Post on 03-Apr-2015
PProtéines de Stress : marqueurs rotéines de Stress : marqueurs de protéotoxicitéde protéotoxicité
Qu’est ce que les Hsp ?Qu’est ce que les Hsp ?Qu’est ce que les Hsp ?Qu’est ce que les Hsp ?
Hsp : Heat Shock ProteinsHsp : Heat Shock Proteins Hsp : Heat Shock ProteinsHsp : Heat Shock Proteins
Hsp 70Hsp 70 Hsp 70Hsp 70 Hsp 90Hsp 90 Hsp 90Hsp 90 Hsp 100Hsp 100 Hsp 100Hsp 100
Classées en plusieurs famillesClassées en plusieurs familles Classées en plusieurs famillesClassées en plusieurs familles
Hsp de faible PMHsp de faible PM Hsp de faible PMHsp de faible PM Hsp 60Hsp 60 Hsp 60Hsp 60
Ritossa, 1962 : Choc thermiqueRitossa, 1962 : Choc thermique Ritossa, 1962 : Choc thermiqueRitossa, 1962 : Choc thermique
Hsp 70 : hautement conservéesHsp 70 : hautement conservées Hsp 70 : hautement conservéesHsp 70 : hautement conservées
Hsp constitutivesHsp constitutives Hsp constitutivesHsp constitutives
Transport sub-cellulaire des protéinesTransport sub-cellulaire des protéines Transport sub-cellulaire des protéinesTransport sub-cellulaire des protéines
Repliment des protéines nativesRepliment des protéines natives Repliment des protéines nativesRepliment des protéines natives
Réparation des protéines dénaturéesRéparation des protéines dénaturées Réparation des protéines dénaturéesRéparation des protéines dénaturées
Dégradation des protéines non réparéesDégradation des protéines non réparées Dégradation des protéines non réparéesDégradation des protéines non réparées
Chaperons moléculairesChaperons moléculaires Chaperons moléculairesChaperons moléculaires
Hsp inductiblesHsp inductibles Hsp inductiblesHsp inductibles
Tous les systèmes vivantsTous les systèmes vivants Tous les systèmes vivantsTous les systèmes vivants
Plusieurs agents inducteursPlusieurs agents inducteurs Plusieurs agents inducteursPlusieurs agents inducteurs
Bactérie, Levure, Organismes supérieursBactérie, Levure, Organismes supérieurs Bactérie, Levure, Organismes supérieursBactérie, Levure, Organismes supérieurs
Fièvre, Infection virale, …. Fièvre, Infection virale, …. Fièvre, Infection virale, …. Fièvre, Infection virale, ….
Stress oxydatif Stress oxydatif Stress oxydatif Stress oxydatif
Métauds lourds Métauds lourds Métauds lourds Métauds lourds
Xénobiotiques Xénobiotiques Xénobiotiques Xénobiotiques
CytoprotectionCytoprotection CytoprotectionCytoprotection
Différents facteurs d’induction des familles Différents facteurs d’induction des familles de Hspde Hsp
Hsp110
Hsp90Hsp70Hsp60
Hsp27
Agents de stress (dénaturation protéique):
Altération de l’état physiologique(augmentation de la synthèse protéique):
- Choc thermique- Alcool- Rayons ultraviolets- Métaux lourds - Oxydants- Chimiothérapie
- Cycle cellulaire- Facteurs de croissance- Infection, inflammation - Récupération à hypoxie ou carence en glucose
Les protéines de choc thermique se lient à des protéines Les protéines de choc thermique se lient à des protéines
dégradées par un stress et évitent leur agrégation et dégradées par un stress et évitent leur agrégation et
rétablissent leur fonctionsrétablissent leur fonctions
Les protéines de choc thermique se lient à des protéines Les protéines de choc thermique se lient à des protéines
dégradées par un stress et évitent leur agrégation et dégradées par un stress et évitent leur agrégation et
rétablissent leur fonctionsrétablissent leur fonctions
Mécanismes d’induction : protétoxicitéMécanismes d’induction : protétoxicité Mécanismes d’induction : protétoxicitéMécanismes d’induction : protétoxicité
Hsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiquesHsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiquesHsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiquesHsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiques
L’induction des Hsp : L’induction des Hsp : L’induction des Hsp : L’induction des Hsp :
réponse sensible et précoceréponse sensible et précoce
réponse dose et temps dépendanteréponse dose et temps dépendante
réponse sensible et précoceréponse sensible et précoce
réponse dose et temps dépendanteréponse dose et temps dépendante
Hsp et Toxicologie Hsp et Toxicologie moléculairemoléculaire
Quels rôles jouent les Hsp ?
1) Assiste le repliment des protéines dans différents Assiste le repliment des protéines dans différents
compartiments cellulairescompartiments cellulaires
2)2) Assure le maintien des structures tri-dimentionnelles Assure le maintien des structures tri-dimentionnelles
des protéinesdes protéines, ,
3)3) Asssite le repliement correcte des protéines dénaturéesAsssite le repliement correcte des protéines dénaturées
4)4) Assure la Assure la translocation translocation des protéines à travers les des protéines à travers les
differents compartiment cellulairesdifferents compartiment cellulaires, ,
5)5) Pr Préévviient ent de l’aggrégation des protéinesde l’aggrégation des protéines
6)6) D Déégradgradee des protéines instablesdes protéines instables
HSP FamilyCellular Location
Proposed Function
HSP27 (sHSP)
Cytosol, nucleus
Microfilament stabilization, antiapoptotic
HSP60 Mitochondria
Refolds proteins and prevents aggregation of denatured proteins, proapoptotic
HSP70 family:
Antiapoptotic
HSP72 (Hsp70)
Cytosol, nucleus
Protein folding, cytoprotection
HSP73 (Hsc70)
Cytosol, nucleus
Molecular chaperones
HSP75 (mHSP70)
Mitochondria
Molecular chaperones
HSP78 (GRP78)
ER Cytoprotection, molecular chaperones
HSP90 Cytosol, ER, nucleus
Regulation of steroid hormone receptors, protein translocation
HSP110/104 Cytosol Protein folding
Table 1. Cellular locations and proposed functions of mammalian heat shock protein familiesHSP, heat shock protein; sHSP, small HSP; ER,
endoplasmic reticulum.
La famille des Hsp 70
HSP70 HSP70 sont les plus inductibles et les sont les plus inductibles et les
plus conservéesplus conservées
Elles présententElles présentent 60-80% 60-80% d’homologie d’homologie
dans le monde des eucaryotesdans le monde des eucaryotes
Mécanisme d’induction des Hsp
70
La zéaralénone induit-elle La zéaralénone induit-elle
l’expression des Hsp 70 ?l’expression des Hsp 70 ?
Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?
La zéaralénone induit-elle La zéaralénone induit-elle
l’expression des Hsp 70 ?l’expression des Hsp 70 ?
Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?
LLaboratoire de aboratoire de RRecherche sur les echerche sur les SSubstances ubstances BBiologiquement iologiquement CCompatibles (ompatibles (LLRRSSBBCC))
ObjectifsObjectifsObjectifsObjectifs
Étudier la cytotoxicité de la ZENÉtudier la cytotoxicité de la ZEN
Étudier l’expression des Hsp 70 et leur potentiel Étudier l’expression des Hsp 70 et leur potentiel
cytoprotecteurcytoprotecteur
Modèle in vitro : Hep Modèle in vitro : Hep G2G2Modèle in vitro : Hep Modèle in vitro : Hep G2G2
Le foie est une cible préférentielle Le foie est une cible préférentielle de la ZEN de la ZEN
Le foie est une cible préférentielle Le foie est une cible préférentielle de la ZEN de la ZEN
Activation métabolique (Activation métabolique (-, -, --zearalenol)zearalenol)
Activation métabolique (Activation métabolique (-, -, --zearalenol)zearalenol)
Modèle retenu pour la réponse Modèle retenu pour la réponse HspHsp
Modèle retenu pour la réponse Modèle retenu pour la réponse HspHsp Hépatocytes humainsHépatocytes humains Hépatocytes humainsHépatocytes humains
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
ZEN concentration (µM)
Via
bi l
ité
(% d
u c
on
tro
l)
Inhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µMInhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µM Inhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µMInhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µM
Cas de la ZEN / Hep G2Cas de la ZEN / Hep G2Cas de la ZEN / Hep G2Cas de la ZEN / Hep G2
Viabilité cellulaireViabilité cellulaire Viabilité cellulaireViabilité cellulaire
Comment peut-on déterminer le niveau Comment peut-on déterminer le niveau
d’expression d’une protéine bien déterminée d’expression d’une protéine bien déterminée
au niveau d’une population cellulaire ou à au niveau d’une population cellulaire ou à
partir d’un tissu ou organe ?partir d’un tissu ou organe ?
Comment peut-on déterminer le niveau Comment peut-on déterminer le niveau
d’expression d’une protéine bien déterminée d’expression d’une protéine bien déterminée
au niveau d’une population cellulaire ou à au niveau d’une population cellulaire ou à
partir d’un tissu ou organe ?partir d’un tissu ou organe ?
DémarcheDémarcheDémarcheDémarche
Traitement des cellules avec des concentrations croissantes Traitement des cellules avec des concentrations croissantes
de ZENde ZEN
Extraction des protéines cellulairesExtraction des protéines cellulaires
Séparation des protéines par électrophorèseSéparation des protéines par électrophorèse
Transfert des protéines Transfert des protéines
Immunodétection de la protéine d’intérêtImmunodétection de la protéine d’intérêt
1.1. Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués
2.2. Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris
3.3. Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline
4.4. Phosphatase alcaline Phosphatase alcaline
5.5. S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP
P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase
alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène
anticorpsanticorps
1.1. Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués
2.2. Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris
3.3. Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline
4.4. Phosphatase alcaline Phosphatase alcaline
5.5. S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP
P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase
alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène
anticorpsanticorps
RésultatsRésultatsRésultatsRésultats
6h6h6h6h
12h12h12h12h
24h24h24h24h
Expression des Hsp 70Expression des Hsp 70 Expression des Hsp 70Expression des Hsp 70
C 10 20 40 80 100 µM
C 10 20 30 40 50 nM
Choc thermiqueChoc thermique Choc thermiqueChoc thermique 0 4 8 12 16 20h
C 10 20 40 µM
ZEN : 120 µMZEN : 120 µM ZEN : 120 µMZEN : 120 µM
CTN : 260 µMCTN : 260 µM CTN : 260 µMCTN : 260 µM
T-2 toxine : 110 nMT-2 toxine : 110 nM T-2 toxine : 110 nMT-2 toxine : 110 nM
La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et
induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière
dose dépendantedose dépendante
La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et
induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière
dose dépendantedose dépendante
Cas de l’OTA : Hep G2 /VeroCas de l’OTA : Hep G2 /VeroCas de l’OTA : Hep G2 /VeroCas de l’OTA : Hep G2 /Vero
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120 140 160
OTA concentrations (µM)
Hep G2 cells
Vero cells
Viability (% of control)
OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et
120 µM)120 µM)
OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et
120 µM)120 µM)
OTA et expression des Hsp 70OTA et expression des Hsp 70OTA et expression des Hsp 70OTA et expression des Hsp 70