum metabisülfit). Bu
ajanlar ekonomik olmaları ve esmerleşmeyi önlemede yüksek etkinliklerinden dolayı
meyve ve sebze endüstrisinde yaygınlıkla kullanılmaktadır(Yoruk ve Marshall,
2003). Sodyum disülfit, indirgeyici bir ajandır. İndirgeyici ajanlar gıda endütrisinde
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
35
yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu ajanlar o-kinonların birikimini önlemek yolu
ile melaninlerin oluşumunu inhibe eder veya stabil renksiz ürünler oluştururlar. L-
sistein ise antioksidan özellikte bir maddedir (Zawistowski ve ark., 1991).
Askorbik asit (vitamin C) ve onun izomeri eritorbik asit sülfitlere alternatif
olarak kullanılan en iyi indirgeyici ajandır ve yaygın olarak meyve suları, püreleri,
dondurulmuş dilimlenmiş meyveler ve konserve meyve ve sebzelerde
kullanılmaktadır. Askorbik asidin tükenmesinden sonra esmerleşme başlar. PFO’nun
neden olduğu esmerleşmeyi daha iyi kontrol altına almak için askorbik asit diğer
inhibitörlerle birlikte kullanılmalıdır. Örneğin askorbik asit ve sitrik asidin birlikte
kullanımı tek başına kullanılmalarından daha etkilidir.
Bu çalışmada, askorbik asit, sodyum disülfit ve L-sisteinin zeytin PFO’suna
olan inhibibe edici etkileri 0.01, 0.10 ve 1.00 mM konsantrasyonlarda incelenmiştir.
Sonuçlar % inhibisyon olarak Çizelge 4.7’de verilmiştir. Denenen tüm inhibitörlerde
% 100 inhibisyon görülmemiş, en yüksek inhibisyon derecesi % 69.63’lük
inhibisyon derecesi ile 1 mM konsantrasyonda L-Sisteinle olmuştur. L-Sistein ve
Sodyum Disülfitin inhibe edici etkileri birbirine yakın olmuş, buna karşılık askorbik
Asit en düşük inhibisyonu göstermiştir.
Çizelge 4.7. İnhibitörlerin Zeytin PFO’suna Etkileri
Ünal’ın (2007) Anamur muzu PFO’su üzerine yaptığı çalışmada askorbik asit
ve sodyum metabisülfit en etkili inhibitörler olarak bulunmuştur. NaCl ve sitrik asit
İnhibitör Konsantrasyon(mM) İnhibisyon (%)
Askorbik asit
0.01
0.10
1.00
13.20 ± 2.09
23.33 ± 6.53
31.65 ± 1.24
Sodyum disülfit
0.01
0.10
1.00
33.58 ± 0.58
59.66 ± 5.33
69.42 ± 2.78
L-Sistein
0.01
0.10
1.00
23.71 ± 0.23
48.48 ± 8.4
69.63 ± 3.01
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ
36
daha az etkili bulunmuştur. Ziyan ve Pekyardımcı’nın (2003) Ankara armudu
PFO’su üzerine yaptıkları çalışmada sodyum dietilditiyokarbamat en etkili inhibitör
olarak bulunmuştur. Rapeanu ve arkadaşları (2006), Güney Afrika’da yetişen
Viktorya üzümlerinden ekstrakte ettikleri PFO enzimi üzerinde sekiz inhibitör test
etmişler ve en etkili inhibitörlerin askorbik asit, L-sistein ve sodyum metabisülfit
olduğunu bildirmişlerdir.
Orenes-Pinero ve ark. (2006), yaptıkları çalışmada ayva PFO’sunu kısmi
olarak saflaştırarak birkaç inhibitörün etkisini denemişler ve en etkili inhibitörün
tropolon olduğunu bulmuşlardır. Yağar ve Sağıroğlu (2000), PFO enzimini ayvadan
ekstrakte ettikleri çalışmada, sekiz çeşit inhibitörü test etmişler ve ayva PFO’su
üzerinde en etkili olanlarının L-sistein, askorbik asit, potasyum siyanid olduğunu
bulmuşlardır.
Yang ve Wang’ın (2008) zambak bitkisi PFO’su üzerine yaptıkları çalışmada
en etkili inhibitör sodyum sülfit (0.1 mM) bulunurken, askorbik asit, L-sistein ve
tiyoürenin yüksek konsantrasyonlarda (10 mM) oldukça etkili inhibe edici etki
gösterdiği bulunmuştur. NaCl ve sitrik asit bu bitki enzimi için zayıf inhibitörler
olarak belirtilmiştir. Nagai ve Suzuki’nin (2003) fasulye filizi PFO’su üzerine
yaptıkları çalışmada 3 mM konsantrasyonda askorbik asit, L-sistein, 2-
merkaptoetanol ve glutation etkili inhibitörler olarak gösterilmiştir.
5.SONUÇ Ceren TAŞ
37
5. SONUÇ
Bu çalışmada Domat çeşidi zeytinden izole edilerek kısmen saflaştırılan
polifenol oksidaz’ın (PFO) biyokimyasal özellikleri araştırılmıştır. Bu bağlamda,
enzimin optimum pH ve sıcaklığı, kinetik parametreleri, termal inaktivasyonu ve
bazı inhibitörlerin etkisi incelenmiştir.
Elde edilen bulgulardan;
§ Substrat olarak 4-metil kateşol kullanılmış ve enzimin Km değerinin
14.52 mM, Vm değerinin ise 1.73 Abs/dk olduğu,
§ pH 3.04’den pH 4.5’a doğru arttırıldıkça, enzim aktivitenin de arttığı,
en yüksek aktivitenin pH 4.5’da görüldüğü ve enzim aktivitesinin
optimum pH’dan sonra önce hızlı sonra yavaş olarak düştüğü,
§ Enzimin en yüksek aktiviteyi 30°C’de gösterdiği, 30°C’den itibaren
sıcaklıktaki artışla beraber enzim aktivitesinin hızla azalarak 70 °C’de
yaklaşık % 20’ye düştüğü,
§ Enzimin Z ve Ea değerlerinin 18.55°C (r²=0.9532) ve
121.043 kj.mol-1 (r²=0.9496) olduğu,
§ L-Sistein ve sodyum disülfitin inhibe edici etkilerinin birbirine yakın
olduğu buna karşılık askorbik asitin inhibisyon etkisinin denen diğer
inhibitörlere göre daha düşük olduğu belirlenmiştir.
38
KAYNAKLAR
ANONİM, 2001. Tarımsal Göstergeler (1998-2004). T.C. Başbakanlık Devlet
İstatistik Enstitüsü Yayınları, Ankara.
ANONİM, 2004, Food and Agriculture Organization of the United
Nations.(1998-2004).
ANONYMOUS, 2006b, Modern Zeytincilikte Kültürel İşlemler
www.zae.gov.tr/yetiştirme/41.asp.
ARSLAN, O., TEMUR, A., ve TOZLU, İ., 1998. Polyphenol oxidase from
Malatya apricot (Prunus armeniaca L.). Journal of Agriculture and
Food Chemistry, 46: 1239-1241.
ARSLAN, O., ERZENGİN, M., SİNAN, S. ve ÖZENSOY, Ö., 2004.
Purification of Mulbery (Morus alba L.) polyphenol oxidase by Affinity
Chromatography and Investigation of Its Kinetic and Electrophoretic
Properties. Food Chemistry, 88:479-484.
AYAZ, F.A., DEMIR, O., TORUN H., KOLCUOGLU Y. ve ÇOLAK, A.,
2008.Characterization of Polyphenoloxidase (PPO) and Total Phenolic
Contents in Medlar (Mespilus germanica L.) Fruit During Ripening and
Over Ripening, Science Direct, Food Chemistry, 106: 291–298.
AYDEMİR, T., KAVRAYAN, D., ve ÇINAR, S., 2003. Isolation and
Characterisation of Polyphenoloxidase from Jerusalem Artichoke
(Helianthus tuberosus) S.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi Fen Dergisi, Sayı
21, 115-125, KONYA.
AYDEMİR, T., 2004. Partial Purification and Characterization of Polyphenol
Oxidase from Artichoke (Cynara scolymus L.) Heads, Food Chemistry,
87: 59–67.
AYDIN, C., 2000. Bazı Zeytin Çeşitlerinde Meyvenin Fiziko- Mekanik
Özellikleri, Selçuk Ü. Zir. Fak. Dergisi 14 (23): 83-88.
39
BARTHET, V. J. 1997. Polyphenol Oxidases from Cassava (Manihot
Esculenta C.)Root: Extraction, Purification and Characterization,
Submitted to PartialFulfilment of the Requirements for the degree
Philosophiae Doctor in the Department of Food Science and
Agricultural Chemistry University McGiU (Macdonald Campus)
Montreal, PQ, Canada, i-ii.
BEN-SHALOM, N., KAHN, V., HAREL, E. ve MAYER, A.M. 1977. Journal
of Science of Food and Agriculture, 28:545.
BOSKOU, D. 1996. Oive Oil Chemistry and Techonology. AOCS Press,
Champaign,IL, 161p, USA
BOZDOĞAN, D., 2002. Hatay’da Üretilen Natürel Zeytin Yağlarının Bazı
Fiziksel, Kimyasal ve Duyusal Özelliklerinin İncelenmesi. Mustafa
Kemal Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi,
Antakya.
BRADFORD, M. M., 1976. a Rapid and Sensitive for the Quantitation of
Microgram Quantitites of Protein Utilizing the Principle of Protein-dye
Binding, Analytical Biochemistry, 72: 248-254.
BRENES-BALBUENA, M., ROMERO, C., GARCIA, P. ve GARRIDO, A.,
1995. Effect of pH on the Colour Formed by Fe-Phenolic Complexes in
Ripe Olives. J. Sci. Food Agric., 67: p. 35-41.
CASADO-VELA, J., SELLES, S. ve BRU, R., 2005. Purification and Kinetic
Characterization of Polyhphenol oxidase from Tomato Fruits. Journal of
Food Biochemistry, 29:381-401.
CASH, J. N., SİSTRUNK, W. A., ve STUTTE, C. A. 1976. Characteristics of
concord grape polyphenoloxidase involved in juice color loss. Journal
of Food Science, 41, 1398–1402.
CEMEROĞLU, B., YEMENİCİOĞLU, A. ve ÖZKAN, M., 2001. Meyve ve
Sebzelerin Bileşimi Soğukta Depolanmaları, Gıda Teknolojisi Derneği
Yayınları No:24, Ankara.
40
CHUTINTRASRIA, B. ve NOOMHORMB, A., 2006. Thermal Inactivation of
Polyphenoloxidase in Pineapple Puree, LWT - Food Science and
Technology, 39: 492–495.
COSETENG, M.Y., LEE, C.Y. ve 1987. Changes in Apple Polyphenoloxidase
and Polyphenol Concentrations in Relation to Degree of Browning,
Jounal of Food Science, 4, 985-989.
DELICADO,E. N, MEGI´AS, M.S., LO´PEZ, A.J.P. ve NICOLA´S, J.M.L.,
2007. Characterization of Polyphenol Oxidase from Napoleon Grape,
Food Chemistry, 100: 108–114.
DING, C., CHACHIN, K., UEDA, Y. ve IMAHORI, Y., 1998. Purification and
Properties of Polyphenol oxidase from Loquat. Journal of Agriculture
and Food Chemistry, 46: 4144-4149.
DOĞAN, M., ARSLAN, O. ve DOĞAN, S., 2002. Substrate specificity, heat
inactivation and inhibition of polyphenol oxidase from different
aubergine cultivars International Journal of Food Science and
Technology 2002, 37, 415-423.
ESPİN, J.C., TUDELA, J. ve GARCİA-CANOVAS, F., 1997.Monophenolase
Activitiy of Poliphenol Oxidase from Artichoke Heads (Cynara
scolymus L.). Lebensmittel Wissenschaft u. Technology, 30 (1997)819-
825 .
ESTİ, M., CİNQUANTA, L. ve LA NOTTE, E., 1998. Phenolic Compounds in
Different Olive Varieties. J. Agric. Food Chemistry, 46 (1): s. 32-35.
FAO, 2004. http://www.fao.org.
GAUILLARD, F. ve RICHARD-FORGET, F., 1997. Polyphenoloxidase from
Williams Pear (Pyrus communis L, cv Williams): Activation,
Purification and Some Properties. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 74:49-56.
41
GARCIA, P., CONCEPCION, R., BRENES, M. ve GARRIDO, A., 1996.
Effect of Metal Cations on the Chemical Oxidation of Olive o-diphenols
in Model Systems. J. Agric. Food Chem., 44 (8): s. 2101-2105.
GODFREY, T. ve WEST, S., 1996. Industrial Enzmology. Stockton Pres, New
York.
GΌMEZ, V. M., 2002. Some biochemical properties of polyphenol oxidase
from two varieties of avocado, Food Chemistry 77 (2002) 163-169.
GOUPY, P, FLEURIET,A., AMIOT, M. ve MACHEIX, J., 1991. Enzymatic
Browning, Oleuropein Content, and Diphenol Oxidase Activity in Olive
Cultivars (Olea europaea L.). Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 39: 92-95.
GÜLÇİN, İ., KÜFREVİOĞLU, Ö. İ. ve OKTAY, M., 2005. Purification and
Characterization of Polyphenol oxidase from Netle (Urtica dioica L.)
and inhibitory effects of some chemicals on enzyme activity. Journal of
Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 20(3):297-302.
HALDER, J., TAMULI, P. ve BHADURI, A.N., 1998. Isolation and
Characterization of Polyphenol Oxidase from Indian Tea Leaf
(Camellia sinensis), Nutritional Biochemistry, 9: 75-80.
INGEBRIGSTEN, J., KANG, B. ve FLURKEY, M.W.H. 1989. Journal of
Food Science, 54:128.
KEÇELİ, T., 2000. Antimicrobial and Antioxidant Activity of Olive Oil
Phenolics, in Food Science and Tecnology. The University of Reading :
Reading 312s.
KEÇELİ, T. ve GORDON, M.H., 2001. The Antioxidant Activity and Stability
of the Phenolic Fraction of Green Olives and Extra Virgin Olive Oil. J.
Sci. Food and Agric., 81: s. 1391-1396.
KOOLMAN, J. ve ROEHM, K. H., 2005. Color Atlas of Biochemistry, 2nd Ed.
Thieme, Stuttgart, s. 88-94.
42
KRISTAKIS, A. K., 1998. Olive Oil. From Tree to the Table. 2nd Edition.
Food & Nutrition Pres., Inc., 347 s.
MARANGONI, A. G., 2003. Enzyme Kinetics: A Modern Approach, New
Jersey: John Wiley & Sons, 140-157.
MAZZAFERA P. ve ROBİNSON S.P., 2000. Characterization of polyphenol
oxidase in coffee. Phytochemistry 55: 285-296.
MONTEDORO, G., 1993. Simple and Hydrolyzable Phenolic Compounds in
Virgin Olive Oil. 3. Spectroscopic Characterisations of Secoiridoid
Derivatives. J. Agric.,Food Chem., 41: 2228-2234.
MUCHUWETI, M., MUPURE, C. H., NDHLALA, A. R. ve
KASIYAMHURU, A., 2006. Characterization of Polyphenoloxidase
from Uapaca kirkiana Fruit. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 86: 328-332.
NAGAI, T. ve SUZUKI, N., 2003. Polyphenol Oxidase from Bean Sprouts
(Glycine max L.), Journal of Food Science (68) issue 1, 16-20.
NAKAMURA, K., AMANO, Y. VE KAGAMİ, M., 1983. Purification and
some properties of a polyphenol oxidase from Koshu grapes. Journal
Enology Viticulture, 34:122-127.
ORENES-PINERO, E., GARCIA-CARMONA, F., SANCHEZ-FERRER, A.,
2006. Latent Polyphenoloxidase from Quince Fruit Pulp (Cydonia
oblonga): purification, activation and some properties. Journal of the
Science of Food and Agriculture, 86:2172-2178.
ÖKSÜZ, E., 1998. Ülkemizde Zeytin Hasat Mekanizasyon Düzeyi, Hasat
Edilebilirlik Kriterleri ve Maliyetinin Belirlenmesi Üzerine Bir
Araştırma, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Tarım
Makineleri Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Adana.
RAPEANU, G. ve BULANCEA, M., 2005. Thermal Inactivation Kinetics of
Polyphenoloxidase Extracted from White Grapes, Acta Universitatis
Cibiniensis Series E: Food Technology, Vol. IX, no.1.
43
RAPEANU, G., LOEY, A. V., SMOUT, C. ve HENDRİCKX, M., 2006.
Biochemical Characterization and Process Stability of
Poliphenoloxidase Extacted from Victoria Grape (Vitis vinifera ssp.
Sativa) . Food Chemistry 94 (2006) 253-261.
ROBARDS, K., PRENZLER, P. D., TUCKER, G., SWATSITANG, P. ve
GLOVER, W., 1999. Phenolic Compounds and Their Role in Oxidative
Process in Fruits. Food Chemistry., 66 (4): s. 401-436.
ROCHA, A.M.C.N., CANO, M.P., GALEAZZI, M.A.M. ve MORAIS,
A.M.M.B., 1998. Characterisation of “Starking” Apple
Polyphenoloxidase. Journal of the Science of Food and Agriculture,
77:527-534.
ROCHA, A.M.C.N. ve MORAIS, A.M.M.B., 2001. Characterization of
Polyphenoloxidase (PPO) Extracted from "Jonagored" Apple, Food
Control, 12: 85-90.
RYAN, D., ve ROBARDS, K., 1998. Phenolic Compounds in Olives. Analyst,
123 (5) : s. 31R – 44R.
RYAN, D., ROBARDS, K. ve LAVEE, S., 1999a. Determination of
PhenolicCompounds in Olives by Reversed Phase Chromatography and
Mass Spectrometry. J. Chromatography, 832 (1-2): s. 87-96.
SABANCILAR, İ., EMRE, Ö., BAYCAN, Y.S., DEMİR, H. ve ERGE, H.,
2007, Denizli Narından Afinite Kromatografisi Yardımı ile Polifenol
Oksidaz Enziminin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu, Yüzüncü Yıl
Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, Kimya Eğitimi ABD, VAN. Yüzüncü
Yıl Üniversitesi, Fen-Edb. Fakültesi, Kimya Bölümü, Biyokimya ABD,
VAN.
SAIJA, A., TROMBETTA, D., CASCIO, R., PRİNCİ, P., UCCELLA,
N.,BONİNA, F. ve CASTELLİ, F., 1998. 'In Vitro' Evaluation of the
Antioxidant Activity and Biomembrane Intraction of the Plant Phenols
44
Oleuropein and Hydroxytyrosol. _nternational Journal of
Pharmaceutics, 166 (2): s. 123-133.
SANCHEZ-FERRER, A., BRU, R., CABANES, J. ve GARCİA-CARMONA.,
F., 1988. Characterizition of catecholase and cresolase activities of
Monastrell grape polyphenol oxidase. Phytochemistry, 27: 319-321.
SANCHEZ-FERRER, A., BRU, R., VALERO, E. ve GARCİA-CARMONA.,
F., 1989. Changes in pH-dependent grape polyphenol oxidase acitivity
during maturation. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 37:
1242-1245.
SAYGILI, N., LEBLEBİCİ, F. ve KÖKSEL, H. 1998. Farklı şeker pancarı
türlerindeki polifenoloksidaz varlığının araştırılması. Gıda Dergisi,
(98/3); 165 –169.
SCIANCALEPORE, V. ve LONGONE, V. 1984. Journal of Agriculture and
Food Chemistry 32:320.
SERRADELL, M. A., ROZENFELD, P. A., MARTINEZ, G. A., CIVELLO, P.
M.,CHAVES, A. V. ve ANON, M. C., 2000. Polyphenoloxidase
Activity From Strawberry Fruit (Fragaria x ananassa, Duch., cv Selva):
Characterisation and Partial Purification, Journal of the Science of Food
and Agriculture, 80: 1421-1427.
SEGOVIA-BRAVO, K., JAREN-GALAN, M., GARCIA-GARCIA, P., ve
GARRIDO-FERNANDEZ, A., 2007. Characterization of Polyphenol
oxidase from the Manzanilla Cultivar (Olea europea pomiformis) and
prevention of Browning Reactions in Bruised Olive Fruits. Journal of
Agriculture and food Chemistry. DOI 10.1021/jf063675f.
TSİMİDOU, M., 1998. Polyphenols and Quality of Virgin Olive Oil in
Retrospect. Ital. J. Food Sci., 10: 99-116.
ULAŞ, M., 2001. Çukurova Bölgesinde Yaygın bazı Sofralık ve Yağlık Zeytin
Çeşitlerinin Morfolojik, Fenolojik ve Pomolojik Özelliklerinin
45
Belirlenmesi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe
Bitkileri Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Adana.
ÜNAL, M. Ü. ve ŞENER, A., 2006. Determination of Some Biochemical
Properties of Polyphenol Oxidase from Emir Grape (Vitis vinifera L.
cv. Emir), Journal of the Science of Food and Agriculture, 86: 2374–
2379.
ÜNAL, M. Ü., 2007. Properties of Polyphenol Oxidase from Anamur Banana
(Musa cavendishii), Food Chemistry, 100: 909-913.
WEEMAES, C. A., LUDIKHUYZE, L. R., BROECK, I. V., HENDRICKX, M.
E. ve TOBBACK, P.P., 1998. Activity Electrophoretic Characteristics
and Heat Inactivation of Polyphenoloxidase from Apples, Avocados,
Grapes, Pears and Plums. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technogile,
31:44-49.
WHITAKER, J. R., 2003. Enzyme Catalyzed Reactions: Experimental Factors
that Affect Rates, Handbook of Food Enzymology (Editörler; Whitaker,
J. R., Voragen, A. G. J. ve Wong D. W. S) Marcel Dekker, New York,
31-65.
WISSEMANN, K. W. ve LEE, C. Y., 1981. Characterization of
Polyphenoloxidase from Ravat 51 and Niagara Grapes.
Joural of Food Science, 46:506-508.
YAGAR, H. ve SAĞIROĞLU A., 2000, Partially Purifcation and
Characterization of Polyphenol Oxidase of Quince, Trakya University,
Department of Chemistry, 22030 Edirne-TURKEY.
YAGAR, H., 2004. Some Biochemical Properties of Poliphenol Oxidase from
Celery. Preparative Biochemistry and Biotechnology vol. 34, no. 4,
(2004) 378-397.
YANG, Y. ve WANG, Z., 2008. Some Properties of Polyphenol Oxidase
from Lily,International Journal of Food Science and Technology, 43:
102–107.
46
YEMENİCİOĞLU, A. ve CEMEROĞLU, B., 1996. Hale Haven
Şeftalilerinde Polifenoloksidaz Enzimlerinin Bazı Nitelikleri. Journal of
Agricultural and Forestry, 22:261-265.
YEMENİCİOĞLU, A., ÖZKAN, M. ve CEMEROĞLU, B.,1997. Inactivation
Kinetics of Apple Polyphenoloxidase and Activation of its Latent Form.
Journal of Food Science, Volume 62, No. 3, (1997) 508-510.
YEMENİCİOGLU, A., OZKAN, M. ve CEMEROGLU, B. (1999). Some
characteristics of polyphenol oxidase and peroxidase from taro
(Colocasia antiquorum). Turkish Journal of Agriculture and Forestry,
23, 425–430.
YORUK, R. ve MARSHALL, M. R., 2003. Physicochemical Properties and
Function of Plant Polyphenol Oxidase: A review. Journal of Food
Biochemistry, 27: 361-422.
ZAWISTOWSKI, J., BILIADERIS, C. G., ve ESKIN, N. A. M., 1991.
Polyphenol Oxidase (D. S. Robinson and N. A. M. Eskin editör).
Oxidative Enzymes in Foods, Elsevier, s. 217-273.
ZİYAN, E., ve PEKYARDIMCI, Ş., 2003. Characterization of polyphenol
oxidase from Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus). Turkish
Journal of Chemistry, 27:217-225.
47
ÖZGEÇMİŞ
1983 yılında İstanbul’da doğdum. İlköğrenimimi Trabzon’da, orta ve lise
öğrenimimi İstanbul’da tamamladım. 2002 yılında Çukurova Üniversitesi Gıda
Mühendisliği Bölümünde lisans öğrenimime başladım. 2006 yılında Gıda Mühendisi
unvanı ile mezun oldum. 2006 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı’nda yüksek lisans öğrenimime başladım. Hala
Yüksek lisans öğrenimime devam etmekteyim.