402 402/

های نوین در علوم زیستییافته (1398) 414الي 402، صفحات 4، شماره ٦جلد

انتشارات دانشگاه خوارزمي

Nova Biologica Reperta 6(4): 402-414 (2020)

Print ISSN: 2423-6330/Online ISSN: 2476-7115

https://nbr.khu.ac.ir; Kharazmi University Press; DOI: 10.29252/nbr.6.4.402

بررسی تنوع و فسفات محلول کنندگی با قابلیت بومی ایران یهاباکتری و شناسایی غربال

RAPDبا استفاده از نشانگر های آنکیژنت

2زادهامین باقی و 2، شهریار شاکری2، محمود ملکی1مهرنوش دانشور

تکنولوژی و علوم پژوهشگاه محیطی، علوم پژوهشکده بیوتکنولوژی، گروه2، کرمان، ایران؛ دانشگاه تحصیالت تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان1

پیشرفته، کرمان، ایران فناوری و تکمیلی صنعتی تحصیالت دانشگاه محیطی، علوم و پیشرفته

m.maleki@kgut.ac.ir مسئول مکاتبات: محمود ملکی،

کننده فسفات ی حلهاباکتریشود. قابل دسترس برای گیاهان تبدیل میدر خاک به سرعت به فرم غیر گیاهی،ترین عناصر غذایی یکی از ضروری ،فسفر. یدهچک

از محیط رایزوسفری گیاهان هاباکتریاین این عنصر غذایی برای گیاهان ایفا کنند. به همین دلیل در این مطالعه فراهم کردن توانند نقش مهمی در نامحلول می

شوری سویه برتر در دما، 9سکی غربال شدند. سپس میزان رشد و میزان حل کنندگی فسفات نامحلول ومختلف با استفاده از محیط کشت اختصاصی جامد پیکو

تنوع ژنتیکی پایان در د. نشناسایی شد 16S rDNAتوالی ژن تجزیه و تحلیلبا حل کننده فسفات نامحلول گیری شدند. بهترین سویهاندازه و اسیدیته مختلف

-سویه قابلیت حل 25سویه جداسازی شده، 57مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد از بین RAPDکننده فسفات نیز با نشانگر های حلبین تمامی سویه

ترین بیش ،رشد متوسطی در تمامی شرایط تنشی اعمال شده داشت که میزانبا این Cke1سویه ،سویه برتر 9کنندگی فسفات نامحلول را داشتند. از بین

16Sژنتیکی ژن تجزیه و تحلیلکننده در همه شرایط مورد آزمایش شناخته شد. سازی را به خود اختصاص داد و به عنوان بهترین سویه حلشاخص محلول

rDNA نیز نشان داد که این سویه متعلق به جنسEnterobacter گیرند میگروه مختلف قرار 6ها در تنوع ژنتیکی نیز نشان داد که تمامی سویه . نتایچاست

سازی فسفات قابلیت خوبی برای محلول Cke1که سویه گروه مجزا قرار گرفتند. با توجه به این 3ها داشتند در ترین میزان تشابه را با سایر سویهسویه که کم 3و

و 2/1، شوری گراددرجه سانتی 35و 30دماهای عنصر فسفر در فراهم کردن تواند پتانسیل خوبی برای ده است، مینامحلول در شرایط مختلف تنشی نشان دا

برای گیاهان زراعی داشته باشد. 8و 6درصد و اسیدیته 8/1

، تنش شورینشانگر مولکولی، اینتروباکتر رایزوسفر گیاهان، رایزوباکتری،. کلیدی هایواژه

Screening and identification of Iranian native phosphate solubilizing

bacteria and investigation of their genetic diversity using RAPD

markers

2Amin Baghizadeh & 2, Shahryar Shakeri2, Mahmood Maleki1Mehrnoush Daneshvar

1Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran; 2Department of Biotechnology, Institute of Science and

High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran

Correspondent author: Mahmood Maleki, m.maleki@kgut.ac.ir

Abstract. Phosphorus, the most essential nutrient for plants, becomes quickly unavailable for the plants in the soil. Phosphate solubilizing bacteria (PSB( can play an important role in providing Phosphorus for plants. In this study, the

PSBs were screened from plant rhizosphere by Pikovskaya method. Then, the growth rate and phosphate solubilizing

ability of 9 superior strains were measured at different temperatures and levels of salinity and pH. The best strain was

identified by 16S rDNA gene sequence analysis. Finally, the genetic diversity of phosphate solubilizing strains were

examined by RAPD markers. Results showed that 25 strains were capable of solubilizing insoluble phosphates among

the 57 isolates studied. Of the nine superior strains, Cke1 had the highest solubilizing index with the average growth rate

under all conditions and was introduced as the best PSB strain identified in the present study. 16S rDNA gene sequence

analysis showed that this strain belonged to the Enterobacter genus. The results of genetic variation showed that all stains

Received 17.03.2017/ Revised 13.11.2018/ Accepted 16.02.2019/ Published 10.01.2020 1398/10/20 :دریافت: 1395/12/27/ اصالح: 1397/08/22/ پذیرش: 1397/11/27/ انتشار

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Daneshvar et al. Identifying Iranian native phosphate solubilizing bacteria های محلول کننده فسفات بومی ایرانشناسایی باکتری و همکاران. دانشور

403 403/

were divided into six groups and three strains that had the lowest similarity with other strains were placed in three

separate groups. Given that Cke1 strain has the ability of solubilizing the insoluble phosphate in different stresses, it can

be a good candidate for providing phosphorus at temperatures of 30 and 35 °C, 1.2% and 1.8% salinity levels and pH

levels of 6 and 8 for the crops.

Keywords. rhizobacteria, plant rhizosphere, Enterobacter, molecular marker, salt stress

مقدمه ترین عنصر غذایی برای گیاهان به بعد از نیتروژن فسفر ضروری

عملکرد گیاهان زراعی رشد و تواند رود که کمبود آن میشمار می

جذب (. فسفر با Perez et al., 2007را به شدت کاهش دهد )

های خاک شدن به سطح ذرات خاک و از طریق واکنش با کاتیون

شودکلسیم از دسترس خارج می نیوم ویویژه آهن، آلومه ب

(Harris et al., 2006خاک .)طور ه های کشاورزی در ایران ب

باال و مقادیر پایین فسفر قابل دسترس pHغالب آهکی، دارای

(. کمبود فسفر هم Alikhani et al., 2007برای گیاه هستند )

Robsonتواند به شدت رشد و عملکرد گیاه را محدود کند )می

et al., 1981 به همین دلیل مقادیر زیادی از کودهای فسفره .)

شوند که اثر به منظور افزایش رشد گیاه به خاک اضافه می

,.Syers et alگذارد )محیط زیست و نیز اقتصاد می نامطلوبی بر

های ( و منبع اصلی آلودگی فلزات سنگین در خاک2008

,.McLaughlin et al., 1996; Bolan et alکشاورزی است )

های (. فسفات نامحلول توسط اسیدهای آلی و آنزیم2003

زی های خاکفسفاتاز تولید شده توسط گیاهان و میکروارگانیزم

تواند به فرم محلول تبدیل شود ساکن در محیط اطراف ریشه می

(Sahu & Jana, 2000.)

های بسیاری از سازی فسفات معدنی یکی از قابلیت محلول

Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) است

های حل کننده فسفات معروف هستندکه به میکروارگانیزم

(Perez et al., 2007 بسیاری از .)PGPRاز طریق رهاسازی ها

های سازی فسفات اسیدهای آلی کالته کننده قادر به محلول

Vesseyنامحلول به روشی بی خطر برای محیط زیست هستند )

et al., 2004 .)

هایی مثل شوری، خشکی عملکرد گیاهان زراعی تحت تاثیر تنش

طور قابل ه و تغییرات دمایی به دلیل نامناسب بودن مواد غذایی ب

Munns 2002; Benlloch-Gonzalez et) شودکم میتوجهی

al., 2005)ها گروهی از میکروارگانیزم هاباکتری. از طرفی رایزو

,.Tripathi et alاند )سازگاری پیدا کرده هستند که با این شرایط

1998; Yildirim et al., 2008) توانند از گیاهان در برابر و می

از طریق فراهم کردن مواد غذایی )مثل شرایط نامساعد محیطی

های حل کننده فسفات و تولید کننده سیدروفور( و یا از باکتری

ثرات هورمون دآمیناز به جهت کاهش ا ACCطریق تولید آنزیم

. (Upadhyay et al., 2009حمایت کنند ) اتیلن

های محلول کننده فسفات PGPRکنون در مطالعات مختلف تا

,.Nautiyal et al., 2000; Aarab et al) طبیعیدر شرایط

;Malboobi et al., 2009( و نیز شرایط تنش شوری )2015

Nautiyal et al., 2000; Johri et al., 1999; Xiang et al.,

;Nautiyal et al., 2000; Johri et al., 1999(، دمایی )2011

Yadav et al., 2015 و نیز در )pH( های مختلفNautiyal

et al., 2000; Johri et al., 1999 ی هاباکتری( از بین کل

اند. این مطالعات نشان موجود در رایزوسفر گیاهان جداسازی شده

سازی فسفات قادر به محلول هاباکتریاز رایزو اند که برخیداده

نامحلول در شرایط مختلف هستند. همچنین مطالعات مختلفی هم

ی حل کننده فسفات را بر روی عملکرد گیاهان هاباکتریتاثیر رایزو

Afzal etاند )زراعی در شرایط مختلف نرمال و تنشی نشان داده

al., 2005; Young et al., 2003).

اال و بهایی مثل شوری، دماهای که در ایران تنشدلیل اینبه

یر نیز اسیدیته خاک به شدت عملکرد گیاهان زراعی را تحت تاث

نیز بر و پر هزینه وقرار داده است، و از طرفی به دلیل زمان

الذکر، یکیهای فوقمشکل بودن تولید گیاهان متحمل به تنش

هتر ان زراعی برای تحمل بها جهت کمک به گیاهاز بهترین شیوه

تلف های مخها با قابلیتاستفاده از رایزوباکتری ،شرایط تنشی

محلول کننده فسفات PGPRی هاباکتریدر این مطالعه است.

هاو بهترین آن مختلف جداسازیتنشی بومی ایران در شرایط

ده ازها نیز با استفاشدند و نیز تنوع ژنتیکی بین آنشناسایی

مورد بررسی قرار گرفت. RAPDنشانگر

هامواد و روش از محیط PGPRهای باکتری عمومی جداسازی و غربال

ریزوسفری گیاه

ی محلول کننده هاباکتریرایزو غربالبه منظور جداسازی و

متری سانتی 10الی 5عمق های خاک از نمونه ،فسفات نامحلول

های قع در استانمحیط رایزوسفری ریشه گیاهان مختلف واو از

در شرایط نمونه خاک مورد نظر .(2)جدول شدتهیه مختلف

طور کامل خرد گردیده و یک ه وسیله هاون چینی به ب استریل

سرم و با استفاده از 10-1- 10-6 یهابرای تهیه رقتگرم آن

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Nova Biologica Reperta 6(4): 402-414 (2020)( 1398) 402-414: 4، شماره 6زیستی، جلد های نوین در علومیافته

404 404/

بر 10-6میکرولیتر از رقت 100کار رفت. سپس ه ب فیزیولوژی

. محیط کشت و گسترده شدتلقیح آگار مغذیروی محیط کشت

ساعت قرار داده 72و به مدت گراددرجه سانتی 30در دمای

صورت تک ه ی مختلف بهاباکتریها، شدند. پس از ظهور کلونی

های تجزیه و تحلیلشدند و برای دوباره کشت برداشت و کلونی

Galledariشدند )نگهداری گراددرجه سانتی 4در دمای بعدی

et al., 2015; Ouzhand et al., 2016.)

کننده فسفات در شرایط نرمال و با ی حلهاباکتریجداسازی

استفاده از محیط کشت اختصاصی پیکووسکی

هاای محلاول کنناده فسافات از محایط برای جداسازی سویه

,Pikovskayaکشت اختصاصای پیکووساکی اساتفاده گردیاد )

10شامل گلاوکز ) مواد تشکیل دهنده این محیط کشت .(1948

گرم بر لیتر4CaHPO (5 ،)گرم بر لیتر(، 15گرم بر لیتر(، آگار )

گرم بار لیتار(، 1گرم بر لیتر(، سولفات منیزیم ) 1کلرید آمونیم )

گرم بار لیتار( و 5/0گرم بر لیتر(، کلرید سدیم ) 1عصاره مخمر )

. پاس از اتاوکالو شادن، استگرم بر لیتر( 002/0سولفات آهن )

ل پیکووسکی زیر هود درون پلیت ریختاه و پاس از بساتن محلو

های جدا شده زیار یهسومیکرولیتر از 5محیط کشت اختصاصی،

ای روی هود و در شرایط کامال استریل برداشته و به صورت نقطه

هاا در پلیت. محیط کشت اختصاصی فسافات کشات داده شادند

دند. سااعت انکوباه شا 48باه مادت گراددرجه سانتی 30 دمای

ها از نظار تشاکیل هالاه شافاف ماورد بررسای قارار سپس کلنی

. شااخص (Nguyen et al., 1992; Nautiyal, 1999گرفتناد )

Nguyen et) دسات آماده محلول سازی از طریق فرمول زیر با

al., 1992; Nautiyal, 1999.)

یمحلول سازشاخص =قطر هاله( +قطر کلونی )/قطر کلونی

(PSI) فسفات

ه از سازی و با استفادبر اساس شاخص محلولرحله بعد و در م

ی با هم یهای باکتریاسویه SAS 9.4و Excelنرم افزارهای

الترباهای با قابلیت حاللیت سویهمقایسه شدند. در این مرحله

قابلیت محلول میزان رشد و نیز انتخاب شدند و برای سنجش

.سی قرار گرفتندسازی فسفات در شرایط مختلف تنشی مورد بررهای باکتریایی برتر در شرایط تنش شوری، بررسی رشد سویه

pHدما و

محیط کشت مایع پیکووسکی از سویه برتر 9برای بررسی رشد

شد. سپس محیط تلقیح شده با باکتری به میکروپلیت استفاده

35 و15 ،5اضافه و هر میکروپلیت به طور جداگانه در دماهای

، 17، 0موالر )های مختلف برحسب میلی، شوریرادگدرجه سانتی

8و 6های pH( و 1026، 821، 513، 308، 205، 136، 102، 58

ها آن میزان جذب نوری . سپسساعت انکوبه شدند 24به مدت

Automated Microplate Reader/ELx808توسط دستگاه

SASو اکسل نرم افزار ها یادداشت شده و توسط. دادهخوانده شد

قرار گرفتند. تجزیه و تحلیلمورد

های بررسی قابلیت محلول سازی فسفات نامحلول توسط سویه

pHباکتریایی برتر در شرایط تنش شوری، دما و

سازی فسفات در حضور دماهای ی تعیین شاخص محلولبرا

های مختلف، pHهای مختلف و ، شوریذکر شده در مرحله قبل

های منتخب تلقیح شدند و ط سویهمحیط جامد پیکوسکی توس

دست ه ها در شرایط ذکر شده بسپس شاخص محلول سازی آن

آمد.

16Sفیلوژنتیکی با استفاده از توالی یابی ژن تجزیه و تحلیل

rDNA DNA گردید پیشین استخراجژنومی بر طبق روش

(Ausubel et al., 2002; Galledari et al., 2015.) 16ژنS

rDNA با استفاده ن سویه محلول کننده فسفات نامحلول بهتری

8F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTCاز پرایمرهای

AG-3′ 1541( وR (5′-AAG GAG GTG ATC CAG

CCG CA-3′( تکثیر یافتند )Galledari et al., 2015;

Ozhand et al., 2016 ای واکنش زنجیره(. سپس محصول

ارسال گردید. پس از Forwardه پایانبرای توالی یابی از پلیمراز

( BLASTبدست آمدن توالی، الگوریتم بالست )

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi و نرم افزار )

MEGA 4.1 ترازی چندگانهتوالی و هم تجزیه و تحلیلبرای

(Multiple alignment) کار رفتند. با انجام عمل ه آن ب

BLASTترین شباهت را به توالی یشهای باکتری که ب، توالی

مورد نظر داشتند استخراج گردیدند و سپس با استفاده از نرم

درخت فیلوژنتیکی با استفاده از روش Mega4.1افزار

Neighbors Joining ( رسم گردیدGalledari et al., 2015;

Ozhand et al., 2016) .

RAPD تجزیه و تحلیل

( بر طبق روش 1)جدول RAPDدر این مطالعه شش پرایمر

( برای بررسی تنوع Williams et al., 1990ویلیامز و همکاران )

کار گرفته شدند. ه ب سویه باکتری حل کننده فسفات 25ژنتیکی

ng/µl 50 ازDNA بهترین سویه حل کننده فسفات ژنومی

از µl 2شامل PCRواکنش .کار رفته به عنوان الگو ب نامحلول

DNA ،2الگو µl از بافرPCR میلی موالر، 2، کلرید منیزیم

dNTP 02/0 1میلی موالر، پرایمر µl 1و U از آنزیمTaq

DNA polymerase میکرولیتر بود. 20. حجم هر واکنش بود

94به این صورت بود دمای دناتوره کننده اولیه PCRبرنامه

چرخه دیگر 35دقیقه بود که با 5گراد به مدت درجه سانتی

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Daneshvar et al. Identifying Iranian native phosphate solubilizing bacteria های محلول کننده فسفات بومی ایرانشناسایی باکتری و همکاران. دانشور

405 405/

-سانتی درجه 94 واسرشتیچرخه دمای 35امه یافت. در این اد

به گرادسانتی درجه 32دقیقه، دمای اتصال 1به مدت گراد

به گرادسانتی درجه 72دقیقه و دمای سنتز 1مدت به مدت

1بر روی ژل آگارز PCRدقیقه بود. سپس محصول 2مدت

آمیزی گردید و با استفاده از اتیدیوم برماید رنگبارگذاری درصد

(Galledari et al., 2015; Naghavi et al., 2010.)

RAPDهای حاصل از نشانگر تجزیه و تحلیل داده

پس از مشخص شدن باندهای چندشکل، به حضور باند نمره

یک و عدم حضور باند نمره صفر داده شد و ماتریس صفر و یک

با وضوح مناسب ایجاد گردید. الزم به ذکر است که تنها باندهای

دهی شدند. ماتریس صفر و یک بدست آمده با استفاده از نمره

ضریب تشابه جاکارد برای تخمین تشابه ژنتیکی بین جفت

کار رفت. در نهایت دندروگرام با استفاده از ه ها برایزوباکتری

UPGMA (Unweighted Pair Group Methodالگوریتم

with Arithmetic Averages افزار ( و نرمNTSYSPC 2.02

(. Galledari et al., 2015; Rohlf 1997ترسیم گردید )

نتایج جداسازی عمومی

های اطرافدر این مرحله تعداد چهل و هشت سویه از خاک

چنینهم و لرستان و همدان تبریز، هایمراتع استان از گندم ریشه

نگور،ا ذرت، شبدر، یونجه، نعناع، گیاهان ریشه اطراف هایخاک از

از کنجد و گلخانه فرنگی،گوجه باغچه، خاک برگ، خاک انار،

.گذاری شدندهرمزگان جداسازی و نام و کرمان هایاستان

کنندگی فسفاتها از لحاظ حلغربالگری سویه

سویه جداسازی شده روی محیط کشت 41با کشت

ا ای که توانایی حل کردن فسفات رسویه 25اختصاصی فسفات،

دندهای شفاف ایجاد کردند، انتخاب شداشتند و اطراف خود هاله

ر ترین قطسویه دارای بیش 9سویه، 25از بین این .(2)جدول

از نظر شاخص Cke1سازی بودند. سویه هاله و شاخص محلول

محلول سازی بهترین سویه دارای توانایی محلول کنندگی

(.3فسفات شناخته شد )جدول

باکتری سویه 9سازی فسفات در شاخص محلولبررسی رشد و

منتخب در دماهای مختلف

درجه 35و 15، 4سویه برتر در سه دمای 9در این مرحله رشد

(. نتایج نشان داد که 1گراد مورد سنجش قرار گرفت )شکل سانتی

گراد به شدت کاهش درجه سانتی 4ها در دمای رشد تمامی سویه

ترین رشد را از خود نشان داد. بیش Wkhیافت. در این دما سویه

ها رشد بهتری نسبت به دمای گراد سویهدرجه سانتی 15در دمای

ترین رشد بیش Warداشتند. در این دما سویه گرادسانتیدرجه 4

ترین رشد را به خود اختصاص داد. در دمای کم Wah2و سویه

ترین و به ترتیب بیش Wah2و Warگراد سویه درجه سانتی 35

ترین رشد را به خود اختصاص داده بودند.کم

نتایج حاصل از شاخص محلول سازی فسفات در دماهای

گراد درجه سانتی 15و 4مختلف نشان داد که در دمای

اما ها قابلیت حل کنندگی فسفات را نداشتند.هیچکدام از سویه

ها قابلیت حل گراد تمامی سویهدرجه سانتی 30در دمای

ه فادها با استنندگی فسفات را داشتند. نتیجه مقایسه میانگینک

( Duncan's multiple range testاز آزمون چند دامنه دانکن )

رین باالت Cke1گراد سویه درجه سانتی 30نشان داد که در دمای

(. 2سازی را به خود اختصاص داده است )شکل شاخص محلول

و Wah2 ،Whaه )گراد سه سویدرجه سانتی 35در دمای

Ake4 قابلیت حل کنندگی فسفات نامحلول را نداشتند و )

های محلول بهترین سویه Ake3و Wkh ،Cke1های سویه

(.2کننده فسفات نامحلول در این دما بودند )شکل

باکتری سویه 9بررسی رشد و شاخص محلول سازی فسفات در

NaClهای مختلف نمک منتخب در غلظت

ف های مختلسویه برتر در غلظت 9حله میزان رشد در این مر

های شوری سنجیده شد. نتایج نشان داد که میزان رشد سویه

Hke6 وWkh و 2/1های در غلظت صفر درصد نسبت به غلظت

به ترتیب Ake3و Cke1درصد افزایش داشته است اما سویه 8/1

-درصد نسبت به غلظت صفر درصد بیش 2/1و 8/1های در غلظت

ر سه ها در ه(. بقیه سویه3اند )شکل ترین میزان رشد را داشته

(. 3سطح شوری تفاوت معناداری را نشان ندادند )شکل

ر سویه برتر د 9سویه از 5آزمایشات نشان داد که تنها

درصد قابلیت حل کنندگی فسفات را 8/1و 2/1 هایغلظت

ش آزمون چند داشتند. نتایج حاصل از مقایسه میانگین به رو

دامنه دانکن نشان داد که بهترین سویه محلول کننده فسفات

است Cke1درصد، سویه 8/1و 2/1نامحلول در هر دو غلظت

(.4)شکل

باکتری سویه 9بررسی رشد و شاخص محلول سازی فسفات در

های مختلفpHمنتخب در

ار رسویه برتر مورد مطالعه ق 9های مختلف میزان رشد pHدر

ترین بیش Wkeو War ،Hke4های سویه 8و pH 4 ،6گرفت. در

(. 5کل ترین میزان رشد را از خود نشان دادند )شکم Ake4و سویه

pH 4ها در آزمایشات این مرحله نشان داد که هیچ کدام از سویه

، pH 6قابلیت محلول کنندگی فسفات نامحلول را نداشتند. در

کنندگی سویه قابلیت محلول ارچه، pH 8 هشت سویه و در

م هها نامحلول را داشتند. نتایج حاصل از مقایسه میانگین فسفات

Ake3و نیز Cke1های سویه 8و pH 6نشان داد که در هر دو

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Nova Biologica Reperta 6(4): 402-414 (2020)( 1398) 402-414: 4، شماره 6زیستی، جلد های نوین در علومیافته

406 40٦/

.RAPDنام و توالی پرایمرهای -1جدول

Table 1. The name and sequence of RAPD primers.

.های حل کننده فسفات نامحلولمشخصات سویه -2جدول

Table 2. Characteristics of insoluble phosphate solubilizing bacteria.

هامشخصات ظاهری کلنی هارنگ کلنی رایزوسفر-محل جمع آوری کد کلنی ردیف

1 Cke1 لعابی -گرد کرم رنگ شبدر -کرمان 2 Wkh لعابی-مضرس کرم رنگ گندم وحشی -خرم آباد 3 Cke2 شفاف -مضرس سفید شبدر -کرمان 4 Wke لعابی -گرد شیری رنگ گندم زراعی -رمانک 5 Ake3 لعابی -گرد شیری مایل به زرد یونجه -کرمان 6 Hke2 لعابی -گرد کرم رنگ خاکبرگ -کرمان 7 Hke5 لعابی -گرد سفید خاکبرگ -کرمان 8 Wta2 لعابی -گرد سفید گندم وحشی -تبریز 9 Hke1 لعابی -مضرس سفید خاکبرگ -کرمان

10 Wah1 لعابی -گرد زرد گندم وحشی -راه 11 War لعابی -گرد کرم مایل به زرد گندم وحشی -اردبیل 12 Wha لعابی -گرد زرد گندم وحشی -همدان 13 Wta1 لعابی -گرد شیری رنگ گندم وحشی -تبریز 14 Ake2 لعابی -گرد کرم مایل به زرد یونجه -کرمان 15 Wah5 لعابی -گرد سفید گندم وحشی -اهر 16 Hke4 شفاف -گرد شیری خاکبرگ -کرمان 17 Hke6 شفاف -گرد سفید خاکبرگ -کرمان 18 Mho لعابی -مضرس کرم ذرت -هرمزگان 19 Wah3 لعابی -گرد سفید گندم وحشی -اهر 20 Hke3 لعابی -مضرس شیری مایل به زرد خاکبرگ -کرمان 21 Ake4 لعابی -گرد شیری مایل به زرد یونجه -کرمان 22 Wah4 لعابی -گرد سفید گندم وحشی -اهر 23 Ake1 لعابی -مضرس سفید یونجه -کرمان 24 Tke لعابی -گرد سفید مایل به کرم گوجه فرنگی -کرمان 25 Wah2 لعابی -مضرس سفید گندم وحشی -اهر

.سویه برتر در شرایط نرمال 9سازی شاخص محلول -3 جدول

Table 3. Solubilizing indices of nine superior strains under normal conditions.

(PSI)سازیشاخص محلولقطر هاله

(mm)

قطر کلنی

(mm)

Strains

3.33 7 3 Cke1

3 4 1.5 Wke 3 5 2.5 War

2.83 7 3 Ake3

2.66 5 3 Hke6 2.66 5 3 Wkh

2.33 5.5 3 Ake4

2.33 4 3 Wha

2.3 4 3 Wah2

رایمرتوالی پ (˚c) (Tmدمای ذوب ) اسم پرایمر

34 5'-TGGACCGGTG-3' OP C-08

32 5'-GACGGATCAG-3' OP C-15

34 5'-GTTGCCAGCC-3' OP C-19 34 5'-TGCCGAGCTG-3' OP A-02

34 5'-CAGCACCCAC-3' OP A-13

32 5'-AATCGGCTG-3' S-24

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Daneshvar et al. Identifying Iranian native phosphate solubilizing bacteria های محلول کننده فسفات بومی ایرانشناسایی باکتری و همکاران. دانشور

407 407/

.گرادسانتی درجه 35و 15، 4سویه انتخابی در دماهای 9میزان رشد -1کل ش

Fig. 1. The growth rate of nine selected strains at 4°C, 15°C and 35°C.

.ای دانکننههای رشد یافته تحت دماهای مختلف با استفاده از آزمون چند داممقایسه میانگین شاخص محلول سازی سویه -2شکل

Fig. 2. Mean comparison of the solubilizing indices of strains grown under different temperatures using Duncan's

multiple range test.

.های مختلفسویه انتخابی در شوری 9میزان رشد -3شکل

Fig. 3. The growth rate of nine selected strains under different salinity levels.

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Nova Biologica Reperta 6(4): 402-414 (2020)( 1398) 402-414: 4، شماره 6زیستی، جلد های نوین در علومیافته

408 408/

.ای دانکنهای مختلف با استفاده از آزمون چند دامنههای رشد یافته تحت شوریمقایسه میانگین شاخص محلول سازی سویه -4شکل

Fig. 4. Mean comparison of the solubilizing indices of strains grown under different salinity levels using Duncan's

multiple range test.

.های مختلفpHسویه انتخابی در 9میزان رشد -5شکل

Fig. 5. The growth rate of nine selected strains at different pH levels.

نداباالترین میزان شاخص محلول سازی را به خود اختصاص داده

متعلق به pH 6 نیز در ین شاخص محلول سازتریکم. (6)شکل

متعلق به سویه pH 8 و در Warو Hke6 ،Wkeهای سویه

Wke وHke6 در کهبود. این نتایج نشان داد که pHمختلف یها

انزیم نیترکم داشتند، را رشد زانیم نیترشیب که ییهاهیسو

اییههیسو عکس بر و بودند دارا را فسفات یکنندگ محلول تیقابل

یکنندگ حل ییتوانا عوض در نداشتند یا مالحظه قابل رشد که

زانیم با رشد زانیم درواقع. دادند نشان خود از یشتریب فسفات

.ندادند نشان یمثبت یهمبستگ فسفات یکنندگ حل

تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی

16S rDNA (565دست آوردن بخشی از توالی ه پس از ب

محلول کننده فسفات در شرایط مختلف، جفت باز( بهترین سویه

انجام گرفت. نتیجه نشان داد که جنس BLASTجستجو در

Enterobacter ترین شباهت را با سویه بیشCKe1 .دارا است

با شباهت باال، در 16S rDNAهای به منظور پیدا کردن توالی

16Sهای یک جستجو صورت گرفت. توالی BLASTداخل

rDNA ک خویشاوند از داخل پایگاه اطالعاتی های نزدیگونه

NCBI استخراج شد، تا دندروگرام فیلوژنتیکی ترسیم و جایگاه

تاکسونومی این سویه مشخص شود. رابطه فیلوژنتیکی سویه

Enterobacter sp. strain Cke1 های خویشاوند با با سایر گونه

16S rDNAتوالی neighbor joiningاستفاده از تجزیه و تحلیل

گزارش شده 16S rDNAمشخص شده است. توالی 7در شکل

در بانک ژن ثبت 505074KXدر این مقاله با شماره دسترسی

شده است.

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Daneshvar et al. Identifying Iranian native phosphate solubilizing bacteria های محلول کننده فسفات بومی ایرانشناسایی باکتری و همکاران. دانشور

409 409/

ای دانکن.های مختلف با استفاده از آزمون چند دامنهpHهای رشد یافته تحت مقایسه میانگین شاخص محلول سازی سویه -6شکل

Fig. 6. Mean comparison of the solubilizing index of strains grown under different pH levels using Duncan's multiple

range test.

.Enterobacter spبرای نشان دادن رابطه Neighbor-Joining تجزیه و تحلیلو 16S rDNAهای ژن درخت فیلوژنتیکی بر پایه توالی -7شکل

Strain Cke1 ها از جنس سایر گونهباEnterobacter..

Fig. 7. Neighbor-Joining tree based on 16S rDNA gene sequences, showing the relationship of Enterobacter sp. strain

Cke1 with closely related members of the Enterobacter genus.

ر اساس نشانگر نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی ب

RAPDمولکولی

ز ا ،کننده فسفاتحل سویه باکتری 25برای بررسی تنوع ژنتیکی

استفاده شد. تعداد کل RAPDتصادفی نشانگر آغازگر 5

80چندشکل باندهای و تعداد کل 119باندهای مشاهده شده

ترتیب ترین تعداد باند تشکیل شده بهترین و بیش. کمندبودعدد

با OPC-02آغازگر و باند 16با OPA-08 مربوط به آغازگر

(.4)جدول بودباند 33تعداد

ده کنن های حلنتایج نشان داد که دامنه تشابه ژنتیکی بین سویه

ترین تشابه بود. بین چندین سویه کم 69/0تا 0فسفات بین

های و سویه Cke1ان مثال بین وجود داشت به عنو ژنتیکی

Wah3، Ake2 ،Wah2 ،Wkh وHke6 ترین میزان تشابه کم

ه ترین تشابه ژنتیکی هم بین دو سویمشاهده شد. بیش ژنتیکی

Wta2 وWkh وجود داشت. الزم به ذکر است که سویهCKe1 ،

ترداشت. تجزیه کالس WKeترین تشابه ژنتیکی را با سویه بیش

اد. گروه قرار د 6ای حل کننده فسفات را در هنیز تمامی سویه

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Nova Biologica Reperta 6(4): 402-414 (2020)( 1398) 402-414: 4، شماره 6زیستی، جلد های نوین در علومیافته

410 410/

.تصادفی آغازگرتعداد باندهای تکثیر شده توسط هر -4جدول

Table 4. The number of amplified bands using RAPD primers.

تعداد کل باندها توالی پرایمرها پرایمرهای تصادفی ردیفتعداد باندهای

چند شکل

تعداد باندهای

یک شکل

1 OP C-08 5َ-TGGACCGGTG-3َ 16 11 5

2 OP C-15 5َ-GACGGATCAG-3َ 23 16 7

3 OP C-19 5َ-GTTGCCAGCC-3َ 26 17 9

4 OP C-02 5َ-ACTTCGCCAC-3َ 33 18 15

5 OP A-13 5َ-CAGCACCCAC-3َ 21 18 3

Total 119 80 39

.است حاصل شده UPGMAسویه محلول کننده فسفات که توسط ضریب تشابه جاکارد و الگوریتم 25دندروگرام نشان دهنده روابط بین -8شکل

Fig. 8. Dendrogram showing the relationships among 25 phosphate solubilizing bacteria, obtained by Jaccard index and

UPGMA algorithm.

-)کرمان Cke2رایزوسفر شبدر(، -)کرمان Cke1های سویه

به رایزوسفر گندم وحشی( هر کدام-)اهر Wah1رایزوسفر شبدر( و

سفر رایزو-)اهر Wah3سویه 5گروه قرار گرفتند. 3صورت مجزا در

رایزوسفر -)همدان Whaخاکبرگ(، -)کرمان Hke4گندم وحشی(،

Wah2رایزوسفر گندم وحشی( و -)اردبیل Warگندم وحشی(،

ابقیی( در گروه چهارم قرار گرفتند و مرایزوسفر گندم وحش-)اهر

(. 8ها نیز در گروه پنجم جای گرفتند )شکل سویه

بحث در خاک فسفر با جذب شدن به سطح ذرات خاک و از طریق

نیوم و کلسیم از یویژه آهن، آلومه های خاک بواکنش با کاتیون

سازی محلول .(Harris et al., 2006شود )دسترس خارج می

ها است که PGPRهای بسیاری از ات معدنی یکی از قابلیتفسف

Perez) های حل کننده فسفات معروف هستندبه میکروارگانیزم

et al., 2007 بسیاری از .)PGPR ها از طریق رهاسازی

سازی قادر به محلولها و آنزیماسیدهای آلی کالته کننده

(.Vessey et al., 2004های نامحلول هستند )فسفات

ی حل کننده فسفات هاباکتریازجمله PGPRsی هاباکتری

Malboobiتوانند نقش مهمی در کشاورزی پایدار ایفا کنند )می

et al., 2009های کشاورزی در سراسر (. در حال حاضر زمین

های محیطی مثل دماهای باال، شوری و دنیا در معرض انواع تنش

هایی که در فی سویهخاک هستند. به همین دلیل معر pHنیز

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Daneshvar et al. Identifying Iranian native phosphate solubilizing bacteria های محلول کننده فسفات بومی ایرانشناسایی باکتری و همکاران. دانشور

411 411/

کنندگی های مختلف توانایی حفظ قابلیت محلولحضور تنش

ای برخوردار است. از اهمیت ویژه ،فسفات نامحلول را دارا هستند

های محلول کننده به همین دلیل در این مطالعه بهترین سویه

یعنی طبیعیفسفات در شرایط مختلف غربال شدند. در شرایط

با توانایی سویه و محیط کشت پایه، گرادسانتی درجه 30دمای

Phosphate Solubilizing) باالی محلول کنندگی فسفات

(PS)) ،Cke1 گراد رشد همه درجه سانتی 4بود. در دمای

را نداشتند. در دمای PSها پایین بود و هیچ کدام توانایی سویه

Warها مثل سویه گراد میزان رشد برخی سویهدرجه سانتی 15

را نداشتند. اما در دمای PSال بود اما باز هم هیچکدام توانایی با

-بیش Hke6و Warهای که سویهگراد با ایندرجه سانتی 35

و Cke1 ،Wkhهای ترین میزان رشد را داشتند، اما سویه

Ake3 ترین میزان تری را داشتند، بیشکه میزان رشد نسبتا کم

PS و 2/1، 0های در شوریرا به خود اختصاص دادند. همچنین

ها رشد نسبت به غالب سویه Cke1که سویه درصد، با این 8/1

آن باالتر از مابقی PSتری را نشان داد با این حال میزان کم

ها رشد مناسبی که برخی سویهبا این pH 4 ها بود. درسویه

، با pH 6 را نداشتند. اما در PSداشتند اما هیچ کدام قابلیت

رشد خوبی داشتند، Wkeو نیز War ،Hke6های یهکه سواین

8 را بخود اختصاص داد. در PSباالترین مقدار Cke1اما سویه

pH های که میزان رشد سویهنیز با اینCke1 وAke3 نسبت به

را به خود PSترین مقدار تر بود اما باز هم بیشها کمغالب سویه

رابطه ممکن است اد که اختصاص دادند. نتایج این مطالعه نشان د

. در حالینداشته باشدوجود PS قابلیت مثبتی بین میزان رشد و

که با افزایش (Malboobi et al., 2009ه شده )که نشان داد

یابد. بر اساس مطالعه ما نیز افزایش می PSIرشد میزان قابلیت

به عنوان بهترین سویه Enterobacter sp. strain Cke1سویه

-فسفات در شرایط مختلف محیطی معرفی شد. سویهحل کننده

شده است های محلول کننده فسفات نامحلول غربال

(Malboobi et al., 2009)ها رشد و نیز قابلیت محلول . آن

سازی فسفات نامحلول سه سویه برتر محلول کننده فسفات را در

را بررسی کردند و نتیجه گراد سانتیدرجه 42و 35، 25دماها

تند که رشد و قابلیت محلول سازی فسفات نامحلول در دمای گرف

طور کلی رشد و ه باالترین بود. همچنین بگراد سانتیدرجه 25

کرد. نتایج کاهش پیداسازی در دماهای باالتر نیز قابلیت محلول

ها نشان داد که رابطه نزدیکی بین میزان رشد و نیز قابلیت آن

را بر روی pHاثر دما، شوری و سازی فسفات وجود دارد. محلول

دو سویه محلول کننده فسفات جداسازی شده از رایزوسفر گوجه

سه. از بین (Banerjee et al., 2010شده است ) بررسیفرنگی

ها در دمای ، یکی از سویهگرادسانتی درجه 50و 45، 37دمای

ترین قابلیت بیش گرادسانتی درجه 45و دیگری در دمای 37

PS درصد 5/2داشتند. هر دو سویه برتر در شوری با غلظت را

داشتند. همچنین از بین PS را در میزانتری توانایی بیش

pH 9 ها دریکی از سویه 11، 10، 9، 8های pH و دیگری در

10 pH ترین قابلیت بیشPS را از خود نشان دادند. از کارایی

سفات های محلول کننده فمحلول سازی برای غربال سویه

. بهترین سویه (Hu et al., 2010شده است )نامحلول استفاده

ساعت 48بعد از 4227/3 دارای کارایی محلول سازی به میزان

Pantoeaها میزان رشد سویه رشد در محیط پیکووسکی بود. آن

stewartii subsp. stewartii g6 در دماهای مختلف بررسی

درجه 30و 25دماها کردند و به این نتیجه رسیدند که در

ترین میزان رشد را دارا هستند. در این مطالعه بیش گرادسانتی

و های متفاوت نیز بررسی شد میزان رشد سویه مذکور در شوری

درصد رخ 10و 5ترین رشد در شوری نتایج نشان داد که بیش

های pHترین رشد را در داده است. همچنین سویه مذکور بیش

ان داد. با استفاده از شاخص محلول سازی اقدام از خود نش 8و 7

Muleta etشده است )های حل کننده فسفات به غربال سویه

al., 2013) ها سازی بهترین سویه آنکه میزان شاخص محلول

سویه 47بود. قابلیت محلول کنندگی فسفات نامحلول 82/5

کل سویه از 30. نتایج نشان داد که شده استباکتریایی بررسی

,.Laslo et alقابلیت حل کنندگی فسفات را دارند ) هاسویه

2012 .)

نشان داد که 16S rDNA توالی ژن تجزیه و تحلیلنتایج

بهترین سویه حل کننده فسفات در این مطالعه متعلق به جنس

Enterobacter .ی هاباکتریتا به حال محققین زیادی بود

کننده ی حلهاکتریبارا به عنوان Enterobacterجنس

ها را بر روی رشد گیاهان اند و اثر آنشناسایی کرده فسفات

دونمونه خاک رایزوسفری در ونزوئال، 100بررسی کردند. از

Xanthomonasو Enterobacter cloacaeهای باکتری به نام

maltophilia ی حل کننده فسفات غربال هاباکتریرا به عنوان

داری را بر روی رشد گیاه یند که تاثیر معنکردند و مشاهده کرد

,Martinez & Martinez) گذارندقند نسبت به شاهد میچغندر

. چند صد کلونی باکتریایی بر روی محیط کشت (2007

اختصاصی مایع پیکووسکی از نظر قابلیت محلول سازی فسفات

باکتری با باالترین قابلیت محلول سازی 13نامحلول بررسی و

های جداسازی شده متعلق به . بهترین سویهشده استی جداساز

بودند Klebsiellaو Enterobacter ،Pantoeaهای جنس

(Chung et al., 2005) .کننده فسفات نامحلول ی حلهاباکتری

و بهترین شدهجداسازی Areca catechuاز رایزوسفر گیاه

، Enterobacter cloacae که شاملکننده های حلسویه

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Nova Biologica Reperta 6(4): 402-414 (2020)( 1398) 402-414: 4، شماره 6زیستی، جلد های نوین در علومیافته

412 412/

Escherichia coli وAcinetobacter pittii شناسایی بودند ،

باکتری حل کننده فسفات 41. (Liu et al., 2014شدند )

تجزیه و . شدندنامحلول از محیط رایزوسفری عدس جداسازی

نشان داد که برخی از بهترین 16S rDNAتوالی ژن تحلیل

Midekssa et) بودند Enterobacterها، متعلق به جنس سویه

al., 2015).

ژنتیکی حاصل از نتایج این تحقیق نشان داد که میزان تشابه

ها صفر بود. این امر ممکن است بین برخی سویه RAPDنشانگر

های ها به احتمال زیاد از جنسدلیل باشد که آن سویهاین به

های تولید کننده . تنوع ژنتیکی بین سویهبوده باشندمختلفی

ها که بین برخی سویه ه شدی و نشان دادبررس IAAهورمون

. در (Galledari et al., 2015) هیچ تشابه ژنتیکی وجود نداشت

ها بر اساس قادر به جداسازی سویه RAPDاین مطالعه نشانگر

طوریه ها در محلول سازی فسفات نامحلول نبودند، بقابلیت آن

تقسیم های مختلفسویه برتر در این مطالعه در بین گروه 9که

ی تولید کننده سیدروفورها با هاباکتریتنوع ژنتیکی اند. شده

Amplified Ribosomal DNA Restrictionاستفاده از روش

Analysis (ARDRA) شده است )بررسیTian et al.,

تا حدودی ARDRA. در این مطالعه با استفاده از روش (2009

و در گروههای جنس مختلف را از هم تفکیک کنند 5توانستند

مجزا قرار دهند ولی با این حال این روش قادر به جداسازی

ی فاقد توانایی تولید سیدروفور در یک گروه مجزا هاباکتریرایزو

ی تولید کننده و تخریب کننده هاباکتریژنتیکی تنوعنشدند.

N-acyl homoserine lactones با استفاده از روشAmplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

(ARDRA) بررسی( شده استPicard et al., 2000) در این .

های مختلف از هم جنس ARDRAمطالعه با استفاده از روش

یکی از دالیلی های مجزا قرار نگرفتند.تفکیک نشدند و در گروه

شاید به این دلیل اند،گرفتهکه محققین مختلف نتایج متفاوتی

پرایمرهای مختلفی برای تعیین تنوع از ،است که هر کدام

اند.ژنتیکی استفاده کرده

به صورت قطعی در مطالعه ما نشان داده شد که افزایش رشد

ها در دمای که سویهنیست. با این PSI به معنی افزایش قابلیت

کدام از رشد خوبی داشتند اما هیچ pH 4گراد و درجه سانتی 15

تند. همچنین نتایج نشان داد که را نداش PSIها قابلیت سویه

که میزان رشد با این Enterobacter sp. strain Cke1سویه

در محیط پیکووسکی و تحت شرایط مختلف دمایی، تریکم

ها داشت اما به طور جالبی نسبت به غالب سویه pHشوری و

ها در تمامی شرایط باالتری نسبت به سایر سویه PSتوانایی

تواند این سویه می عه از خود نشان داد.محیطی مورد مطال

پتانسیل خوبی برای فراهم کردن فسفات نامحلول برای گیاهان

زراعی در شرایط تنشی داشته باشد.

سپاسگزاری نویسندگان از دانشگاه تحصیالت تکمیلی صنعتی و فناوری

نند.کپیشرفته کرمان برای حمایت مالی از این پژوهش قدردانی می

REFERENCES Aarab, S., Ollero, F.J., Megías, M., Laglaoui, A., Bakkali,

M. and Arakrak, A. 2015. Isolation and screening of

bacteria from rhizospheric soils of rice fields in

Northwestern Morocco for different plant growth

promotion (PGP) activities: An in vitro study. ‒

IJCMAS 4: 260-269.

Afzal, A., M. Ashraf, A. Saeed, Asad and Farooq, M. 2005.

Effect of phosphate solubilizing microorganisms on phos-

phorus uptake, yield and yield traits of wheat (Triticum

aestivum L.) in rainfed area. ‒ IJAB 7: 1560-8530.

Alikhani, H.A., Saleh-Rastin, N. and Antoun, H. 2007.

Phosphate solubilization activity of rhizobia native to

Iranian soils. In First international Meeting on

microbial phosphate solubilization. – Springer

Netherlands, pp: 35-41.

Ausubel, F.M. ed. 2002. Short protocols in molecular

biology: a compendium of methods from current

protocols in molecular biology. Wiley, 1512 pp. Banerjee, S., Palit, R., Sengupta, C. and Standing, D.

2010. Stress induced phosphate solubilization by

Arthrobacter sp. and Bacillus sp. isolated from tomato

rhizosphere. ‒ AJCS 4: 378-383. Benlloch-González, M., Fournier, J.M., Ramos, J. and

Benlloch, M. 2005. Strategies underlying salt

tolerance in halophytes are present in Cynara

cardunculus. ‒ Plant Sci. 168: 653-659.

Bolan, N.S., Adriano, D.C. and Naidu, R. 2003. Role of

phosphorus in (im) mobilization and bioavailability of

heavy metals in the soil-plant system. ‒ Rev. Environ.

Contam. Toxicol. 177: 1- 44. Chung, H., Park, M., Madhaiyan, M., Seshadri, S., Song,

J., Cho, H. and Sa, T. 2005. Isolation and

characterization of phosphate solubilizing bacteria

from the rhizosphere of crop plants of Korea. ‒ Soil.

Biol. Biochem. 37: 1970-1974. Galledari, N., Maleki, M., Shakeri, S. and Baghizadeh, A.

2015. Investigation of genetic diversity and molecular

identification of IAA producing bacteria using RAPD

marker and 16S rDNA sequence analysis. ‒ G3M 13:

4054-4061.

Harris, J.N., New, P.B. and Martin, P.M. 2006.

Laboratory tests can predict beneficial effects of

phosphate-solubilising bacteria on plants. ‒ Soil.

Biol. Biochem. 38: 1521-1526. Hu, X.J., Li, Z.J., Cao, Y.C., Zhang, J., Gong, Y.X. and

Yang, Y.F. 2010. Isolation and identification of a

phosphate-solubilizing bacterium Pantoea stewartii

subsp. stewartii g6, and effects of temperature,

salinity, and pH on its growth under indoor culture

conditions. ‒ Aquac. Int. 18: 1079-1091.

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Daneshvar et al. Identifying Iranian native phosphate solubilizing bacteria های محلول کننده فسفات بومی ایرانشناسایی باکتری و همکاران. دانشور

413 413/

Johri, J.K., Surange, S. and Nautiyal, C.S. 1999. Occurrence

of salt, pH, and temperature-tolerant, phosphate-

solubilizing bacteria in alkaline soils. ‒ Curr. Microbiol.

39: 89-93. Laslo, É., György, É., Mara, G., Tamás, É., Ábrahám, B.

and Lányi, S. 2012. Screening of plant growth

promoting rhizobacteria as potential microbial

inoculants. ‒ Crop Prot. 40: 43-48. Liu, F.P., Liu, H.Q., Zhou, H.L., Dong, Z.G., Bai, X.H.,

Bai, P. and Qiao, J.J. 2014. Isolation and

characterization of phosphate-solubilizing bacteria

from betel nut (Areca catechu) and their effects on

plant growth and phosphorus mobilization in tropical

soils. ‒ Biol. Fertil. Soils 50: 927-937. Malboobi, M.A., Owlia, P., Behbahani, M., Sarokhani, E.,

Moradi, S., Yakhchali, B., Deljou, A. and Heravi, K.M. 2009. Solubilization of organic and inorganic

phosphates by three highly efficient soil bacterial

isolates. ‒ World J. Microbiol. Biotechnol. 25: 1471-

1477.

Martinez, M. and Martinez, A. 2007. Effects of

phosphate-solubilizing bacteria during the rooting

period of sugar cane (Saccharum officinarum),

Venezuela 51–71 variety, on the grower’s oasis

substrate. In First International Meeting on Microbial

Phosphate Solubilization. ‒ Springer, Netherlands,

pp: 317-323. McLaughlin, M.J., Tiller, K.G., Naidu, R. and Stevens,

D.P. 1996. Review: the behaviour and environmental

impact of contaminants in fertilizers. ‒ Soil Res. 34:

1-54. Midekssa, M.J., Loscher, C.R., Schmitz, R.A. and Assefa,

F. 2015. Characterization of phosphate solubilizing

rhizobacteria isolated from lentil growing areas of

Ethiopia. ‒ Afr. J. Microbiol. Res. 9: 1637-1648. Muleta, D., Assefa, F., Börjesson, E. and Granhall, U.

2013. Phosphate-solubilising rhizobacteria associated

with Coffea arabica L. in natural coffee forests of

southwestern Ethiopia. ‒ J. Saudi Society Agric. Sci.

12: 73-84.

Munns, R. 2002. Comparative physiology of salt and

water stress. ‒ Plant Cell Environ. 25: 239-250. Naghavi, M.R., Malaki, M., Alizadeh, H., Pirseiedi, M.

and Mardi, M. 2010. An assessment of genetic

diversity in wild diploid wheat Triticum boeoticum

from west of Iran using RAPD, AFLP and SSR

markers. ‒ JAST 11: 585-598.

Nautiyal, C.S. 1999. An efficient microbiological growth

medium for screening phosphate solubilizing

microorganisms. ‒ Fems. Microbiol. Lett. 170: 265-

270. Nautiyal, C.S., Bhadauria, S., Kumar, P., Lal, H.,

Mondal, R. and Verma, D. 2000. Stress induced

phosphate solubilization in bacteria isolated from

alkaline soils. ‒ Fems Microbiol Lett. 182: 291-296.

Nguyen, C., Yan, W., Tacon, F. and Lapeyrie, F. 1992.

Genetic variability of phosphate solubilizing activity

by monocaryotic and dicaryotic mycelia of the

ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor (Maire) PD

Orton. ‒ Plant Soil 143: 193-199. Perez, E., Sulbaran, M., Ball, M.M. and Yarzábal, L.A.

2007. Isolation and characterization of mineral

phosphate-solubilizing bacteria naturally colonizing a

limonitic crust in the south-eastern Venezuelan

region. ‒ Soil Biol. Biochem. 39: 2905-2914. Picard, C., Di Cello, F., Ventura, M., Fani, R. and

Guckert, A. 2000. Frequency and biodiversity of 2, 4-

diacetylphloroglucinol-producing bacteria isolated

from the maize rhizosphere at different stages of plant

growth. ‒ Appl. Environ. Microbiol. 66: 948-955.

Pikovskaya, R.I. 1948. Mobilization of phosphorus in soil

in connection with vital activity of some microbial

species. ‒ Mikrobiologiya 17: 362- 370. Ouzhand, B., Maleki, M., Soltani, M. and Shakeri, S.

2016. Molecular identification of the Iranian native

ACC deaminase producing rhizobacteria using 16S

rDNA sequence analysis. ‒ G3M 14: 4242-4249.

Robson, A.D., O'hara, G.W. and Abbott, L.K. 1981.

Involvement of phosphorus in nitrogen fixation by

subterranean clover (Trifolium subterraneum L.). ‒

Funct. Plant Biol. 8: 427-436.

Rohlf, F.J. 1997. NTSYSpc numerical taxonomy and

multivariate analysis system, version 2.00. Exeter

Software, Setauket, New York, 31 pp.

Sahu, S.N. and Jana, B.B. 2000. Enhancement of the

fertilizer value of rock phosphate engineered through

phosphate-solubilizing bacteria. ‒ Ecol. Eng. 15: 27-

39.

Syers, J.K., Johnston, A.E. and Curtin, D. 2008.

Efficiency of soil and fertilizer phosphorus use. FAO

Fertilizer and Plant Nutrition Bulletin, 18.

Tian, F., Ding, Y., Zhu, H., Yao, L. and Du, B. 2009.

Genetic diversity of siderophore-producing bacteria of

tobacco rhizosphere. ‒ Braz. J. Microbiol. 40: 276-

284.

Tripathi, A.K., Mishra, B.M. and Tripathi, P. 1998.

Salinity stress responses in the plant growth

promoting rhizobacteria, Azospirillum spp.‒ J.

Bioscience. 23: 463-471.

Vessey, J.K., K. Pawlowski and Bergman, B. 2004. Root-

based N2- fixing symbioses: Legumes, actinorhizal

plants, Parasponia sp., and cycads. ‒ Plant Soil 266:

205-230.

Upadhyay, S.K., Singh, D.P. and Saikia, R. 2009. Genetic

diversity of plant growth promoting rhizobacteria

isolated from rhizospheric soil of wheat under saline

condition. ‒ Curr. Microbiol. 59: 489-496.

Williams, J.G., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski,

J.A. and Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms

amplified by arbitrary primers are useful as genetic

markers. ‒ Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535. Xiang, W.L., Liang, H.Z., Liu, S., Luo, F., Tang, J., Li,

M.Y. and Che, Z.M. 2011. Isolation and performance

evaluation of halotolerant phosphate solubilizing

bacteria from the rhizospheric soils of historic

Dagong Brine Well in China. ‒ World J. Microb.

Biot. 27: 2629-2637. Yadav, H., Gothwal, R.K., Solanki, P.S., Nehra, S., Sinha-

Roy, S. and Ghosh, P. 2015. Isolation and

characterization of thermo-tolerant phosphate-

solubilizing bacteria from a phosphate mine and their

Rock Phosphate Solubilizing Abilities. ‒ Geomicrobiol.

J. 32: 475-481.

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]

Nova Biologica Reperta 6(4): 402-414 (2020)( 1398) 402-414: 4، شماره 6زیستی، جلد های نوین در علومیافته

414 414/

Yildirim, E.R.T.A.N., Turan, M.E.T.I.N. and Donmez,

M.F. 2008. Mitigation of salt stress in radish

(Raphanus sativus L.) by plant growth promoting

rhizobacteria. ‒ Roumanian Biotechnol. Lett. 13:

3933-3943. Young, C.C., F.T. Shen, W.A. Lai, M.H. Hung, W.S. Huang,

A.B. Arun and Lu, H.L. 2003. Biochemical and

molecular characterization of phosphate solubilizing

bacteria from Taiwan soil. ‒ Proceeding of 2nd

International Symposium on Phosphorus Dynamics in

the Soil-Plant Continuum. Perth, Australia, pp: 44-45.

*****

How to cite this article:

Daneshvar, M., Maleki, M., Shakeri, Sh. and Baghizadeh, A. 2020. Screening and identifying of Iranian native

phosphate solubilizing bacteria and investigation of their genetic diversity using RAPD markers. – Nova Biol. Reperta

6: 402-414. (In Persian)

استفاده با هاآن یکیژنت تنوع یبررس و رانیا یبوم فسفات کننده محلول یهایباکتر ییشناسا و غربال .1398 .ا، زادهیباق و ش. ،یشاکرم.، ،یملک ، م.،دانشور

.414-402: 6 های نوین در علوم زیستییافته –. RAPD نشانگر از

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

16:

06 +

0330

on

Thu

rsda

y Ja

nuar

y 21

st 2

021

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.4

.402

]