ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ …I ÖZ YÜKSEK LİSANS DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Ceren TAŞ

DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL

ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Ceren TAŞ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 30/06/2009 tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oybirliği/oyçokluğu ile kabul edilmiştir. İmza:……………… İmza:……………… İmza:……………… Doç.Dr.M.Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Doç. Dr. Sertaç Özer Danışman Üye Üye Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No:

Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve mühür

Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF 2008 YL 19 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ

I

ÖZ

YÜKSEK LİSANS

DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Ceren TAŞ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

Danışman : Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL

Yıl : 2009, Sayfa : 47 Jüri : Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL

Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Doç. Dr. M. Sertaç ÖZER

Bu çalışmada, Çukurova bölgesinde yetiştirilen Domat çeşidi zeytinden izole

edilen ve kısmen saflaştırılan polifenol oksidaz enziminin (PFO) optimum sıcaklık,

optimum pH, kinetik parametreler, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi gibi

biyokimyasal özellikleri araştırılmıştır.

Substrat olarak 4-metil kateşol kullanılmış ve enzimin Km değerinin 14.52

mM, Vm değerinin ise 1.73 Abs/dk olduğu bulunmuştur. PFO aktivitesi için optimum

pH değeri 4,5 olarak bulunmuş ve optimum pH’dan sonra enzim aktivitesinde hızlı

bir düşüş görülmüştür. Enzimin optimum sıcaklığı 30°C olarak bulunmuştur. Enzim

20-50°C gibi sıcaklık aralığında %70’in üzerinde aktivite göstermiştir. Enzimin

aktivasyon enerjisi (Ea) ve Z değerleri sırasıyla, 121 kj.mol-1 (r²=0.9496) ve 18.55°C

(r²=0.9532 olarak hesaplanmıştır. Denenen inhibitörlerden en düşük inhibisyon etkisi

askorbik asit’te görülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Zeytin, enzimatik esmerleşme, polifenol oksidaz, kinetik,

termal inaktivasyon.

II

ABSTRACT

MSc THESIS

DETERMINATION OF BIOCHEMICAL PROPERTIES OF POLYPHENOL OXIDASE FROM DOMAT OLIVE

Ceren TAŞ

DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING

INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisor : Assoc. Prof. Dr .M. Ümit ÜNAL

Year : 2009, Pages : 47 Jury : Assoc. Prof. Dr. M. Ümit ÜNAL

Prof. Dr. Sadık DİNÇER Assist. Prof. Dr. M. Sertaç ÖZER

This research was undertaken to determine some of the biochemical

properties (substrate specificity, optimum pH, optimum temperature, heat

inactivation, and effect of inhibitors) of polyphenol oxidase (PPO) which was

isolated from Domat olives grown in Çukurova region and partially purified.

4-methylcatechol was used as substrate and Km dand Vm values of the

enzyme were found to be 14.52 mM and 1.73 Abs/dk, respectively. The optimum pH

and temperature for PPO activity was found to be 4.5 and 30°C, respectively. After

the optimum pH enzyme activity declined rapidly. The enzyme had more than 70%

activity between 20-50°C. Energy of activation (Ea) and Z values were found to be

121 kj.mol-1 (r²=0.9496) and 18.55°C (r²=0.9532), respectively. Of the inhibitors

tested, ascorbic asid was the least effective inhibitor.

Key Words: Olive, enzymatic browning, polyphenol oxidase, kinetics,

thermal inactivation.

III

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans eğitimim boyunca, çalışmanın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi

ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren, bana yol gösteren ve

destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danışman hocam Sayın Doç.

Dr. M. Ümit Ünal’a teşekkürlerimi sunarım.

Çalışmamın her aşamasında yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen;

Araştırma Görevlisi Aysun Şener’e ve değerli arkadaşım Murat Yılmaz’a,

İlgi, sabır ve maddi manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen babam

Ahmet Taş, annem Hatun Taş ve ablam Derya Taş’a,

Destek ve katkılarından dolayı Çukurova Üniversitesine ve Gıda

Mühendisliği Bölümü personeline teşekkürlerimi borç bilirim.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ........................................................................................................................ I

ABSTRACT........................................................................................................ II

TEŞEKKÜR........................................................................................................ III

İÇİNDEKİLER.................................................................................................... IV

ÇİZELGELER DİZİNİ........................................................................................ VI

ŞEKİLLER DİZİNİ............................................................................................. VII

1.GİRİŞ……........................................................................................................ 1

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR................................................................................ 3

2.1.Dünya Zeytin Üretimi ve Türkiye’nin Bu Üretimdeki Payı...................... 3

2.2. Türkiye Zeytin Ağacı Varlığı ve Üretim Durumu.................................... 4

2.3. Zeytin Danesinin Yapısı........................................................................... 6

2.4. Zeytinin Bileşimi...................................................................................... 6

2.5. Polifenol Oksidaz Enzimi......................................................................... 8

3.MATERYAL ve METOT……….………………………………………….... 20

3.1.Materyal………………………...…………..…………………………..... 20

3.1.1.Analizlerde Kullanılan Araç-Gereç ve Kimyasal Maddeler………… 20

3.2.Metot……………….……………………………………………………. 20

3.2.1.Polifenol Oksidaz Ekstraktının Hazırlanması ……………………… 20

3.2.2.Enzimin Kısmi Saflaştırılması………………………………………. 21

3.2.3. İyon Değişim Kromatografisi ile Saflaştırma……………………….. 21

3.2.4.Protein Tayini………………………………………………………… 21

3.2.5.Enzim Aktivitesinin Ölçümü…………………………………………. 22

3.2.6.Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi………………….. 22

3.2.6.1.Optimum pH………………………………………………….. 22

3.2.6.2.Optimum Sıcaklık………………………………….…………. 22

3.2.6.3.Kinetik Parametreler……………………………………..…… 23

3.2.6.4.Termal İnaktivasyon………………..………………………… 23

3.2.6.5.İnhibitörlerin Etkileri………………………………...……….. 25

V

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA……………………………... 26

4.1.Enzimin Saflaştırılması……….………………....……….……………... 26

4.2.Optimum pH……………………………………………………...……... 27

4.3.Optimum Sıcaklık………………...…………………………...………… 29

4.4.Kinetik Parametreler…………………………………………………...... 31

4.5.Termal İnaktivasyon………………………………………….…………. 32

4.6. İnhibitörlerin Etkisi..………..………………………………………….. 34

5.SONUÇ.............................……………........................................................... 37

KAYNAKLAR…………………………………………………………….... 38

ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………. 47

VI

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1 Dünya Zeytin Alanlarının Ülkelere Göre Dağılımı.................... 3

Çizelge 2.2. Dünya Zeytin Üretiminin Ülkelere Göre Dağılımı..................... 3

Çizelge 2.3. Ülkemizde Bölgeler İtibariyle Zeytin Üretimi........................... 5

Çizelge 2.4. Zeytin Tanesinin Ortalama Bileşimi........................................... 7

Çizelge 4.1 Zeytin PFO’sunun Saflaştırma Çizelgesi.................................... 28

Çizelge 4.2. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enziminin

Optimum pH Değerleri............................................................... 30

Çizelge 4.3. Çeşitli Ürünlerden Elde Edilen Polifenol Oksidaz Enzimlerinin

Optimum Sıcaklık Değerleri…………………………………… 32

Çizelge 4.5. Çeşitli Ürünlerin Polifenol Enzimlerinin Km Değerleri ……… 34

Çizelge 4.6. Beyaz Kiraz Polifenol Oksidaz Enziminin Termal İnaktivasyon

Parametreleri …………………………………………………… 34

Çizelge 4.7. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enzimlerinin

Aktivasyon Enerjileri ………………………………………….. 35

Çizelge 4.8. İnhibitörlerin Beyaz Kiraz Polifenol Oksidaz Enzimine

Etkileri ………………………………………………………… 36

VII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA

Şekil 2.1. Türkiye’nin Zeytin Üretim Alanlarını Gösteren Harita.............. 5

Şekil 2.2. Zeytin Danesinin Yapısı............................................................. 6

Şekil 2.3. Zeytinin Temel Fenolik Bileşenlerinin Kimyasal Yapısı........... 8

Şekil 2.4. Enzimatik Esmerleşme Mekanizması......................................... 11

Şekil 4.1. DEAE-selüloz İyon Değişim Kromotografisi ile Zeytin

PFO’sunun Saflaştırılması………………….............................. 27

Şekil 4.4. Sıcaklığın Zeytin PFO’suna Etkisi …………………………… 31

1. GİRİŞ Ceren TAŞ

1

1. GİRİŞ

Zeytin ağacı, tarihin her aşamasında Akdeniz’de kurulan bütün uygarlıkların

vazgeçilmez bir parçasını oluşturmuştur. Anadolu’nun en eski kültür bitkilerinden

olan zeytin, oleceae familyasının, Olea cinsinin Oleaeuropa türünün Oleaeuropa

sativa alt türünü teşkil etmektedir. Akdeniz iklim kuşağında en iyi yetiştirme

koşullarını bulmuş olan zeytinin gen merkezinin, Güneydoğu Anadolu’da Hatay,

Kahramanmaraş ve Mardin üçgeninde olduğu ve buradan da dünyaya yayıldığı

birçok yazar tarafından doğrulanmaktadır. Güneydoğu Anadolu’dan önceleri Batı

Anadolu’ya yayılan zeytin, Ege Adaları yoluyla Yunanistan, İtalya, Fransa ve

İspanya’ya kadar ulaşmıştır (Bozdoğan, 2002). Dünya üzerinde ekonomik olarak

zeytin yetiştiriciliği 300–450 kuzey ve güney enlemleri arasında yapılmaktadır (Ulaş,

2001).

Geleneksel olarak zeytin hasadı elle yapılmaktadır. Bu işlemin fiyatı

işlenmemiş zeytin fiyatının % 50-70’ini oluşturmaktadır. Son zamanlarda ise zeytin

hasadı büyük makinelerle zeytin ağaçlarının sallanması veya küçük makinelerle

zeytin ağacı dallarının hareketi ile mekanik olarak yapılmaktadır. Ancak mekanik

yöntem hasat sırasında zeytinlere zarar verip ezme ve berelenmelere neden

olabilmektedir. Yeşil zeytinlerin mekanik olarak toplanması istenmez çünkü yeşil

zeytinin mekanik olarak hasadı sırasında zedelenmeler nedeni ile zeytinlerde

kahverengi lekeler oluşmaktadır. Bu durum zeytinlerin kalitesinin düşmesine ve

istenmeyen görünüm nedeni ile tüketici açısından kabul görmemesine neden

olmaktadır. Zeytinlerde görülen kahverengi lekeler esmerleşme reaksiyonlarından

kaynaklanmaktadır (Segovia-Bravo ve ark., 2007).

Hasat sonrası depolama veya meyve ve sebzelerin işlenmesi sırasında

mekanik zedelenmelerden kaynaklanan esmerleşme reaksiyonları çok sık

görülmektedir. Meyve ve sebzelerde görülen bu esmerleşme reaksiyonları polifenol

oksidaz (PFO) enziminin fenolik bileşiklerle reaksiyonu sonucu meydana

gelmektedir (Godfrey ve West, 1996).

Fenol bileşiklerinin miktarı ve çeşidi zeytinin olgunlaşmasına çeşidine, yağış

miktarına, sıcaklığa bağlı olarak değişmektedir. Bu nedenle bazı çeşitler fenol

1. GİRİŞ Ceren TAŞ

2

bileşenlerce zengin bazı çeşitler ise fakirdir. Zeytinde bulunan başlıca fenolik

bileşenler; oleuropein, verbaskosid, ligrosit gibi fenolik glikozitler ile flavonoidler,

flavonol glikozitleri, antosiyaninler ve glikozitleri, fenolik asitler ve diğer

bileşenlerdir (Ryan ve Robards, 1998; Keçeli, 2000).

Fenolik bileşiklerin oksidasyonla esmerleşmesi sonucu oluşan renk, sofralık

siyah zeytin için istenilen bir değişimdir. Polifenollerin oksidatif kararması, zeytinde

bulunan enzimlerin (difenoloksidaz) veya zeytinde bulunmayan ve dışarıdan katılan

metal katyonlarının katalitik etkisiyle oluşmaktadır (Garcia ve ark., 1996; Robards ve

ark., 1999).

PFO, oksidoredüktaz grubuna giren enzimlerdir ve bakır içerirler. Substratları

fenolik bileşiklerdir. Özellikle bitkiler âleminde yaygın olarak bulunan PFO’lar

hayvansal dokular ve küf mantarlarında da bulunmaktadırlar. Substratlarını oksijen

eşliğinde esmer renkli bileşiklere oksitlemektedirler. Bu olay gıda teknolojisinde

enzimatik esmerleşme olarak da bilinmektedir (Godfrey ve West, 1996).

Bu çalışmada Domat zeytini kullanılmıştır. Domat zeytini Türkiye’nin en

önemli yeşil sofralık çeşididir. Meyvesi iri, silindirik yapıda olup, saptan meyve

ucuna doğru bir sırt bulunur. Kilogramdaki ortalama dane adedi 180–200 arasında

değişir. Et- çekirdek oranı 5/1 ve yağ miktarı %20–22 dir. En uygun hasat zamanı

Ekim ayıdır. Zeytinler hasattan sonra tatlandırılır ve fermantasyon kaplarında

stoklanır. Fermantasyonunu tamamlamış zeytin karakteristik bir sarı renk alır.

Ülkemizde zeytin PFO’su üzerine çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmanın

amacı zeytinden PFO enzimini ekstrakte ederek kısmen saflaştırmak ve enzimin

optimum pH, sıcaklık, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi ve kinetik

parametreler gibi özelliklerini belirlemektir.

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ceren TAŞ

3

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

2.1. Dünya Zeytin Üretimi ve Türkiye’nin Bu Üretimdeki Payı

Dünya zeytin üretiminin yaklaşık % 97’sini karşılayan Akdeniz havzası

ülkelerinin başında İtalya, İspanya, Yunanistan, Türkiye, Tunus, Portekiz ve Fas

gelmektedir (Bozdoğan, 2002). İspanya dünyada en fazla zeytin alanına sahip ülke

durumundadır (Çizelge 2.1). FAO kaynaklarına göre 2004 yılı Dünya zeytin üretimi

15 340 488 ton olup, ülkemizde ise 1 800 000 ton’dur (Çizelge 2.2). Dünya zeytin

üretimi bakımından Türkiye, % 10.7’lik bir payla 4. sırayı almaktadır (Bozdoğan,

2002).

Ülkemizde zeytin üretiminin hala ilkel yöntemlerle yapılması nedeniyle üründe

büyük zararlar oluşmakta ve kalitesi düşmektedir. Bu nedenle Avrupa ülkelerine olan

zeytin dış satımımız yok denecek kadar azdır. Bu ülkeler zeytin gereksinimini daha

çok diğer Akdeniz ülkelerinden sağlama yoluna gitmektedir. Türkiye ise ihracatının

büyük çoğunluğunu Doğu Bloğu ülkelerine gerçekleştirmektedir (Öksüz, 1998).

Çizelge 2.1 Dünya Zeytin Alanlarının Ülkelere Göre Dağılımı (Anonim, 2004)

Alan (Ha)

Yıllar 2000 2001 2002 2003 2004

Yunanistan 765 151 767 144 765 000 765000 765 00 İtalya 1 136 627 1 142 579 1 140 546 1 140 685 1 140 685 İspanya 2 300 000 2 400 000 2 300 000 2 400 000 2 400 000 Tunus 1 387 240 1 377 700 1 377 700 1 500 000 1 500 000 Türkiye 594 072 599 400 599 000 597 000 597 000

Çizelge 2.2. Dünya Zeytin Üretiminin Ülkelere Göre Dağılımı (Anonim, 2004)

Üretim (ton)

Yıllar

2000 2001 2002 2003 2004

Yunanistan 2 273 000

2 249 430 2 573 835 2 050 260 2 300 000

İtalya 2 821 000 2 894 097 3 231 300 3 149 830 3 149 830

İspanya 4 943 800 6 762 600 4 290 700 7 290 900 4 556 000

Tunus 550 000 150 000 350 000 500 000 350 000

Türkiye 1 800 000 600 000 1 800 000 900 000 1 800 000


4

2.2. Türkiye Zeytin Ağacı Varlığı ve Üretim Durumu

Ilıman iklim zeytin ağacı için uygundur, çok kurak ve çok sulak yerler pek

uygun değildir. -7 derecenin altındaki sıcaklıklarda ve 400 mm’nin altında yağış alan

bölgelerde yetiştirilmesi ekonomik olmamaktadır. Toprak istekleri bakımından fazla

seçici olmadığından dolayı birçok bitkinin yetiştirilemediği alanların

değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (Ulaş, 2001).

Zeytin meyvesinin besi dokusu bol miktarda yağ içermektedir. Zeytin ağacı en

fazla 15–20 m’ye kadar boylanmakta ve çapı ise 5–6 m’ye kadar ulaşmaktadır. Ağaç

ömrü ortalama olarak 1000 yıl kadardır. Zeytin meyvesi ham ve olgun halde

salamura yapılarak yenmekte; ayrıca ezilerek yağı çıkarılmaktadır. Yağ çıkarıldıktan

sonra geriye kalan “pirina” olarak adlandırılan küspe; gübre ve hayvan yemi şeklinde

değerlendirilmektedir (Öksüz, 1998).

Türkiye’de işlenen tarım alanlarının % 4.1’inde zeytin tarımı yapılmaktadır.

DİE 2007 yılı istatistiklerine göre Ülkemizde yaklaşık 597 000 ha alanda, 90 000 000

adedi meyve veren, 9 000 adedi meyve vermeyen olmak üzere toplam 99 000 000

adet zeytin ağacı olmakla birlikte bu rakam dünyadaki zeytin ağacı varlığının (700

milyon) yaklaşık % 13’üne karşılık gelmektedir.

İklim ve toprak özellikleri bakımından büyük bir zeytin üretimi potansiyeline

sahip olan Türkiye’de zeytin üretimi Marmara, Ege, Akdeniz ve Güneydoğu

Anadolu Bölgelerinde yoğunlaşmıştır. Yetiştirilen zeytinlerin ortalama % 30’u

sofralık, % 70’i ise yağ üretiminde kullanılmaktadır. Gerek zeytin ağacı varlığı

gerekse zeytin üretimi bakımından sırasıyla Ege (% 75), Akdeniz (% 14), Marmara

(% 10) Bölgeleri ilk sıralarda gelmektedir. Ancak Ege ve Akdeniz Bölgesi yağlık

zeytin çeşitleri, Marmara Bölgesi ise sofralık zeytin çeşidi bakımından öndedir

Ülkemizde yaygın bulunan zeytin çeşitleri Memecik, Tavşan yüreği, Ayvalık,

Domat ve Gemliktir. Zeytin üretimi, sofralık ve yağlık olmak üzere iki farklı şekilde

yapılmaktadır. Sofralık çeşitlerde meyve tam olgunlaşmadan (yağ içeriği % 18–22)

hasadı yapılarak değişik yöntemlerle tüketiciye iletilmektedir. Yağlık çeşitler ise

meyve olgunlaştıktan sonra (yağ içeriği % 30–40) hasadı yapılarak

değerlendirilmektedir (Aydın, 2000).


5

Çizelge 2.3. Ülkemizde Bölgeler İtibariyle Zeytin Üretimi (Anonim, 2001)

Bölgeler

Toplam Ağaç Sayısı

Meyve Veren Yaştaki Ağaç

Sayısı

MeyveVermeyen Yaştaki

Ağaç Sayısı

Üretim (Ton)

Ege 70 382 781 65 880 590 4 502 191 1 384 667

Akdeniz 15 920 254 12 961 205 2 959 049 298 081

Marmara 10 368 825 9 608 980 759 845 106 342

Ortagüney 125 055 112 480 12 575 4 119

Güneydoğu 205 161 164 296 40 865 2 079

Kuzeydoğu 180 750 156 900 23 850 1 855

Karadeniz 203 085 154 699 48 386 1 365

Orta Kuzey 220 479 138 755 81 724 1 331

Ortadoğu 163 610 22 095 141 515 161

Türkiye Toplamı

7 770 000 89 200 000 8 570 000 1 800 000

Şekil 2.1. Türkiye’nin Üretim Alanlarını Gösteren Harita 1.Ege, 2. Marmara, 3. Akdeniz, 4. Güneydoğu Anadolu, 5. Karadeniz

(Numaralar bölgelerin ağaç sayısı ve üretim miktarlarına göre çoktan aza doğru verilmiştir.)


6

2.3. Zeytin Danesinin Yapısı

Şekil 2.2. Zeytin Danesinin Yapısı (Boskou, 1996)

Oval olan zeytin meyvesi perikarp (etli kısım) ve endokarptan (çekirdek)

oluşmuştur. Perikarp ise epikarp (kabuk) ve mezokarptan (etli kısım) meydana

gelmiştir. Meyve eti meyvenin yaklaşık % 68-83’ünü, çekirdek ise % 13-30’unu

teşkil etmektedir. Meyvedeki su oranı % 70’lere kadar çıkabilse de genellikle % 50

civarındadır. Bunun yanında meyvede % 1.6 protein, % 20 yağ, % 20 karbonhidrat,

% 5–6 selüloz, % 1.5 kül bulunmaktadır (Boskou, 1996).

2.4. Zeytinin Bileşimi

Zeytin, çeşidine göre şekli ve rengi değişen, besin değeri açısından oldukça

zengin bir üründür. Zeytinin yapısında önemli miktarda su ve yağ bulunurken

protein, selüloz, şeker, mineral maddeler, hidrokarbonlar, fenolik bileşikler ve

tokoferoller de bulunmaktadır (Çizelge 2.7). Bunlar arasında zeytinde iz miktarda

bulunduğu halde özellikle yağı oksidasyona karşı koruyarak antioksidan özellik

gösteren fenolik bileşikler, yağın rengi, lezzeti, oksidatif stabilitesi ve besin değeri

açısından önemli rol oynamaktadır (Kritsakis, 1998).

%%11––22 EEppiikkaarrpp ((kkaabbuukk))

%%6633--8866 MMeessookkaarrpp ((mmeeyyvvee eettii))

%%1100––3300 EEnnddookkaarrpp ((ççeekkiirrddeekk)) %%22––66 ÇÇeekkiirrddeekk iiççii

MMeeyyvvee ssaappıı


7

Çizelge 2.4. Zeytin Tanesinin Ortalama Bileşimi (Kiritsakis, 1998)

Bileşim Miktar (%)

Su 50

Yağ 22

Protein 1.5

Şeker 19.1

Selüloz 5.8

Mineral Madde (Kül) 1.6

Zeytinde bulunan fenol bileşikleri, sofralık zeytin veya zeytinyağının oksidatif

stabilitesini ve duyusal özelliklerini etkilediği için oldukça önemlidirler. Bunun

dışında fenol bileşenlerinin beslenme ve farmokolojik etkileri doğal antioksidatif ve

antimikrobiyel özellikleri bulunmaktadır. Ayrıca bu işlemler renk ve tadı

etkilediğinden meyvenin işlenmesinde de önemlidirler (Esti ve ark., 1998).

Meyvenin doğal savunma sisteminin oluşturulmasında da fenol bileşenleri önemli rol

oynamaktadır (Siciancalepore ve Longone; 1984; Brenes-Balbuena ve ark., 1995;

Robards ve ark., 1999).

Fenolik bileşikler, meyvenin duyusal özellikleri açısından önemli

parametrelerdir ve özellikle o-difenoller, meyve veya yağın oksidasyona karşı

dayanıklılığında antioksidan olarak görev yapmaktadır (Keçeli ve Gordon, 2001).

Zeytin; başlıca oleuropein, verbaskosit, ligrosit ve flavonollerin glikozit türevleri ile

flavonlar, antosiyaninler ve glikozitleri ve fenolik asitleri içermektedir (Montedoro

ve ark., 1993; Esti ve ark., 1998; Saija ve ark., 1998; Tsimidou, 1998; Keçeli ve

Gordon, 2001). Zeytinin temel fenolik bileşenlerinin kimyasal yapısı Şekil 2.3’de

verilmiştir.


8

Şekil 2.3. Zeytinin Temel Fenolik Bileşenlerinin Kimyasal Yapısı (Keçeli, 2000)

2.5. Polifenol Oksidaz Enzimi

PFO, bitki ve hayvan dokularında yaygın olarak görülen bir enzimdir.

Bitkilerde tüm kısımlarda bulunabilirken, gelişmiş hayvanlarda deri, saç, tüy ve

gözlerde bulunur. Bitkisel dokularda öncelikle latent (inaktif) formlar halinde

sentezlenmekte ve zamanla çeşitli etkenlerle, örneğin dokuda doğal olarak bulunan

proteazlar veya etilen gibi birtakım solunum metabolitlerince aktif hale

getirilmektedirler (Yemenicioğlu ve ark., 1997).

Sağlıklı meyve ve sebze dokularında, PFO enzimlerinin substratları olan

fenolik bileşiklerle teması, yok denecek kadar sınırlıdır. Bunun başlıca nedeni, enzim


9

ve substratlarının bitkisel hücrenin farklı kısımlarında yer almalarıdır. Nitekim PFO

enzimlerinin bir kısmı sitoplazmada serbest halde bulunurken, büyük bir kısmı

hücrenin tilakoid ve kloroplast gibi unsurlarında, membrana bağlı olarak

bulunmaktadır. Buna karşın, fenolik bileşiklerin neredeyse tamamı vakuollerde

yoğunlaşmış halde bulunmaktadır. Ancak doku olgunlaşmasının ileri aşamalarında

hücredeki pektinazların faaliyetiyle, doku kontrollü ve sınırlı bir şekilde doğal olarak

değişimlerle uğrar. Ayrıca, hasat, taşıma ve işleme sırasındaki etkiler veya uygulanan

çeşitli işlemlerle hücre ve buna bağlı olarak doku bütünlüğü bozulmaktadır. Böylece,

PFO enzimleri kendi substratları olan fenolik bileşiklerle ve havadaki oksijen ile bir

araya gelmektedirler (Muchuweti ve ark., 2006).

Meyve ve sebzelerin olgunlaşmasına paralel olarak, gerek PFO aktivitesinde,

gerekse bunların substratları olan fenolik bileşiklerin konsantrasyonunda önemli

değişimler görülmektedir. Örneğin elmalarda PFO substratı niteliğindeki o-difenolik

bileşiklerin konsantrasyonu ve kateşol oksidaz aktivitesi, olgunlaşmayla beraber

sürekli düşüş gösterirken şeftalilerde olgunlaşmayla birlikte o-difenollerin miktarında

önce büyük bir artış ve bunu takip eden sınırlı bir düşüş, kateşol oksidaz

aktivitesinde sürekli bir düşüş fakat lakkaz aktivitesinde sürekli bir artış

görülmektedir. Aynı şekilde zeytinlerde olgunlaşmayla birlikte PFO aktivitesinde

sınırlı bir düşüş, ancak buna karşın o-difenollerin konsantrasyonunda sürekli olarak

devam eden büyük bir artış görülmektedir. Buna göre, hasat zamanında zeytinlerin

esmerleşmeye büyük bir eğilim göstermesinin nedeni kolaylıkla anlaşılmaktadır.

Yine mantarlarda olgunlaşmayla birlikte PFO aktivitesinde büyük bir düşüş

görülmekte ancak bu durum onların esmerleşmeye eğilimini azaltmamaktadır (Ben-

Shalom ve ark., 1977; Ingebrigtsen ve ark., 1989).

Birçok meyve ve sebzelerde gerek hasat veya tasıma sırasında mekaniki bir

zedelenme sonucu, gerekse bunların herhangi bir ürüne islenmesi aşamasında

uygulanan doğrama, parçalama ve ezme gibi işlemler sırasında renkte esmerleşme ve

bozulmalar meydana gelmektedir. Bu olay polifenol oksidaz enziminden

kaynaklanmaktadır. Enzimatik esmerleşme denilen bu reaksiyon; hem polifenol

oksidaz aktivitesi hem de fenolik madde konsantrasyonuyla ilgilidir. Polifenol

oksidazlar, gıda endüstrisinde genellikle istenmeyen enzimlerdir. Enzimatik


10

esmerleşme ürünün duyusal özelliklerini bozar, satın alınabilirliğini azaltır ve aynı

zamanda besin değerinde azalmaya neden olur (Coseteng ve Lee, 1987).

PFO’lar meyve ve sebzelerin hasat, depolama ve işlenme kalitesi ve

ekonomisini belirleyen çok önemli enzimlerdir. Oksijen geçişine neden olan hasat,

depolama ve işleme sırasındaki zedelenme, kesilme ve diğer mekanik zararlar çoğu

meyve ve sebzelerde melanin oluşumuna, bu da hızla esmerleşmeye neden olur.

Esmerleşme yüzünden meyvelerde önemli kayıplar olmaktadır. Ürün renginin

değişmesi, kötü tat ve besin değeri kaybı tüketici açısından kabul edilemez

hususlardır. Muz, şeftali, kayısı, elma, üzüm, çilek ve bazı tropik meyveler ve suları

ayrıca patates, marul ve diğer yapraklı sebzelerde esmerleşme görülmektedir. Buna

karşılık çay, kahve, kakao, siyah üzüm ve siyah incirlerde PFO aktivitesi istenen bir

durumdur (Casado-Vela ve ark., 2005).

PFO tirosinaz, fenolaz, kateşoloksidaz, kateşolaz, o-difenoloksidaz, mono

fenoloksidaz ve kresolaz olarak da bilinir ve ilk olarak Schoenbein tarafından

1856’da keşfedilmiştir. PFO Uluslar arası Biyokimya Birliği’nin sınıflandırmasına

iki kez girmiştir: EC 1.14.18.1 (monofenol, L-dopa: oksijen oksidoredüktaz)

monohidroksifenolü (ör.p-kresol) o-pozisyonuna hidroksile eder. EC 1.10.3.1 (1,2-

benzendiol: oksijen oksidoredüktaz) o-dihidroksifenolleri (ör: kateşol) okside edip

hidroksil grubundan hidrojenleri uzaklaştırarak benzokinonlar oluştururlar. Bu enzim

iki çeşit oksidatif reaksiyonu katalizler: Monofelik bileşiklerin o-difenollere

hidroksilasyonu (kresolaz aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara

oksidasyonudur (kateşolaz aktivitesi) (Cash ve ark., 1976). Uluslar arası enzim

sistematiğine göre; kresolaz aktivitesi;‘monofenol monooksigenaz’, kateşolaz

aktivitesi ise “difenol oksidaz” ismi ile anılan enzimlerce gerçekleştirilmektedir

(Rocha ve ark., 1998).

Enzimatik esmerleşme olayı, iki farklı mekanizmaya göre gelişmektedir.

Bunlardan birisi, monofenolik bileşiklerin o-difenollere hidroksilasyonu (kreşolaz

aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara oksidayonudur (kateşolaz aktivitesi)

(Şekil 1).


11

OH

R (1)

monofenol 0-difenol o-kinon

OHOH

RH2O

R

O

O

(2)

1/2 O21/2O2

(çoğunlukla renksiz) (çoğunlukla renksiz) (çoğunlukla kırmızı)

Şekil 2.4. Enzimatik Esmerleşme Mekanizması (Cemeroğlu ve Ark., 2001) (1) Kreşolaz aktivitesi (hidroksilasyon) (2) Kateşolaz aktivitesi (oksidasyon)

PFO gıdalarda yol açtığı enzimatik esmerleşmeyle önemli kalite kayıplarına

neden olmaktadır. PFO’nun meyve ve sebzelerden izole edilip biyokimyasal

özelliklerinin belirlenmesi depolama ve işleme sırasında kalite kayıplarının en aza

indirilmesi ve böylece daha kaliteli ürünlerin üretilmesine olanak sağlayabilir. Bu

nedenle PFO enzimi üzerinde çok sayıda araştırma yapılmış, çok değişik meyve ve

sebzelerdeki PFO enziminin özellikleri belirlenmiştir.

Zeytin PFO’su üzerinde yapılmış çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Domat

çeşidi zeytindeki PFO enzimi üzerine ise herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır.

Zeytin PFO’su ve enzimatik esmerleşme üzerinde yapılmış araştırmalar aşağıda

özetlenmiştir.

Segevia-Bravo ve ark. (2007), Manzanilla çeşidi zeytinden PFO enzimini

saflaştırmışlar ve bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Enzimin optimum pH’sı 6.0

olarak bulunmuştur. Termodinamik parametrelerin pH’ya bağlı olduğu bildirilmiştir.

Sciancalepore ve Longone (1984), yeşil zeytinlerde PFO ve esmerleşmeyi

inceledikleri çalışmalarında enzim aktivitesi ile esmerleşme derecesi arasında pozitif

bir korelasyon bulmuşlardır.

Goupy ve ark. (1991), 10 farklı zeytin çeşidinde enzimatik esmerleşme,

oleuropein içeriği ve PFO arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Esmerleşme

kapasitesinin PFO aktivitesi ve oleuropein arasındaki karmaşık ilişkiye bağlı olduğu

bildirilmiştir.


12

Zeytin dışındaki ürünlerden izole edilen PFO üzerine çok sayıda araştırma

yapılmış ve bunlardan bazıları aşağıda verilmiştir.

Yemenicioğlu ve Cemeroğlu yaptıkları çalışmada (1996), “Hale Haven”

şeftalilerinde polifenol oksidaz (PFO) enziminin niteliklerini araştırmışlardır. Ham,

yarı olgun ve tam olgun şeftalilerden öncelikle aseton tozu hazırlanmıştır. Aseton

tozundan hazırlanan enzim çözeltisinde optimum pH, Michaelis sabiti (Km),

maksimum hız (Vm) ve enzim aktivitesinin termal inaktivasyonu incelenmiştir.

Olgunluk durumuna göre enzimin optimum pH derecesi 6.0-6.5 arasında

bulunmuştur. Tam olgun şeftalilerde elde edilmiş enzimin pH 6.2 de Km değerinin

14.3 mM ve Vm değerinin 1.25 Abs.dk-1. mL-1 olduğu saptanmıştır. Enzimin termal

inaktivasyon kinetiği 70°C’de araştırılmıştır. Her enzim ekstraktının termal

inaktivasyon kurvesinin, başlangıçta dik bir doğru, sonra daha yatık bir doğru olmak

üzere iki bölümden oluştuğu belirlenmiştir. Bu nedenle şeftali PFO enziminin ısıya

dirençli farklı iki izoenzimden oluştuğu sonucuna varılmıştır.

Aydemir ve arkadaşları yaptıkları çalışmada (2003), polifenol oksidaz (PFO)

enzimini yer elmasından izole etmişlerdir. PFO, kateşol, L-dopa, DL-dopa’ya karşı

aktivite göstermiş fakat bir monofenol olan L-tirozine karşı aktivite göstermemiştir.

Yer elmasından izole edilen PFO’nun optimum pH ve sıcaklık değeri sırasıyla 7.0 ve

25 °C’dir. Enzim nötr pH civarında oldukça kararlıdır. 60 ve 80°C’deki aktivitenin %

50 inaktivasyonu için gerekli olan zaman sırasıyla, 40 ve 20 dakika olarak

bulunmuştur. Kateşol için Km ve Vm değerleri sırasıyla, 5.88 mM ve 25.402

IU/mg.dk’dır. Ayrıca, yapılan çalışmada en etkili inhibitörlerin potasyum siyanid, β-

merkaptoetanol ve tiyoüre olduğu belirlenmiştir.

Yemenicioğlu ve ark. (1997), altı elma çeşidinin (Golden Delicious, Starking

Delicious, Granny Smith; Gloster, Starcrimson ve Amasya) PFO’larının ısıl

inaktivasyon kinetiklerini üç sıcaklıkta (68°, 73° ve 78°C) çalışmışlardır. PFO

aktivitesi başlangıçta artmış ve daha sonra ısıcaklıktaki artışla beraber birinci

dereceden kinetik modele uyarak azalmıştır. Aktivitedeki artış bağlı PFO’nun

varlığını göstermektedir. İnaktivasyon eğrisinin lineer bölümü için regresyon

katsayısı inaktivasyon parametrelerini belirlemek için hesaplanmıştır. 78°C’de


13

Amasya elması PFO’sunun en az, Starking Delicious cinsi PFO’nun ise en yüksek

ısıl-dirence sahip olduğunu göstermiştir.

Saygılı ve arkadaşları (1998), Türkiye Şeker Fabrikaları A.Ş. Şeker Enstitüsü

(Ankara) deneme tarlalarında yetiştirilen Evita, TŞ. Poly, Gisela, Adonis ve Agra

adlı şeker pancarı çeşitlerindeki polifenoloksidaz (PFO) aktivitesini incelenmişlerdir.

PFO enzim aktivitesi substrat olarak kateşolün kullanıldığı dolaylı bir yöntemle

ölçülmüştür. Absorbans-zaman grafiğinin eğimi toplam enzim aktivitesi olarak

değerlendirilmiştir. Bazı şeker pancarı çeşitlerinde (Evita, T.Ş. Poly) ortalama PFO

aktivitesinin yüksek olduğu ve aynı çeşit örneklerdeki enzim aktivitesi değerlerinin

çok geniş sınırlar arasında değiştiği belirlenmiştir. Fakat Adonis çeşidi için ortalama

PFO aktivitesi ve standart sapma değerleri oldukça düşük bulunmuştur. Tam doğal

şeker (Whole Sugar) üretiminde pancardaki polifenol oksidazlar ürün rengini

olumsuz etkilemekte ve bu nedenle üretimin ilk aşamasında PFO buharla inaktive

edilmektedir. Bu tür düşük PFO aktivitesine sahip çeşitlerin kullanımı ile proseste ve

ürün kalitesinde iyileştirme sağlanabilecektir.

Wissemann ve Lee (1981), üzümden elde ettikleri PFO’nun niteliklerinin

belirlenmesi ile ilgili yaptıkları çalışmada, iki farklı üzüm çeşidi kullanmışlar (Ravat

51 ve Niagara) ve her iki üzüm çeşidinde optimum pH ve sıcaklık değerlerinin 5.5 ve

25°C olduğunu bildirmişlerdir. Niagara üzümünden elde edilen PFO’nun, Ravat

51’den elde edilen üzüm PFO’suna göre ısıya karşı daha dirençli olduğu

bildirilmiştir. Enzim üzerine çeşitli inhibitörlerin etkisi denenmiş ve en etkili

inhibitörler L-sistein ve sodyum dietilditiyokarbomat olarak bulunmuştur.

Nakamura ve ark. (1983), Japon çeşitlerinden Koshu üzümlerinden aseton tozu

yöntemi ile ekstrakte ettikleri PFO enzimini amonyum sülfat çöktürmesi ve kolon

kromatografisi ile saflaştırmışlar ve enzimin bazı özelliklerini belirlemişlerdir.

Enzimin molekül ağırlığının 39000-41000, optimum pH’sının 6.0 ve optimum

sıcaklığının ise 25°C olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca, enzim o-difenolik bileşiklere

yüksek aktivite gösterirken, monofenollere hiç aktivite göstermemiştir.

Ünal (2007), Anamur muzundan polifenol oksidaz enzimini saflaştırıp, enzimin

karakteristik özelliklerini belirlemiştir. PFO’nun muz için optimum sıcaklığı 30°C

bulunmuştur. Enzimin optimum pH derecesi 7.0 olarak bulunmuştur. 60-75°C’deki


14

termal inaktivasyon çalışmalarından, enzimin yarı ömür değeri 7.3 ve 85.6 dakika

arasında değişmektedir. Ea ve Z değerleri, sırasıyla, 155 kj.mol-1 ve 14.2°C olarak

hesaplanmıştır. Km ve Vm değerleri sırasıyla 8.5 mM ve 0.754OD410 dak-1’dır.

İnhibitör testlerinde ise askorbik asit ve sodyum metabisülfit en etkili inhibitör olarak

tespit edilmiştir.

Rapeanu ve arkadaşları (2006), Güney Afrika’da yetişen Viktorya

üzümlerinden ekstrakte edilen PFO enziminin biyokimyasal tanımlanmasını ve

kimyasal stabilitesini araştırmışlardır. McIlvaine tamponu ile hazırlanmış 10 mM

kateşol substratı ile üzüm PFO aktivitesi için optimum pH ve sıcaklık sırasıyla 5.0 ve

25°C olarak bulunmuştur. 10 mM kateşol substrat olarak kullanıldığında Kmax ve Vm

değerleri sırasıyla 52.6±0.00436 mM ve 653±24.0 OD400 nm/dk’dır. Çalışmada sekiz

inhibitör test edilmiş ve en etkili inhibitörlerin askorbik asit, L-sistein ve sodyum

metabisülfit olduğu bulunmuştur. Kinetik çalışmalar, Viktorya üzümleri PFO’sunun

termal inaktivasyonunun, Ea =225±13.5 kj/mol’lük bir aktivasyon enerjisi ile birinci

dereceden kinetiğe uyduğunu göstermiştir.

Yemenicioğlu ve arkadaşları Taro yumrularından ekstrakte edilmiş peroksidaz

(POD) ve polifenol oksidaz (PFO) enzimlerinin 50–80°C arasındaki ısıl

inaktivasyonunun birinci dereceden reaksiyon kinetiğine uygun olarak geliştiğini

saptamışlardır. Her iki enzimin, ısıl dirençleri birbirinden farklı iki izoenzimden

oluştuğu belirlenmiştir. 60–70°C aralığında, ısıl direnci yüksek olan fraksiyonun

oranı POD için; %33–34 ve PFO için; %67–72 olarak bulunmuştur. Diğer taraftan,

bu enzimlerin Ea ve Z değerlerinin sırasıyla POD için 19.4 kcal.mol-1 ve 25.9°C ve

PFO için ise 21 kcal.mol-1 ve 25.5°C olarak saptanmıştır. Aynı şekilde, pH

optimumu POD için 5.9 ve PFO için 6.5 olarak belirlenmiştir. Bu enzimlerin

yumrudaki dağılımı da incelenmiş ve POD enziminin yumruların yüzey kısımlarında,

buna karsın PFO enziminin ise daha çok merkez kısımlarında yoğunlaştığı

saptanmıştır. PFO enziminin kateşol oksidaz ve floroglusinol oksidaz aktivitesi

içermesine karşı, lakkaz aktivitesine sahip olmadığı görülmüştür. EDTA, SO2, NaCl

ve askorbik asidin PFO enzimi üzerindeki inhibe edici özellikleri de belirlenmiştir.

Gόmez (2002), gıda işleme operasyonları sırasında yol gösterici olarak yararlı

bilgi sağlamak amacıyla iki avokado çeşidinden (Booth 1 (B1PFO) ve Julio Millian


15

(JMPFO)) elde edilen kaba PFO enzimi üzerinde çalışmıştır. İki ekstrakt için de

optimum aktivitenin görüldüğü pH 7.5-7.6 bulunmuştur. 67-84ºC arasındaki ısıl

aktivasyon enerjisinin, 21.4-64.1 kcal/mol arasında değiştiği bildirilmiştir.

Yağar (2004), çalışmasında, pH 7’de, 0.1M fosfat tamponu kullanarak kereviz

köklerinden PFO ekstrakte etmiştir. Substrat spesifikliği denemeleri, kateşol,

pirogallol, L-DOPA, p-kresol, resorsinol ve tirozin kullanılarak yapılmıştır.

Pirogallol, kateşol ve L-DOPA için Km değerleri 25°C’de sırasıyla; 4.5, 8.3 ve 6.2

mM bulunmuştur. Optimum pH ve sıcaklık kateşol, pirogallol ve L-DOPA ile

belirlenmiştir. Optimum pH kateşol ve L-DOPA için 7, pirogallol için 7.5’dir.

Maksimum PFO aktivitesi için optimum sıcaklıklar; pirogallol için 25°C, kateşol için

40°C ve L-DOPA için 45°C bulunmuştur. Isıl inaktivasyon çalışmaları, 60°C’nin

üzerinde enzimatik aktivitede düşüş olduğunu göstermiştir. İnhibitörlerin etki sırası

şu şekilde bulunmuştur: L-sistein>askorbik asit>glisin>resorsinol>NaCl.

Sabancılar ve ark. (2007), yaptıkları çalışmada Denizli Narından PFO enzimi

Afinite Kromatografisi yardımı ile saflaştırmış ve karakterizasyonunu yapmışlardır.

Denizli narından saflaştırılan polifenol oksidaz enzimi afinite kromatografisi

kullanılarak 67 kat saflaştırılmıştır. Enzimin optimum pH’sı 7.5 optimum sıcaklığı

40°C olarak bulunmuştur. Enzimin kinetik parametreleri olan Vm ve Km değerleri ise

Linewearver-Burk grafiğinden saptanmıştır.

Gülçin ve ark., (2005) ısırgan PFO’nun saflaştırılması, karakterizasyonu ve

bazı inhibitörlerin enzim aktivitesine etkisini inceledikleri çalışmada, amonyum

sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma yapmışlardır.

Saflaştırdıkları enzime 8 farklı substratın etkisini denemişler ve en uygun substratın

L-tirozin olduğunu bulmuşlardır. Optimum pH ve sıcaklık değerleri sırası ile 4.5 ve

30°C olarak bulunmuştur. Km ve Vm değerleri ise 7.90x10–4 mM ve 11290 EU/mL

olarak bildirilmiştir. Ayrıca, birkaç inhibitörün etkisi denenmiş ve en etkili

inhibitörün sodyum dietil ditiyokarbomat olduğu saptanmıştır.

Orenes-Pinero ve ark. (2006), ayva PFO’sunu kısmi olarak saflaştırmışlar ve

bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlemişlerdir. Araştırmacılar amonyum sülfat

çökeltmesi uygulayarak kısmi saflaştırma yapmışlar ve 0.5 g/dm3 sodyum dodesil

sülfat (SDS) varlığında ve asidik pH’da enzimin maksimum aktivite gösterdiğini


16

bulmuşlardır. SDS varlığında enzimin maksimum hız değerinin 15 kat daha fazla ve

optimum pH değerinin 5.0 olduğu, her iki durumda da Km değerinin 1.2 mM olduğu

bildirilmiştir. Araştırmacılar birkaç inhibitörün etkisini denemişler ve en etkili

inhibitörün tropolon olduğunu bulmuşlardır.

Yağar ve Sağıroğlu (2000), ayvadan ekstrakte ettikleri PFO enzimini

(NH4)2SO4 çökeltmesi ile kısmen saflaştırılmıştır. Substrat spesifikliği denemeleri,

kateşol, pirogallol, L-DOPA, p-kresol, resorsinol ve tirozin kullanılarak yapılmıştır.

Kateşol en iyi substrat olarak belirlenmiştir. Michealis sabiti kateşol, pirogallol, L-

DOPA için, sırasıyla 4.54 mM, 7.35 mM, 1.78 mM olarak bulunmuştur. Optimum

pH ve sıcaklık, spesifik substrat olan kateşol için sırasıyla 8.0 ve 40ºC olarak

belirlenmiştir. Sekiz çeşit inhibitör test edilmiş ve ayva PFO’su üzerinde en etkili

olanlarının L-sistein, askorbik asit, potasyum siyanid olduğu tespit edilmiştir.

Ziyan ve Pekyardımcı (2003), polifenol oksidaz enzimini amonyum sülfat

çökelmesi, jel filtrasyon ve diyaliz yöntemi ile yerli armut çeşidi olan Ankara

armudundan izole etmişlerdir. Amonyum sülfat çökeltmesinden sonra diyalizde elde

edilen enzimin biyokimyasal özelliklerini belirlemiştlerdir. Optimum pH değerleri,

pirogallol için 8.2, 4-metil kateşol için 7.2, kateşol için 7.0, D-tirosin için 5.6, p-

kresol için 5.0, L-dopa için 4.8 olarak belirlenmiştir. Optimum sıcaklık 4-metil

kateşol için 35ºC olarak bulunmuştur. 4-metil kateşol, klorogenik asit, kafeik asit iyi

substratlar olmasına karşın, kateşol en etkili substrat olarak saptanmıştır. Ayrıca, 6

farklı inhibitörün PFO üzerindeki etkisi araştırılmıştır. L-askorbik asit, L-sistein ve

Dietilditiyokarbomat en etkili inhibitör olarak tespit edilmiştir. Km ve Vm değerleri

sırasıyla kateşol için 5.55 mM ve 344.5 IU/mL olarak hesaplanmıştır. Termal

inaktivasyon çalışmalarında aktivasyon enerjisi 0.19 kal/mol olarak belirlenmiştir.

Ankara armudu PFO’sunun üç izoenzimi polikirilamid jel elektroforezindeki

aktivitesiyle tespit edilmiştir. Molekül ağırlıkları ise sodyum dodesil sülfat PAGE

için 60, 20, 28 kDa olarak bulunmuştur.

Mazzafera ve Robinson (2000), kahve yaprakları ve kahve endosperminin

kısmen saflaştırılmış ekstraktından PFO enzimini karakterize etmişlerdir. PFO

aktivitesi meyve endospermi ve yaprakların ikisinde de, erken gelişme safhasında

daha yüksek oranda bulunmuştur. PFO proteaz uygulamalarıyla aktive edilememiştir


17

ve bağlı değildir. PFO aktivitesi 0.35-1.75 mM sodyum dodesil sülfat (SDS) ile %10-

15 civarında arttırılmıştır. Ancak, daha yüksek konsantrasyonlarda çalışmalar

deterjansız kontrol yöntemleriyle benzerdir. Tripsin veya proteinaz K ile ekstraktın

uzun inkübasyonu PFO aktivitesini inhibe etmiştir ancak pepsinin hiçbir etkisi

olmamıştır. Proteinaz K ile PFO inhibisyonu SDS varlığında artmıştır. İki dokudaki

PFO aktivitesi pH 6-7’de ve 30°C’de en yüksektir. Substrat olarak klorojenik asit

0.882 mM (PFO-L) ve 2.27 mM (PFO-E) Km ile en yüksek aktiviteye sahiptir.

Hekzadekil trimetil-amonyum bromid polivinilprolidon 40, sinnamik asit ve

salisihidroksamik asid her iki dokudan PFO’su her iki dokudan inhibe etmiştir.

Espin ve arkadaşları (1997) enginardan elde edilen PFO enziminin

monofenolaz aktivitesini incelemişlerdir. Enginar PFO’su aseton tozu gibi basit bir

yöntem kullanılarak izole edilmiştir. Enzim ekstraktı hem monofenolaz hem de

difenolaz aktivitesi göstermiştir. Enzim monofenolaz aktivitesi, substrat olarak çiftli

bir nükleofil olarak 3-metil-2-benzothiazolinon ile birlikte 4-hidroksianisol,

kullanılarak tanımlanmıştır. Bu metot yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik

göstermiş ve PFO’nun mikro miktarlarını tespit etmede faydalı olabilecek olan, bir

kalibrasyon eğrisi elde etmeye izin vermiştir.

Doğan ve arkadaşları (2002), kurutma işlemleri için en uygun patlıcan çeşidini

tanımlamak için, farklı patlıcan çeşitlerinden elde edilen PFO enziminin

biyokimyasal özelliklerini araştırmışlardır. PFO kateşol, 4-metilkateşole karşı

aktivite göstermiş, fakat L-tirozin ile aktivite göstermemiştir. Çeşit I (Vm=3333.3

EUdk-1 ml-1, Kmax=8.7 mM ve Vm/Kmax= 384.9 dk-1) ve çeşit III (Vm 1000 EU dk-1

ml-1, Kmax=9.3 mM ve Vm/Kmax= 107.5 dk-1) için en iyi substrat kateşol bulunurken,

çeşit II için (Vm=5000 EU dk-1 ml-1, Kmax=35.5 mM ve Vm/Kmax= 140.8 dk-1) en iyi

substrat 4-metilkateşoldür. Kateşol için optimum pH 7, 4-metilkateşol için optimum

pH 6’dır. Isıl inaktivasyon çalışmalarına göre 40°C’nin üzeri sıcaklıklarda enzim

aktivitesi düşmüştür. Kateşol ve 4-metil kateşol substratları için maksimum aktivite

elde etmek için optimum sıcaklık, kateşol kullanılan ve optimum sıcaklığı 20°C

bulunan çeşit I dışında, tüm patlıcan çeşitleri için 30°C olarak bulunmuştur.

Katalizlenen PFO reaksiyonları üzerine Tropolon, D, L-ditiotreitrol ve glutation gibi


18

bileşenlerin inhibitör olarak etkileri test edilmiş ve genelde en etkili inhibitör olarak

tropolon bulunmuştur.

Serradell ve ark. (2000), çilek PFO’sunu amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon

değişim kromatografisi kullanarak saflaştırmışlar ve karakterizasyonunu

çalışmışlardır. Substrat olarak prokateşol kullanılmış ve bu substratta Km değeri 11.2

mM, optimum pH değeri 50°C’de SDS varlığında 7.2 ise olarak bulunmuştur.

Sanchez-Ferrer ve ark. (1988), Monastrell üzümlerinden izole edip kısmen

saflaştırdıkları PFO enziminin kateşolaz ve kresolaz aktivitelerini incelemişlerdir.

Kateşolazın sıcaklık ve pH optimum aralıkları sırasıyla 20-40°C ve 3.5-5.0 arasında

bulunmuştur. Kresolaz aktivitesinde lag periyodu gözlenmiştir. Enzim

konsantrasyonu, sıcaklık veya pH’daki artış lag periyodununda düşmeye neden

olurken substrat konsantrasyonunun artırılması artışa neden olmuştur.

Sanchez-Ferrer ve ark. (1989), Monastrell ve Airen üzüm tanelerinde gelişme

ve olgunlaşma sırasında kateşolaz ve kresolaz aktivitelerini araştırmışlardır.

Monastrell üzümü PFO’nun kateşolaz aktivitesi ölçümde kullanılan pH’ya bağlı

olarak artmış veya azalmıştır. Airen üzümlerinde ise pH’dan bağımsız olarak sürekli

artmıştır. Monastrell üzümlerinde ağır yağmurlu gün ve ben düşme döneminde daha

yüksek kateşolaz aktivitesi gözlenmiştir.

Gauillard ve Richard-Forget (1997), yaptıkları çalışmada armuttan elde

ettikleri PFO’yu saflaştırmış ve bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Saflaştırma için

amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi kullanılmıştır.

Saflaştırma sonunda F1 ve F2 olmak üzere iki farklı fraksiyon elde edilmiştir. F1,

124 kat ve F2 ise 36 kat saflaştırılmıştır. Her iki fraksiyon da benzer Km değeri

göstermiştir. Km değeri 5-11 mM arasında değişmiştir. Ayrıca, değişik substratlar

denenmiş ve en iyi substrat klorojenik asit olarak bulunmuştur.

Ding ve ark. (1998), yenidünyadan elde ettikleri PFO enziminin bazı

biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ile ilgili yaptıkları çalışmada enzimi

amonyum sülfat çökeltmesi, jel değişim ve iyon değişim kromatografisi kullanarak

157 kat saflaştırmışlardır. Saflaştırma sonunda enzimin optimum pH’sı 4.5, optimum

sıcaklığı 30ºC ve enzimin stabil olduğu pH aralığı 4-8 olarak bulunmuştur. Ayrıca,

araştırmacılar substrat olarak klorojenik asit ve neoklorojenik asit kullandıkları


19

çalışmada enzimin Km değerinin 0.105 ve 0.425 mM olduğunu ve inhibitörlerin

etkisini çalışmada ise sodyum L-askorbik asit, sodyum dietil ditiokarbomat ve

sodyum metabisülfitin enzimi tamamen inhibe ettiğini bildirmişlerdir.

Rocha ve ark. (1998), elmadan elde ettikleri PFO’ın bazı biyokimyasal

özelliklerini belirlemişlerdir. Araştırmacılar farklı substratların etkisini denemişler ve

en etkili substratın klorojenik asit olduğunu bulmuşlardır.

Weemaes ve ark. (1998), yaptıkları çalışmada elma, avokado, armut ve erikten

PFO enzimi izole etmişler ve bazı biyokimyasal özelliklerini belirlemişlerdir. En

yüksek PFO aktivitesi avokadodan elde edilen PFO’da bulunmuştur.

Arslan ve ark. (2004), duttan elde ettikleri PFO’yu amonyum sülfat ve affinite

kromatografisi kullanarak saflaştırmışlardır. Araştırmacılar substrat olarak kateşol, 4-

metil kateşol ve pirogallol kullanmışlardır. Optimum pH ve sıcaklık değerlerinin bu

3 substrat için 4.5-8.0 ve 20-45°C arasında değiştiğini bildirmişlerdir.

3.MATERYAL VE METOT Ceren TAŞ

20

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3. 1. Materyal

Denemelerde Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Araştırma ve

Uygulama Bahçesinden temin edilen Domat zeytini kullanılmıştır.

3.1.1. Analizlerde Kullanılan Araç Gereç ve Kimyasal Maddeler

Aseton tozunun elde edilmesinde “Torrington HGBTWTS3 (Amerika)”

marka Waring blendor kullanılmıştır. Tamponların ayarlanmasında ve pH

ölçümlerinde cam elektrodlu “Inolab (Almanya)” marka pH metre kullanılmıştır.

Spektrofotometrik ölçümler, sıcaklık kontrol ünitesi olan “Shimadzu UV-1700”

marka (Japonya) spektrofotometrede gerçekleştirilmiştir. Enzim ekstraktının elde

edilmesinde “Nüve NM 110” marka karıştırıcı ve “Kubota 7780 (Japonya) marka

santrifüj kullanılmıştır. Enzimlerin saflaştırılmasında “Atto AC-5750 (Japonya)

marka fraksiyon kollektörü kullanılmıştır. Enzimlerin biyokimyasal özelliklerinin

belirlenmesi sırasında “Memmert WB14” ve “Nüve BM402” marka su banyosu

kullanılmıştır. Enzimin saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde

kullanılan triton X-100, sodyum metabisülfit, PVPP (polivinilpolipirolidon),

askorbik asit, commasie brillant blue (CBB) Merck (Darmstadt, Almanya)

firmasından temin edilmiştir. DEAE-Toyopearl 650-M Supelco (Montgomeryville,

Amerika) firmasından sağlanmıştır. PEG (polietilen glikol), PMSF (fenilmetilsülfonil

florid), 4-metil kateşol, sodyum disülfit, askorbik asit, L-sistein, aseton, amonyum

sülfat ve selüloz membran (76mm×49mm) Sigma-Aldrich (St. Louis, Amerika)

firmasından temin edilmiştir.

3.2. Metot

3.2.1. Polifenol Oksidaz Ekstraktının Hazırlanması

Dondurulmuş (-25ºC), zeytinlerden çekirdekleri çıkartıldıktan sonra 150 gr

alınmış, 1.875 g polietilen glikol (PEG) içeren 225 ml önceden soğutulmuş (-18ºC)


21

aseton içerisinde 2 dk Warring blendorda homojenize edilmiştir. Homojenat vakumlu

filtreden geçirilmiştir. Elde edilen filtre keki 150 ml soğutulmuş aseton ile

karıştırılarak aynı işlemler uygulanmıştır. Filtre üzerinde kalan kısım, beyaz aseton

tozu elde edilene kadar 150 ml soğuk aseton kullanımlarıyla ekstrakte edilmiştir.

Elde edilen aseton tozu bir gece oda sıcaklığında kurutulduktan sonra cam kavanoz

içerisinde –25ºC’de saklanmıştır (Coseteng ve Lee, 1987).

3.2.2. Enzimin Kısmi Saflaştırılması

Elde edilen aseton tozundan 10g alınarak 10 mM askorbik asit, %0.1

polivinilpoliprolidon, %0.5 Triton X-100 ve 1mM PMSF (fenil metil sülfoni florid)

içeren 300 ml, 0.1 M, pH 6.8 fosfat tamponunda 40 saniye homojenize edilmiştir.

Homojenat 3 saat, +4ºC’de magnetik karıştırıcı ile karıştırılmış ve daha sonra 10.000

x g’de 45 dakika +4ºC’de santrifüjlenmiştir. Santrifüj sonrası, berrak kısma %90

amonyum sülfat çökeltmesi uygulanmıştır. Çökeltilen fraksiyonlar 10 000 x g’de 45

dakika, + 4ºC’de santrifüj edilerek ayrılmıştır. Çökelti, az miktarda 0.01 M pH 6.8

fosfat tamponunda çözülmüş ve +4ºC’de aynı tampona karşı bir gece boyunca diyaliz

edilmiştir (Serradell ve ark., 2000).

3.2.3. İyon Değişim Kromatografisi ile Saflaştırma

Diyaliz edilen enzim çözeltisi, 0.01 M pH 6.8 fosfat tamponu ile dengelenmiş

DEAE-Toyopearl 650-M iyon değişim kolonuna (2.5 x 30 cm) 0.5 ml.dk-1 hızla

verilmiştir. Enzim çözeltisi verildikten sonra 0.5 ml.dk-1 hızla yaklaşık 200 ml

başlangıç tamponu geçirildikten sonra 0.01–0.20 M, pH 6.8 fosfat tamponu

kullanılarak gradient elüsyon yapılmıştır. Toplam 40 ml enzim çözeltisi kolona

verilmiştir. Fraksiyonlar 4’er ml olacak şekilde toplanmış ve elde edilen

fraksiyonlarda enzim aktivitesi ve protein tayini yapılmıştır.

3.2.4. Protein Tayini

Enzimlerin protein içeriği standart olarak sığır serum albumini kullanılan

Bradford yöntemine göre belirlenmiştir (Bradford, 1976).


22

3.2.5. Enzim Aktivitesinin Ölçümü

Enzim aktivitesi 30°C’de 410 nm’de 40 sn boyunca absorbanstaki artıştan

belirlenmiştir. Absorbans-zaman grafiğinin lineer kısmının eğiminden enzim

aktivitesi hesaplanmıştır. Ölçümler iki paralelli olarak yapılmış ve sonuçlar ortalama

değerler şeklinde ifade edilmiştir. Optimum pH’daki tampon ile hazırlanmış ve

30°C’ye ısıtılmış 0.9 ml substrat çözeltisi 0.1 ml enzim çözeltisi ile karıştırıldıktan

sonra absorbanstaki artış otomatik olarak kaydedilmiştir. Sadece inhibitörün etkisini

belirlemek için yapılan enzim aktivitesi ölçümlerinde 0.8 ml substrat, 0.1 ml

inhibitor ve 0.1 ml enzim çözeltisi kullanılmıştır. Kontrol olarak fosfat tamponunda

hazırlanmış substrat kullanılmıştır. 1 ünite PFO aktivitesi 30°C’de dakikada 0.001

birimlik absorbans artışına neden olan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır (Ünal ve

Şener, 2006).

3.2.6. Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi

Enzimin optimum pH ve sıcaklığı, kinetik parametreler, termal inaktivasyon,

inhibitörlerin etkisi gibi biyokimyasal özellikleri Ünal (2007)’a göre belirlenmiştir.

3.2.6.1. Optimum pH

Enzimin en yüksek aktivite gösterdiği optimum pH’yı bulabilmek için 3.04-

6.7 pH aralıklarında aktiviteler ölçülmüştür. pH 3.04-5.80 için 0.2 M sitrat tamponu,

pH 6.30-6.70 için 0.2 M fosfat tamponu kullanılmıştır. PFO aktivitesi farklı

tamponlarda, standart reaksiyon karışımı kullanılarak ölçülmüştür. Enzimin en

yüksek aktivite gösterdiği pH değeri optimum pH olarak belirlenmiş ve diğer

deneyler bu pH’da gerçekleştirilmiştir. .

3.2.6.2. Optimum Sıcaklık

Optimum sıcaklığı belirleyebilmek için 20-70°C’ler arasında enzim aktivitesi

ölçülmüştür. Bunun için optimum pH’daki tamponla hazırlanmış 0.9 ml 4-metil

kateşol çözeltisi ilgili sıcaklıkta su banyosunda 5 dakika bekletildikten sonra üzerine


23

0.1 ml enzim çözeltisi ilave edilerek enzim aktivitesi ölçülmüştür. Maksimum enzim

aktivitesinin görüldüğü sıcaklık değeri optimum sıcaklık olarak belirlenmiştir.

3.2.6.3. Kinetik Parametreler

Enzimin Michaelis-Menten sabiti (Km) ve maksimum hız Vm değerlerini

bulabilmek için optimum pH ve sıcaklıkta değişik konsantrasyonlarda 4-metil kateşol

kullanılarak enzim aktiviteleri ölçülmüştür. Kinetik parametreler Lineweaver-Burk

metoduyla grafiksel olarak hesaplanmıştır. Bu amaçla 1/Substrat-1/Reaksiyon hızı

grafiği çizilmiş ve eğim ve y eksenini kestiği noktalardan Km ve Vm değerleri

hesaplanmıştır.

3.2.6.4.Termal İnaktivasyon

Sıcaklığın enzim stabilitesine etkisini belirlemek için enzim 65, 70 ve

75ºC’de (5, 10, 15 dk ) ısıtıldıktan sonra kalıntı enzim aktiviteleri belirlenmiştir.

Vidalı deney tüpü ilgili sıcaklıktaki su banyosunda 5 dk bekletildikten sonra içerisine

0.3 ml enzim konulup değişik sürelerde sıcaklığa maruz bırakılmıştır. Süre sonunda

enzim hızlı bir şekilde su banyosundan çıkarılıp buz banyosunda soğutulmuş,

ardından oda sıcaklığına getirildikten sonra enzim aktivitesi standart reaksiyon

karışımı kullanılarak ölçülmüştür. Kontrol olarak sıcaklığa maruz bırakılmayan

enzim kullanılmıştır. Sıcaklığa maruz kalan enzimlerdeki kalıntı aktivite (Et),

sıcaklığa maruz kalmamış enzimin aktivitesi (Eo) ile kıyaslanarak birinci dereceli

inaktivasyon sabiti (kd), yarı ömür (t1/2) , aktivasyon enerjisi Et, sabit bir sıcaklıktaki

enzim aktivitesinin %90’ını inaktive etmek için gereken süre (D değeri) ve D

değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için) gereken sıcaklık artışı (Z değeri)

hesaplanmıştır.

Bu değerlerin hesaplanması aşağıda özetlenmiştir. Belli bir zaman süreci

içerisinde doğal enzimin aktivitesindeki kayıplar ya da konsantrasyonundaki

azalmalar birinci dereceden kinetiğe uyar ve aşağıdaki gibi ifade edilebilir.


24

kd

N D

Burada N doğal enzimi, D denatüre olmuş enzimi ve kd ise (1/zaman) enzim

için birinci dereceli inaktivasyon sabitini göstermektedir. Enzimlerin termal

inaktivasyonu genellikle birinci dereceden reaksiyonla ifade edilir:

Et= Eo. e-kdt

Et, t anındaki enzim aktivitesi ve Eo başlangıçtaki aktiviteyi, t ise ısıl işlem

uygulama süresini ifade eder. Sabit sıcaklıkta ln(Et / Eo)’ın süreye karşı grafiği

çizildiğinde, kurvenin eğimi – kd’dir.

Yarı ömür (t1/2) değeri, enzim stabilitesinin belirlenmesinde yaygın bir şekilde

kullanılan bir parametredir. Belli bir sıcaklıkta enzim aktivitesinin yarı yarıya

azalması için gereken süredir. Enzimlerin ısıl yolla inaktivasyonu çoğunlukla birinci

dereceden kinetiğe uyduğundan aşağıdaki formülden kolaylıkla hesaplanabilir:

(t1/2)=0.693/ kd

Sabit bir sıcaklıktaki orijinal enzim aktivitesinin %90’ını inaktive etmek için

gereken süre olarak tanımlanmaktadır. D değeri aşağıdaki formülden

hesaplanabileceği gibi,

D=ln(10)/ kd

log 10 (Et / Eo)’ın zamana karşı grafiğinin eğiminden de hesaplanabilir.

Eğer hız sabitleri farklı sıcaklıklarda elde edilirse denatürasyon için

aktivasyon enerjisi hesaplanabilir. Aktivasyon enerjisi aşağıda verilen Arrhenius

modeli yardımıyla hesaplanabilir.

ln kd = lnA-( Ea /RT)

A (1/zaman), kimyasal reaksiyonlar sırasında meydana gelen çarpışmaların

toplam sayısı ile ilgili bir parametredir. Ea (kj.mol-1), aktivasyon enerjisidir. R

(kj.mol-1.K-1), üniversal gaz sabiti ve T(K) mutlak sıcaklıktır.

Aktivasyon enerjisi ile yakından ilişkili bir parametre olan Z değeri, desimal

azalma süresinin (D) sıcaklığa bağımlılığını ifade eder ve enzimin ısıl direncini

yansıtan bir parametredir. Z değeri, D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma

için) gereken sıcaklık artışıdır. Log10D’nin sıcaklığa karşı grafiği çizildiğinde,

doğrunun eğimi 1/Z’dir (Marangoni, 2003).


25

3.2.6.5. İnhibitörlerin Etkileri

İnhibitörlerin enzim aktivitesine etkisini belirleyebilmek için 0.01, 0.10 ve

1.00 mM konsantrasyonlarda 3 farklı inhibitör (askorbik asit, sodyum disülfit ve L-

sistein) kullanılarak enzim aktivitesi ölçülmüştür. Bunun için optimum pH’daki

tampon ile hazırlanmış 4-metil kateşol çözeltisinden 0.8 ml ve optimum pH’daki

tampon ile hazırlanmış değişik konsantrasyonlardaki inhibitör çözeltilerinden 0.1 ml

deney tüpüne konularak 5 dk 30 °C’de su banyosunda bekletilmiş ve daha sonra

üzerine 0.1 ml enzim ilave edilerek aktivite ölçümü yapılmıştır. Kontrol olarak

inhibitör kullanılmadan hazırlanan standart reaksiyon karışımında enzim aktivitesi

belirlenmiştir. İnhibisyon yüzdesi ise aşağıdaki formülden hesaplanmıştır:

İnhibisyon (%) = [(Ao – Ai)/Ao)]*100

Ao: İnhibitör kullanmadan belirlenen enzim aktivitesi

Ai: İnhibitör varlığında enzim aktivitesi.

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Ceren TAŞ

26

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA

4.1. Enzimin Saflaştırılması

İyon değişim kromatografisinde elde edilen fraksiyonlarda absorbans (280

nm) ve enzim aktivitesi ölçümleri yapılmıştır. Aktivite ölçümleri pH’sı 4.98 olan 0.2

M sitrat tamponunda hazırlanmış, 100 mM 4-metil kateşol kullanılarak yapılmış ve

absorbans ve aktivite değerlerinden elde edilen grafik Şekil 4.1’de verilmiştir. Şekil

4.1’de görüldüğü gibi iki protein piki elde edilmiş, fakat bunlardan sadece bir

tanesinde enzim aktvitesi görülmüştür. Bu aktivite pikinde 21-26’ncı fraksiyonlar

birleştirilerek biyokimyasal özellikleri belirlenmiştir. Optimum pH değeri ( pH 4.5)

ve 50 mM 4-metil kateşol ile yapılan enzim aktivitesi ölçümlerine göre elde edilen

saflaştırma çizelgesi Çizelge 4.1’de verilmiştir. Çizelgeden de görüldüğü gibi PFO

enzimi % 24.5 verimle 11.7 kat saflaştırılmıştır.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

1 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100 109 118 127 136 145

Fraksiyon Sayısı

Abso

rban

s (2

80 n

m)

0

2000

4000

6000

800010000

12000

14000

16000

18000

PFO

akt

ivite

si (Ü

nite

/mL)

Absorbans (280 nm) PFO aktivitesi (Ünite/mL)

Şekil 4.1. DEAE-selüloz İyon Değişim Kromatoğrafisi ile Zeytin PFO’sunun Saflaştırılması.


27

Çizelge 4.1 Zeytin PFO’sunun Saflaştırma Çizelgesi

Saflaştırma Adımları

Hacim (ml)

Toplam protein (mg)

Toplam aktivite (ünite)

Spesifik aktivite (ünite/mg protein)

Saflaştırma Katsayısı

Verim (%)

Kaba ekstrakt

270

67.446

3759210

55736.6

1.00

100.0

(NH4)2SO4 çökeltmesi ve diyaliz

40

20.6

494280

23994.2

0.43

13.1

DEAE-Toyopearl 650M

24

1.41

922320

654127.7

11.7

24.5

4.2. Optimum pH

Enzimlerin maksimum aktivite gösterdikleri bir pH veya pH aralığı vardır. Bu

optimum pH’nın altında ve üzerinde aktiviteleri düşer. Enzimler kuvvetli asit ve

bazlara fazla dayanıklı değildirler. Ortam pH’sındaki aşırı olmayan değişiklikler

enzimin ve çoğu kez de substratın iyonik durumunda değişikliklere neden olur.

Enzimler kendileri için aşırı pH değerlerinde aktivitelerini kaybederler. Enzimlerin

maksimum reaksiyon hızına sahip oldukları pH değerine optimum pH denir.

Optimum pH’nın altında ve üstündeki pH’larda enzim veya substratta mevcut

fonksiyonel grupların yapılarında değişmeler oluşur ve reaksiyon hızı da değişime

uğrar (Koolman ve Roehm, 2005). Kovalent olmayan elektrostatik bağlar, hidrojen

bağları, hidrofobik bağlar ve kovalent disülfit bağları enzimlerin üçüncül ve

dördüncül yapılarını stabilize eder. Enzim üzerindeki pozitif ve negatif gruplar

arasında oluşan elektrostatik bağlar pH’dan etkilenirler. Nötral pH'larda

iyonlaşabilen yan gruplar –COO-, H3N+ ve H2N-C gruplarıdır ve bunlar kuvvetli

elektrostatik bağlar oluşturabilirler. pH 3’ün altında karboksil grupları protonlanırlar

(-COOH) ve elektrostatik bağ oluşturamazlar. pH 10’un üzerinde ise amino grupları

protonlanırlar (-NH2) ve elektrostatik bağlar oluşturamazlar (Whitaker, 2003).

Optimum pH ‘daki bu değişiklikler, doku kültürlerinin yaşlanmasına, dokudaki stres

şartlarının artmasına ve enzimin deterjan, üre gibi, denatüre ajanlarla etkileşimine,

yüksek sıcaklığa veya kısa süreliğine asid pH'ya maruz kalmasına bağlıdır.


28

Zeytin PFO’nun en yüksek aktivite gösterdiği optimum pH’sını belirleyebilmek

için standart reaksiyon karışımında pH’sı 3.04–6.70 arasında değişen tamponlar

kullanılarak enzim aktivitesi ölçülmüş ve sonuçlar % nispi aktivite olarak Şekil

4.2’de gösterilmiştir. Şekilden de görüleceği gibi pH 3.04’ten 4.50’a doğru aktivite

artmış en yüksek aktivite pH 4.5’te görülmüştür. Optimum pH’dan sonra enzim

aktivitesi önemli ölçüde azalarak % 20’lere kadar düşmüştür.

0

20

40

60

80

100

120

3.04 3.46 4.08 4.5 4.98 5.49 5.8 6.3 6.7

pH

Nis

bi

Akt

ivit

e (%

)

Şekil 4.2. pH’nın Zeytin PFO Aktivitesine Etkisi

Değişik ürünlerde PFO ile yapılan optimum pH çalışma sonuçları Çizelge

4.2’de verilmiştir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerden izole edilen

PFO’nun optimum pH değerleri 3–9 gibi geniş bir aralıktadır ve bu çalışmada elde

edilen sonuç (pH 4.5) literatürdeki değerlerle uyum içindedir.


29

Çizelge 4.2. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen PFO’ların Optimum pH Değerleri

*Enzimin iki optimum pH’sı bulunmuştur. 4.3 Optimum Sıcaklık

Kimyasal reaksiyonların hızı genellikle sıcaklıktaki artışla artar. Enzimlerle

katalizlenen reaksiyonların hızları da sıcaklıkla artmakla birlikte, yüksek

sıcaklıklarda enzimler protein yapılarından dolayı aktivitelerini kaybederler. Yüksek

sıcaklıklar enzimatik reaksiyonda rol oynayan fonksiyonel grupların disosiye olma

durumunu etkileyebilir; enzimin aktivatörlere ve inhibitörlere ilgisini etkileyebilir;

reaksiyonda substrat olabilecek oksijeninin çözünürlüğünü etkileyebilir. Bunların

dışında, yüksek sıcaklık enzimleri inaktive edebilir. Reaksiyon hızının maksimuma

Optimum pH

Ürün

Substrat

Kaynak

9.0 Fasulye Sürgünleri Kateşol

Nagai ve Suzuki, 2003

8.5 Kayısı (Malatya) Kateşol Arslan ve ark., 1998

7.5 Cassava kökleri Kateşol, L-Dopa Barthet,1997

7.0

Muşmula

4-Metil Kateşol

Ayaz ve ark., 2008

7.0 Patlıcan Kateşol Doğan ve ark., 2002

7.0 Anamur muzu Kateşol Ünal, 2007

5.0–7.5* Jonagored elması Kateşol Rocha ve Morais, 2001

5.0 Hint çay yaprağı Kateşol Hadler ve ark., 1998

4.0–7.0* Zambak Kateşol Yang ve Wang, 2008

3.0 Napolyon üzümü 4-tert-bütilkateşol

Delicado ve ark., 2007


30

eriştiği noktadaki sıcaklık derecesine optimum sıcaklık denir. Enzimlerin büyük

çoğunluğunun optimum aktivitesi 30–40 °C’dir ve 45 °C’nin üzerinde denatürasyon

başlar. Zeytin PFO’sunun en yüksek aktivite gösterdiği optimum sıcaklığı

belirleyebilmek için 20–80°C’ler arasında enzim aktivitesi ölçülmüş ve sonuçlar %

nispi aktivite olarak şekil 4.3’de verilmiştir. Ölçümlerde standart reaksiyon karışımı

kullanılmıştır.

0

20

40

60

80

100

120

20 30 40 50 60 70 80

SıcaklıkºC

% N

ispi akt

ivite

Şekil 4.3. Sıcaklığın Zeytin PFO’suna Etkisi

Şekilden de görüldüğü gibi enzim en yüksek aktiviteyi 30°C’de göstermiştir.

30°C’den itibaren sıcaklıktaki artışla beraber enzim aktivitesi azalarak % 30’lara

kadar düşmüştür.

Farklı bitkisel ürünlerde PFO ile yapılan optimum sıcaklık çalışma sonuçları

Çizelge 4.3’de verilmiştir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerden izole edilen

PFO’nun optimum sıcaklık değerleri 12-45 °C gibi geniş bir aralıktadır ve bu

çalışmada elde edilen sonuç (30°C) diğer araştırmacıların çalışmaları ile benzerlik

göstermektedir.


31

Çizelge 4.3. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen PFO’ların Optimum Sıcaklık Değerleri

Optimum Sıcaklık °C Ürün Kaynak 45 Dut Arslan ve ark., 2004 40 Fasulye Sürgünleri Nagai ve Suzuki, 2003 30 Muşmula Ayaz ve ark., 2008 30 Anamur Muzu Ünal, 2007 25 Enginar Aydemir, 2004 12 Ferula Bitkisi Erat ve ark., 2006

4.4. Kinetik Parametreler

Çeşitli ürünlerde bulunan PFO’ların substrat spesifikliği önemli bir farklılık

gösterirken, aynı ürünün farklı çeşitlerinde substrat spesifikliği büyük bir değişim

göstermeyebilir. Buna göre belli bir çeşitte PFO’nun öncelikli olarak kullandığı

fenolik bileşiklerin diğer çeşitlere kıyasla daha az bulunması durumunda, işleme

açısından bu çeşidin tercih edilmesi bir avantaj sayılabilir (Cemeroğlu ve ark., 2001).

Fenolik bileşikler PFO enzimi için birincil substratlardır. Birçok fenolik

bileşik PFO enzimi için substrat olarak görev yapar. Farklı bitki kaynaklarında çok

farklı türde ve miktarda doğal fenolik bileşikler bulunmaktadır. Örneğin klorojenik

asit üzüm ve çayda bulunan ana fenolik bileşiktir. Öte yandan klorojenik asit elma,

patates ve ayçiçeği gibi diğer birçok üründe bulunmaktadır. Kateşin, epikateşin ve

kafeik asit türevleri meyvelerde yaygın olarak bulunan fenolik bileşiklerdir. Ayrıca

muz pulpunda bulunan dopaminin endojen PFO etkisiyle oksidasyonu sonucu

enzimatik esmerleşme meydana geldiği bildirilmiştir. Bazı çalışmalarda farklı fenolik

bileşiklerin farklı esmerleşme derecesine sahip olduğu belirtilmiştir. Örneğin

üzümlerde bulunan monomerik kateşinler ve dimerik prosiyanidinler diğer fenolik

bileşiklerden daha çok esmerleşmektedir (Yoruk ve Marshall, 2003).

Substratın yan zincirinin doğası, hidroksil gruplarının sayısı ve benzen

halkasındaki pozisyonu enzimin katalitik aktivitesinde önemli etkiye sahiptir.

PFO’nun substrat spesifikliği bitki türüne ve bitkinin yetiştirme koşullarına da

bağlıdır. Örneğin, DeChaunac üzüm PFO’su kafeik asidi diğer substratlardan daha

hızlı okside etmektedir. Aynı zamanda 4-metil kateşol ve klorojenik aside karşı PFO


32

yüksek aktivite göstermektedir. Ancak, Koshu üzümünden elde edilen PFO

klorojenik asitte en yüksek aktivite göstermektedir ve bunu kafeik asit ve d-kateşin

izlemektedir. Öte yandan, Concord üzümü PFO’su kateşolü kafeik asitten daha hızlı

okside etmektedir (Yoruk ve Marshall, 2003).

Enzimin Km ve Vm değerlerini bulabilmek için 3.125mM-50mM arasında

değişen substrat konsantrasyonlarında enzim aktivitleri ölçülmüştür. Km ve Vm

değerleri, sırasıyla 14.52 mM ve 1.73 Abs/dk olarak hesaplanmıştır.

Değişik ürünlerden elde edilen PFO’ların Km değerleri Çizelge 4.4’te

görülmektedir. Görüldüğü gibi Km değerleri bu kaynağa göre büyük değişiklik

göstermektedir. Bu çalışmada elde edilen Km değeri bu değerlerle uyum içerisindedir.

Çizelge 4.4. Çeşitli Ürünlerin PFO’larının Km Değerleri

Ürün

Substrat

Km (mM)

Kaynak

Zambak Kateşol 3.40 Yang veWang, 2008

Anamur muzu Kateşol 8.50 Ünal, 2007 Enginar başı Kateşol 10.20 Aydemir, 2004

Hint çay yaprağı Kateşol 12.52 Halder ve ark.,1998 Cassava kökleri Kateşol 28.21 Barthet,1997

Fasulye sürgünleri Kateşol 71.00 Nagai ve Suzuki, 2003 Jonagored elması Kateşol 230.00 Rocha ve Morais, 2001

4.5. Termal İnaktivasyon

PFO’ın termal inaktivasyon kinetiği 65, 70 ve 75ºC’de 5, 10, 15 dk sürelerde

çalışılmıştır. Termal inaktivasyon parametreleri ısıl işleme maruz kalmış enzimlerin

aktivitelerinin ısıtılmamış örneğin aktivitesine kıyaslanmasıyla kD (inaktivasyon

sabiti), t1/2 (yarı ömür) ve D (desimal indigenme süresi) değerleri hesaplanmış ve

sonuçlar çizelge 4.5’de verilmiştir. Sıcaklık arttıkça kD değerleri artmış buna karşılık

enzim aktivitesini yarı yarıya azaltmak için gereken süre ve D değerleri azalmıştır.

65ºC’de enzimin yarı ömür değeri 31.9 dk iken 75ºC’de 9.24 dk olmuştur.


33

Çizelge 4.5. Zeytin PFO’sunun Termal İnaktivasyon Parametreleri Sıcaklık (°C) kD (dak-¹) r² t½ (dak) D (dak)

65 0.0217 0.9556 31.9 106.1

70 0.0318 0.9983 21.8 72.4

75 0.0750 0.9808 9.24 30.7

Termal inaktivasyon çalışmalarının diğer önemli parametreleri aktivasyon

enerjisi (Ea) ve enzimin D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için)

gereken sıcaklık artışı ifade eden Z değeridir. Bu çalışmada, Z ve Ea değerleri

sırasıyla 18.6°C (r²=0.9532) ve 121.043 kj.mol-1 (r²=0.9496) olarak hesaplanmıştır.

Termal inaktivasyon parametrelerinin diğer araştırıcıların sonuçları ile

karşılaştırılması çalışılan sıcaklık ve sürelerdeki farklılıklar nedeniyle zordur.

Çizelge 4.6’da değişik ürünlerden izole edilen PFO enzimlerinin aktivasyon

enerjileri (Ea) değerleri görülmektedir. Bu değer ürüne göre ve hatta aynı üründe bile

önemli farklılık göstermektedir. Çizelgeden görüldüğü gibi değişik ürünlerin

aktivasyon enerji değerleri 15.80-225.43 kj.mol-1 gibi geniş bir aralıkta

değişmektedir. Bu çalışmada bulunan Ea değeri literatürdeki değerlerle uyum

içindedir.

Çizelge 4.6. Çeşitli Ürünlerden izole edilen PFO’ların Aktivasyon Enerjileri

Ürün Ea

(kj.mol-1) Kaynak

Victoria üzümü 225.43 Râpeanu ve Bulancea, 2005

Anamur muzu 155.00 Ünal, 2007

Zambak 100.80 Yang ve Wang, 2008

Ananas püresi 82.80 Chutintrasria ve Noomhormb, 2006

Enginar başı 15.80 Aydemir, 2004

Z değerinin büyük olması enzimin ısıl dayanıklılığının diğer bir göstergesidir.

Yemenicioğlu ve arkadaşları yaptıkları çalışmada Taro yumrularından ekstrakte

ettikleri PFO enziminin Z değerinin 25.5°C olduğunu bulmuşlardır. Ünal (2007)

çalışmasında Anamur muzu PFO enziminin Z değerinin 14.2ºC olduğunu bulmuştur.

Chutintrasria ve Noomhormb (2006) çalışmalarında Ananas püresi PFO enziminin Z


34

değerini 21.5ºC bulmuşlardır. Râpeanu ve Bulancea (2005) Victoria üzümü PFO

enzimi ile yaptıkları çalışmada enzimin Z değerinin 9.66ºC olduğunu bulmuşlardır.

Domat zeytinindeki Z değeri ise bu değerlere yakın bulunmuştur.

4.6. İnhibitörlerin Etkisi

Enzimatik emerleşme nedeniyle meyve ve sebze ürünlerinde yıllık milyon

dolarlarca kayıplar meydana gelmektedir. Meyve ve sebze ürünlerinde olduğu kadar

deniz ürünlerinde de PFO nedeniyle meydana gelen esmerleşme reaksiyonları önemli

ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu nedenle ürünün raf ömrünü uzatmak ve

kalitesini korumak amacıyla bu enzimin kontrol altına alınması gerekmektedir. Zarar

görmüş dokuların esmerleşmesini önlemek veya azaltmak için deneysel bazı

yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu amaçla PFO aktivitesini önlemek için çeşitli

inhibitörler kullanılmaktadır. Kullanılan inhibitörler 5 grup altında toplanabilir

(Yoruk ve Marshall, 2003).

İndirgeyici ajanlar (askorbik asit ve analogları, sülfitler):

i. Çelat oluşturucu ajanlar (etilendiamintetraasetat (EDTA), sodyum

dietilditiokarbomat (DIECA), sodyum azid)

ii. Kompleks oluşturucu ajanlar (siklodekstrin, chitosan)

iii. Asitlendiriciler (askorbik asit, sitrik asit, malik asit, fosforik asit)

iv. Enzim inhibitörleri (substrat analogları, halidler)

v. Enzimatik uygulamalar (proteazlar, o-metiltransferaz)

Bu bileşikler aktif reaksiyon elementlerinden birini (enzim, substrat, bakır

veya o-kinonlar) reaksiyondan elimine etmek yolu ile esmerleşme reaksiyonlarını

inhibe eder veya azaltır (Yoruk ve Marshall, 2003).

İndirgeyici ajanlar gıda endütrisinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu

ajanlar 0-kinonların birikimini önlemek yolu ile melaninlerin oluşumunu inhibe eder

veya stabil renksiz ürünler oluştururlar. Bu ajanlardan en önemlisi sülfür dioksit

(SO2) veya sülfitlerdir (sodyum sülfit, sodyum bisülfit ve sodyum metabisülfit). Bu

ajanlar ekonomik olmaları ve esmerleşmeyi önlemede yüksek etkinliklerinden dolayı

meyve ve sebze endüstrisinde yaygınlıkla kullanılmaktadır(Yoruk ve Marshall,

2003). Sodyum disülfit, indirgeyici bir ajandır. İndirgeyici ajanlar gıda endütrisinde


35

yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu ajanlar o-kinonların birikimini önlemek yolu

ile melaninlerin oluşumunu inhibe eder veya stabil renksiz ürünler oluştururlar. L-

sistein ise antioksidan özellikte bir maddedir (Zawistowski ve ark., 1991).

Askorbik asit (vitamin C) ve onun izomeri eritorbik asit sülfitlere alternatif

olarak kullanılan en iyi indirgeyici ajandır ve yaygın olarak meyve suları, püreleri,

dondurulmuş dilimlenmiş meyveler ve konserve meyve ve sebzelerde

kullanılmaktadır. Askorbik asidin tükenmesinden sonra esmerleşme başlar. PFO’nun

neden olduğu esmerleşmeyi daha iyi kontrol altına almak için askorbik asit diğer

inhibitörlerle birlikte kullanılmalıdır. Örneğin askorbik asit ve sitrik asidin birlikte

kullanımı tek başına kullanılmalarından daha etkilidir.

Bu çalışmada, askorbik asit, sodyum disülfit ve L-sisteinin zeytin PFO’suna

olan inhibibe edici etkileri 0.01, 0.10 ve 1.00 mM konsantrasyonlarda incelenmiştir.

Sonuçlar % inhibisyon olarak Çizelge 4.7’de verilmiştir. Denenen tüm inhibitörlerde

% 100 inhibisyon görülmemiş, en yüksek inhibisyon derecesi % 69.63’lük

inhibisyon derecesi ile 1 mM konsantrasyonda L-Sisteinle olmuştur. L-Sistein ve

Sodyum Disülfitin inhibe edici etkileri birbirine yakın olmuş, buna karşılık askorbik

Asit en düşük inhibisyonu göstermiştir.

Çizelge 4.7. İnhibitörlerin Zeytin PFO’suna Etkileri

Ünal’ın (2007) Anamur muzu PFO’su üzerine yaptığı çalışmada askorbik asit

ve sodyum metabisülfit en etkili inhibitörler olarak bulunmuştur. NaCl ve sitrik asit

İnhibitör Konsantrasyon(mM) İnhibisyon (%)

Askorbik asit

0.01

0.10

1.00

13.20 ± 2.09

23.33 ± 6.53

31.65 ± 1.24

Sodyum disülfit

0.01

0.10

1.00

33.58 ± 0.58

59.66 ± 5.33

69.42 ± 2.78

L-Sistein

0.01

0.10

1.00

23.71 ± 0.23

48.48 ± 8.4

69.63 ± 3.01


36

daha az etkili bulunmuştur. Ziyan ve Pekyardımcı’nın (2003) Ankara armudu

PFO’su üzerine yaptıkları çalışmada sodyum dietilditiyokarbamat en etkili inhibitör

olarak bulunmuştur. Rapeanu ve arkadaşları (2006), Güney Afrika’da yetişen

Viktorya üzümlerinden ekstrakte ettikleri PFO enzimi üzerinde sekiz inhibitör test

etmişler ve en etkili inhibitörlerin askorbik asit, L-sistein ve sodyum metabisülfit

olduğunu bildirmişlerdir.

Orenes-Pinero ve ark. (2006), yaptıkları çalışmada ayva PFO’sunu kısmi

olarak saflaştırarak birkaç inhibitörün etkisini denemişler ve en etkili inhibitörün

tropolon olduğunu bulmuşlardır. Yağar ve Sağıroğlu (2000), PFO enzimini ayvadan

ekstrakte ettikleri çalışmada, sekiz çeşit inhibitörü test etmişler ve ayva PFO’su

üzerinde en etkili olanlarının L-sistein, askorbik asit, potasyum siyanid olduğunu

bulmuşlardır.

Yang ve Wang’ın (2008) zambak bitkisi PFO’su üzerine yaptıkları çalışmada

en etkili inhibitör sodyum sülfit (0.1 mM) bulunurken, askorbik asit, L-sistein ve

tiyoürenin yüksek konsantrasyonlarda (10 mM) oldukça etkili inhibe edici etki

gösterdiği bulunmuştur. NaCl ve sitrik asit bu bitki enzimi için zayıf inhibitörler

olarak belirtilmiştir. Nagai ve Suzuki’nin (2003) fasulye filizi PFO’su üzerine

yaptıkları çalışmada 3 mM konsantrasyonda askorbik asit, L-sistein, 2-

merkaptoetanol ve glutation etkili inhibitörler olarak gösterilmiştir.

5.SONUÇ Ceren TAŞ

37

5. SONUÇ

Bu çalışmada Domat çeşidi zeytinden izole edilerek kısmen saflaştırılan

polifenol oksidaz’ın (PFO) biyokimyasal özellikleri araştırılmıştır. Bu bağlamda,

enzimin optimum pH ve sıcaklığı, kinetik parametreleri, termal inaktivasyonu ve

bazı inhibitörlerin etkisi incelenmiştir.

Elde edilen bulgulardan;

§ Substrat olarak 4-metil kateşol kullanılmış ve enzimin Km değerinin

14.52 mM, Vm değerinin ise 1.73 Abs/dk olduğu,

§ pH 3.04’den pH 4.5’a doğru arttırıldıkça, enzim aktivitenin de arttığı,

en yüksek aktivitenin pH 4.5’da görüldüğü ve enzim aktivitesinin

optimum pH’dan sonra önce hızlı sonra yavaş olarak düştüğü,

§ Enzimin en yüksek aktiviteyi 30°C’de gösterdiği, 30°C’den itibaren

sıcaklıktaki artışla beraber enzim aktivitesinin hızla azalarak 70 °C’de

yaklaşık % 20’ye düştüğü,

§ Enzimin Z ve Ea değerlerinin 18.55°C (r²=0.9532) ve

121.043 kj.mol-1 (r²=0.9496) olduğu,

§ L-Sistein ve sodyum disülfitin inhibe edici etkilerinin birbirine yakın

olduğu buna karşılık askorbik asitin inhibisyon etkisinin denen diğer

inhibitörlere göre daha düşük olduğu belirlenmiştir.

38

KAYNAKLAR

ANONİM, 2001. Tarımsal Göstergeler (1998-2004). T.C. Başbakanlık Devlet

İstatistik Enstitüsü Yayınları, Ankara.

ANONİM, 2004, Food and Agriculture Organization of the United

Nations.(1998-2004).

ANONYMOUS, 2006b, Modern Zeytincilikte Kültürel İşlemler

www.zae.gov.tr/yetiştirme/41.asp.

ARSLAN, O., TEMUR, A., ve TOZLU, İ., 1998. Polyphenol oxidase from

Malatya apricot (Prunus armeniaca L.). Journal of Agriculture and

Food Chemistry, 46: 1239-1241.

ARSLAN, O., ERZENGİN, M., SİNAN, S. ve ÖZENSOY, Ö., 2004.

Purification of Mulbery (Morus alba L.) polyphenol oxidase by Affinity

Chromatography and Investigation of Its Kinetic and Electrophoretic

Properties. Food Chemistry, 88:479-484.

AYAZ, F.A., DEMIR, O., TORUN H., KOLCUOGLU Y. ve ÇOLAK, A.,

2008.Characterization of Polyphenoloxidase (PPO) and Total Phenolic

Contents in Medlar (Mespilus germanica L.) Fruit During Ripening and

Over Ripening, Science Direct, Food Chemistry, 106: 291–298.

AYDEMİR, T., KAVRAYAN, D., ve ÇINAR, S., 2003. Isolation and

Characterisation of Polyphenoloxidase from Jerusalem Artichoke

(Helianthus tuberosus) S.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi Fen Dergisi, Sayı

21, 115-125, KONYA.

AYDEMİR, T., 2004. Partial Purification and Characterization of Polyphenol

Oxidase from Artichoke (Cynara scolymus L.) Heads, Food Chemistry,

87: 59–67.

AYDIN, C., 2000. Bazı Zeytin Çeşitlerinde Meyvenin Fiziko- Mekanik

Özellikleri, Selçuk Ü. Zir. Fak. Dergisi 14 (23): 83-88.

http://www.zae.gov.tr/yeti

39

BARTHET, V. J. 1997. Polyphenol Oxidases from Cassava (Manihot

Esculenta C.)Root: Extraction, Purification and Characterization,

Submitted to PartialFulfilment of the Requirements for the degree

Philosophiae Doctor in the Department of Food Science and

Agricultural Chemistry University McGiU (Macdonald Campus)

Montreal, PQ, Canada, i-ii.

BEN-SHALOM, N., KAHN, V., HAREL, E. ve MAYER, A.M. 1977. Journal

of Science of Food and Agriculture, 28:545.

BOSKOU, D. 1996. Oive Oil Chemistry and Techonology. AOCS Press,

Champaign,IL, 161p, USA

BOZDOĞAN, D., 2002. Hatay’da Üretilen Natürel Zeytin Yağlarının Bazı

Fiziksel, Kimyasal ve Duyusal Özelliklerinin İncelenmesi. Mustafa

Kemal Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi,

Antakya.

BRADFORD, M. M., 1976. a Rapid and Sensitive for the Quantitation of

Microgram Quantitites of Protein Utilizing the Principle of Protein-dye

Binding, Analytical Biochemistry, 72: 248-254.

BRENES-BALBUENA, M., ROMERO, C., GARCIA, P. ve GARRIDO, A.,

1995. Effect of pH on the Colour Formed by Fe-Phenolic Complexes in

Ripe Olives. J. Sci. Food Agric., 67: p. 35-41.

CASADO-VELA, J., SELLES, S. ve BRU, R., 2005. Purification and Kinetic

Characterization of Polyhphenol oxidase from Tomato Fruits. Journal of

Food Biochemistry, 29:381-401.

CASH, J. N., SİSTRUNK, W. A., ve STUTTE, C. A. 1976. Characteristics of

concord grape polyphenoloxidase involved in juice color loss. Journal

of Food Science, 41, 1398–1402.

CEMEROĞLU, B., YEMENİCİOĞLU, A. ve ÖZKAN, M., 2001. Meyve ve

Sebzelerin Bileşimi Soğukta Depolanmaları, Gıda Teknolojisi Derneği

Yayınları No:24, Ankara.

40

CHUTINTRASRIA, B. ve NOOMHORMB, A., 2006. Thermal Inactivation of

Polyphenoloxidase in Pineapple Puree, LWT - Food Science and

Technology, 39: 492–495.

COSETENG, M.Y., LEE, C.Y. ve 1987. Changes in Apple Polyphenoloxidase

and Polyphenol Concentrations in Relation to Degree of Browning,

Jounal of Food Science, 4, 985-989.

DELICADO,E. N, MEGI´AS, M.S., LO´PEZ, A.J.P. ve NICOLA´S, J.M.L.,

2007. Characterization of Polyphenol Oxidase from Napoleon Grape,

Food Chemistry, 100: 108–114.

DING, C., CHACHIN, K., UEDA, Y. ve IMAHORI, Y., 1998. Purification and

Properties of Polyphenol oxidase from Loquat. Journal of Agriculture

and Food Chemistry, 46: 4144-4149.

DOĞAN, M., ARSLAN, O. ve DOĞAN, S., 2002. Substrate specificity, heat

inactivation and inhibition of polyphenol oxidase from different

aubergine cultivars International Journal of Food Science and

Technology 2002, 37, 415-423.

ESPİN, J.C., TUDELA, J. ve GARCİA-CANOVAS, F., 1997.Monophenolase

Activitiy of Poliphenol Oxidase from Artichoke Heads (Cynara

scolymus L.). Lebensmittel Wissenschaft u. Technology, 30 (1997)819-

825 .

ESTİ, M., CİNQUANTA, L. ve LA NOTTE, E., 1998. Phenolic Compounds in

Different Olive Varieties. J. Agric. Food Chemistry, 46 (1): s. 32-35.

FAO, 2004. http://www.fao.org.

GAUILLARD, F. ve RICHARD-FORGET, F., 1997. Polyphenoloxidase from

Williams Pear (Pyrus communis L, cv Williams): Activation,

Purification and Some Properties. Journal of the Science of Food and

Agriculture, 74:49-56.

http://www.fao.org

41

GARCIA, P., CONCEPCION, R., BRENES, M. ve GARRIDO, A., 1996.

Effect of Metal Cations on the Chemical Oxidation of Olive o-diphenols

in Model Systems. J. Agric. Food Chem., 44 (8): s. 2101-2105.

GODFREY, T. ve WEST, S., 1996. Industrial Enzmology. Stockton Pres, New

York.

GΌMEZ, V. M., 2002. Some biochemical properties of polyphenol oxidase

from two varieties of avocado, Food Chemistry 77 (2002) 163-169.

GOUPY, P, FLEURIET,A., AMIOT, M. ve MACHEIX, J., 1991. Enzymatic

Browning, Oleuropein Content, and Diphenol Oxidase Activity in Olive

Cultivars (Olea europaea L.). Journal of Agricultural and Food

Chemistry. 39: 92-95.

GÜLÇİN, İ., KÜFREVİOĞLU, Ö. İ. ve OKTAY, M., 2005. Purification and

Characterization of Polyphenol oxidase from Netle (Urtica dioica L.)

and inhibitory effects of some chemicals on enzyme activity. Journal of

Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 20(3):297-302.

HALDER, J., TAMULI, P. ve BHADURI, A.N., 1998. Isolation and

Characterization of Polyphenol Oxidase from Indian Tea Leaf

(Camellia sinensis), Nutritional Biochemistry, 9: 75-80.

INGEBRIGSTEN, J., KANG, B. ve FLURKEY, M.W.H. 1989. Journal of

Food Science, 54:128.

KEÇELİ, T., 2000. Antimicrobial and Antioxidant Activity of Olive Oil

Phenolics, in Food Science and Tecnology. The University of Reading :

Reading 312s.

KEÇELİ, T. ve GORDON, M.H., 2001. The Antioxidant Activity and Stability

of the Phenolic Fraction of Green Olives and Extra Virgin Olive Oil. J.

Sci. Food and Agric., 81: s. 1391-1396.

KOOLMAN, J. ve ROEHM, K. H., 2005. Color Atlas of Biochemistry, 2nd Ed.

Thieme, Stuttgart, s. 88-94.

42

KRISTAKIS, A. K., 1998. Olive Oil. From Tree to the Table. 2nd Edition.

Food & Nutrition Pres., Inc., 347 s.

MARANGONI, A. G., 2003. Enzyme Kinetics: A Modern Approach, New

Jersey: John Wiley & Sons, 140-157.

MAZZAFERA P. ve ROBİNSON S.P., 2000. Characterization of polyphenol

oxidase in coffee. Phytochemistry 55: 285-296.

MONTEDORO, G., 1993. Simple and Hydrolyzable Phenolic Compounds in

Virgin Olive Oil. 3. Spectroscopic Characterisations of Secoiridoid

Derivatives. J. Agric.,Food Chem., 41: 2228-2234.

MUCHUWETI, M., MUPURE, C. H., NDHLALA, A. R. ve

KASIYAMHURU, A., 2006. Characterization of Polyphenoloxidase

from Uapaca kirkiana Fruit. Journal of the Science of Food and

Agriculture, 86: 328-332.

NAGAI, T. ve SUZUKI, N., 2003. Polyphenol Oxidase from Bean Sprouts

(Glycine max L.), Journal of Food Science (68) issue 1, 16-20.

NAKAMURA, K., AMANO, Y. VE KAGAMİ, M., 1983. Purification and

some properties of a polyphenol oxidase from Koshu grapes. Journal

Enology Viticulture, 34:122-127.

ORENES-PINERO, E., GARCIA-CARMONA, F., SANCHEZ-FERRER, A.,

2006. Latent Polyphenoloxidase from Quince Fruit Pulp (Cydonia

oblonga): purification, activation and some properties. Journal of the

Science of Food and Agriculture, 86:2172-2178.

ÖKSÜZ, E., 1998. Ülkemizde Zeytin Hasat Mekanizasyon Düzeyi, Hasat

Edilebilirlik Kriterleri ve Maliyetinin Belirlenmesi Üzerine Bir

Araştırma, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Tarım

Makineleri Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Adana.

RAPEANU, G. ve BULANCEA, M., 2005. Thermal Inactivation Kinetics of

Polyphenoloxidase Extracted from White Grapes, Acta Universitatis

Cibiniensis Series E: Food Technology, Vol. IX, no.1.

43

RAPEANU, G., LOEY, A. V., SMOUT, C. ve HENDRİCKX, M., 2006.

Biochemical Characterization and Process Stability of

Poliphenoloxidase Extacted from Victoria Grape (Vitis vinifera ssp.

Sativa) . Food Chemistry 94 (2006) 253-261.

ROBARDS, K., PRENZLER, P. D., TUCKER, G., SWATSITANG, P. ve

GLOVER, W., 1999. Phenolic Compounds and Their Role in Oxidative

Process in Fruits. Food Chemistry., 66 (4): s. 401-436.

ROCHA, A.M.C.N., CANO, M.P., GALEAZZI, M.A.M. ve MORAIS,

A.M.M.B., 1998. Characterisation of “Starking” Apple

Polyphenoloxidase. Journal of the Science of Food and Agriculture,

77:527-534.

ROCHA, A.M.C.N. ve MORAIS, A.M.M.B., 2001. Characterization of

Polyphenoloxidase (PPO) Extracted from "Jonagored" Apple, Food

Control, 12: 85-90.

RYAN, D., ve ROBARDS, K., 1998. Phenolic Compounds in Olives. Analyst,

123 (5) : s. 31R – 44R.

RYAN, D., ROBARDS, K. ve LAVEE, S., 1999a. Determination of

PhenolicCompounds in Olives by Reversed Phase Chromatography and

Mass Spectrometry. J. Chromatography, 832 (1-2): s. 87-96.

SABANCILAR, İ., EMRE, Ö., BAYCAN, Y.S., DEMİR, H. ve ERGE, H.,

2007, Denizli Narından Afinite Kromatografisi Yardımı ile Polifenol

Oksidaz Enziminin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu, Yüzüncü Yıl

Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, Kimya Eğitimi ABD, VAN. Yüzüncü

Yıl Üniversitesi, Fen-Edb. Fakültesi, Kimya Bölümü, Biyokimya ABD,

VAN.

SAIJA, A., TROMBETTA, D., CASCIO, R., PRİNCİ, P., UCCELLA,

N.,BONİNA, F. ve CASTELLİ, F., 1998. 'In Vitro' Evaluation of the

Antioxidant Activity and Biomembrane Intraction of the Plant Phenols

44

Oleuropein and Hydroxytyrosol. _nternational Journal of

Pharmaceutics, 166 (2): s. 123-133.

SANCHEZ-FERRER, A., BRU, R., CABANES, J. ve GARCİA-CARMONA.,

F., 1988. Characterizition of catecholase and cresolase activities of

Monastrell grape polyphenol oxidase. Phytochemistry, 27: 319-321.

SANCHEZ-FERRER, A., BRU, R., VALERO, E. ve GARCİA-CARMONA.,

F., 1989. Changes in pH-dependent grape polyphenol oxidase acitivity

during maturation. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 37:

1242-1245.

SAYGILI, N., LEBLEBİCİ, F. ve KÖKSEL, H. 1998. Farklı şeker pancarı

türlerindeki polifenoloksidaz varlığının araştırılması. Gıda Dergisi,

(98/3); 165 –169.

SCIANCALEPORE, V. ve LONGONE, V. 1984. Journal of Agriculture and

Food Chemistry 32:320.

SERRADELL, M. A., ROZENFELD, P. A., MARTINEZ, G. A., CIVELLO, P.

M.,CHAVES, A. V. ve ANON, M. C., 2000. Polyphenoloxidase

Activity From Strawberry Fruit (Fragaria x ananassa, Duch., cv Selva):

Characterisation and Partial Purification, Journal of the Science of Food

and Agriculture, 80: 1421-1427.

SEGOVIA-BRAVO, K., JAREN-GALAN, M., GARCIA-GARCIA, P., ve

GARRIDO-FERNANDEZ, A., 2007. Characterization of Polyphenol

oxidase from the Manzanilla Cultivar (Olea europea pomiformis) and

prevention of Browning Reactions in Bruised Olive Fruits. Journal of

Agriculture and food Chemistry. DOI 10.1021/jf063675f.

TSİMİDOU, M., 1998. Polyphenols and Quality of Virgin Olive Oil in

Retrospect. Ital. J. Food Sci., 10: 99-116.

ULAŞ, M., 2001. Çukurova Bölgesinde Yaygın bazı Sofralık ve Yağlık Zeytin

Çeşitlerinin Morfolojik, Fenolojik ve Pomolojik Özelliklerinin

45

Belirlenmesi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe

Bitkileri Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Adana.

ÜNAL, M. Ü. ve ŞENER, A., 2006. Determination of Some Biochemical

Properties of Polyphenol Oxidase from Emir Grape (Vitis vinifera L.

cv. Emir), Journal of the Science of Food and Agriculture, 86: 2374–

2379.

ÜNAL, M. Ü., 2007. Properties of Polyphenol Oxidase from Anamur Banana

(Musa cavendishii), Food Chemistry, 100: 909-913.

WEEMAES, C. A., LUDIKHUYZE, L. R., BROECK, I. V., HENDRICKX, M.

E. ve TOBBACK, P.P., 1998. Activity Electrophoretic Characteristics

and Heat Inactivation of Polyphenoloxidase from Apples, Avocados,

Grapes, Pears and Plums. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technogile,

31:44-49.

WHITAKER, J. R., 2003. Enzyme Catalyzed Reactions: Experimental Factors

that Affect Rates, Handbook of Food Enzymology (Editörler; Whitaker,

J. R., Voragen, A. G. J. ve Wong D. W. S) Marcel Dekker, New York,

31-65.

WISSEMANN, K. W. ve LEE, C. Y., 1981. Characterization of

Polyphenoloxidase from Ravat 51 and Niagara Grapes.

Joural of Food Science, 46:506-508.

YAGAR, H. ve SAĞIROĞLU A., 2000, Partially Purifcation and

Characterization of Polyphenol Oxidase of Quince, Trakya University,

Department of Chemistry, 22030 Edirne-TURKEY.

YAGAR, H., 2004. Some Biochemical Properties of Poliphenol Oxidase from

Celery. Preparative Biochemistry and Biotechnology vol. 34, no. 4,

(2004) 378-397.

YANG, Y. ve WANG, Z., 2008. Some Properties of Polyphenol Oxidase

from Lily,International Journal of Food Science and Technology, 43:

102–107.

46

YEMENİCİOĞLU, A. ve CEMEROĞLU, B., 1996. Hale Haven

Şeftalilerinde Polifenoloksidaz Enzimlerinin Bazı Nitelikleri. Journal of

Agricultural and Forestry, 22:261-265.

YEMENİCİOĞLU, A., ÖZKAN, M. ve CEMEROĞLU, B.,1997. Inactivation

Kinetics of Apple Polyphenoloxidase and Activation of its Latent Form.

Journal of Food Science, Volume 62, No. 3, (1997) 508-510.

YEMENİCİOGLU, A., OZKAN, M. ve CEMEROGLU, B. (1999). Some

characteristics of polyphenol oxidase and peroxidase from taro

(Colocasia antiquorum). Turkish Journal of Agriculture and Forestry,

23, 425–430.

YORUK, R. ve MARSHALL, M. R., 2003. Physicochemical Properties and

Function of Plant Polyphenol Oxidase: A review. Journal of Food

Biochemistry, 27: 361-422.

ZAWISTOWSKI, J., BILIADERIS, C. G., ve ESKIN, N. A. M., 1991.

Polyphenol Oxidase (D. S. Robinson and N. A. M. Eskin editör).

Oxidative Enzymes in Foods, Elsevier, s. 217-273.

ZİYAN, E., ve PEKYARDIMCI, Ş., 2003. Characterization of polyphenol

oxidase from Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus). Turkish

Journal of Chemistry, 27:217-225.

47

ÖZGEÇMİŞ

1983 yılında İstanbul’da doğdum. İlköğrenimimi Trabzon’da, orta ve lise

öğrenimimi İstanbul’da tamamladım. 2002 yılında Çukurova Üniversitesi Gıda

Mühendisliği Bölümünde lisans öğrenimime başladım. 2006 yılında Gıda Mühendisi

unvanı ile mezun oldum. 2006 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı’nda yüksek lisans öğrenimime başladım. Hala

Yüksek lisans öğrenimime devam etmekteyim.

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ …I ÖZ YÜKSEK LİSANS DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL...

Documents

Transcript of ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ …I ÖZ YÜKSEK LİSANS DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL...