Post on 24-Jul-2015
Ácidos nucleicos:UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIAINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDEImunodiagnóstico - 2014.2
I
Imunodiagnóstico contraInfecções Virais
Discente: Guilherme da Rocha Peres
Introdução★ Vírus (do latim virus, "veneno" ou "toxina")
são pequenos agentes infecciosos (20-300 nm de diâmetro) que apresentam genoma constituído de uma ou várias moléculas de ácido nucleico (DNA ou RNA), as quais possuem a forma de fita simples ou dupla.
★ Parasita intra celular obrigatório.
Introdução
imagem: http://blogdebiologiainteracaoufpe.blogspot.com.br/2012/05/virus-caracteristicas-gerais-os-virus-n.html
Duas estratégias básicas★ Detecção do Agente
(vírus ou seus efeitos)
★ Detecção da resposta do corpo(especialmente anticorpos)
Em busca dos vírus► Sinais clínicos (visíveis, clínicos, sintomáticos)
► Detecção do vírus, antígenos ou genomas
● Isolamento (+ detecção imunológica)● Quantificação (contagem de placas, DICC50)● PCR● Hemaglutinação (HA)● ELISA● Deteção imunológica (IH ou IF)● Microscopia eletrônica
Cultivo e Identificação● Inoculação em animais● Inoculação em ovos embrionados● Cultivos celulares● Métodos imunoquímicos● Microscopia eletrônica
Imagem: http://www.scielo.oces.mctes.pt/scielo.php?pid=S0873-21592009000400007&script=sci_arttext
Cultivos Celulares
● cultivos primários (células diplóides)● linhas celulares (diplóide, 40 passagens )● células de linhagem (passagens indefinidas)
● Microscopia Eletrônica● Marcação com Imunofluoresência● Coração com Hematoxilina-eosina (HE)● Análise do ECP
Cultivos Celulares
ref: http://www.scielo.oces.mctes.pt/scielo.php?pid=S0873-21592009000400007&script=sci_arttext
Cultivos de vírus in vitro● Vidro● Plástico● Garrafas Fechadas (Ou Abertas (CO2))● Garrafas Estacionárias Ou Rolantes● Tubos de vidro ou plástico● Tubos com lamínulas (tubos de Leighton)● Placas de microtécnica 6, 12, 24, 96 orifícios
Efeito Citopático
É o dano que o vírus causa à célula !
● lise● arredondamento● vacuolização● formação de sincícios● inclusões● picnose● apoptose
Efeitos citopáticos virais
Efeitos citopáticos virais
ref: http://pt.slideshare.net/livreinatural/c-u-l-t-i-v-o-e-i-s-o-l-a-m-e-n-t-o
Efeitos virais
ref: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-09352002000600002&script=sci_arttext
Quantificação viral - pfu
ref: http://jvi.asm.org/content/85/21/11183/F8.expansion.html
Detecção com HA
ref: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm
Detecção com HA
ref: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm
Detecção com ELISA
ref: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/ELISA
ELISA: With antigen capture ELISA, the wells are coated with antibody to the virus. The sample containing virus (1) is addedand, after washing several times, enzyme conjugated to an antibody to the virus is added (2). Finally, after a further cycle ofwashing, the enzyme's substrate (3) is added. A colored product is formed if the viral antigen is present in the sample (4). FromHart and Shears, 1997.
Detecção com ELISA
ref: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/ELISA
Detecção Imunológica
Imunohistoquímica (IPX) Imunofluorescência
Antigenos de Herpes Virusem células endoteliais
Herpes Virus em cultivo celular
Imunoperoxidase (IPX)
● Material infectado (células ou tecidos)+ soro específico (ex: soro humano)+ conjugado anti-IgG (ex. anti-IgG humana conjugado à peroxidase)+ substrato apropriado (ex. carbazol) _______________________________________ = reação colorida
Imunoperoxidase (IPX)
Imagens: ref: CIELO
Imunofluorescência Direta
Anticorpo marcado sobre material infectado
● material infectado (suspeito)+ anticorpo específico marcado com FITC+ luz UV __________= reação colorida
Imunofluorescência Indireta
Material infectado (células ou tecidos)
+ soro específico (ex: soro humano)+ conjugado anti-IgG específico (ex. anti-IgG humana/FITC)+ luz UV ___________________________________ = reação colorida
PCR
Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna
Principais origens de DNA/RNA para PCR
Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna
● Nódulos linfáticos: HIV● Swab cervical: HIV, HPV● Sangue total: HIV, CMV● Plasma, soro: HIV, HTLV, HCV, HBV● Liquido cefalorraquídeo: enterovirus● Esputo, saliva, aspirado naso-faríngeo:● VRS, Influenza● Materia fecal: Rota
PCR
Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna
Gel de PCR (influenza) Gel de RNA (Rotavírus) (corante?)
RFLP\Fragmentação de DNA
Imagem: http://forensicsciencenew.blogspot.com.br/2014/03/the-use-of-dna-typing-in-forensic.html
Detecção de Anticorpos (2)► Quando os sinais clínicos já passaram► Quando houve algum contato com o vírus► Detecção de anticorpos:► (usualmente soro ou LCR)
● Soro-neutralização● Imunodifusão● Inibição da hemaglutinação (IH)● Hemaglutinação passiva● Imunoperoxidase para anticorpos● Imunofluorescência indireta● ELISAs (diversos)● Western blot
Detecção de Anticorpos
Sorologia/Neutralização
► Diluir o soro seriadamente: ex:1/2 1/4 1/8 1/16……….1/512
● Adicionar volume igual de vírus (100 DICC50) ● Incubar a 37oC● Colocar mistura sobre células● Última diluição que evita multiplicação viral é o título
Imunodifusão
Western Blot para Ag
Imunofluorescência
Indireta para a detecção de anticorpos:Material infectado conhecido (células ou tecidos)
+ soro suspeito (ex: soro humano)+ conjugado anti-IgG específico
(ex. anti-IgG humana conjugado à fluoresceína)+ luz UV
____________________________________ = reação colorida
Imunofluorescência
Herpes Vírus
ELISA (direta/indireta/bloqueio)
1a Geração - Indireto (IgG)Falsos positivos (artrite reumatoide)2a Geração - Indireto (IgG)Melhora espec. | Detecta HIV 1 e 23a Geração - Sandwich - (IgG / IgM)Boa sensibilidade, baixa títulação4a Geração - Proteínas recombinantesAlta sensibilidade (HIV)
Imunocromatografia
*** - HIV
Limitações da Sorologia
►Detecta exposição, não quando ela ocorreu !!!►Para correlação com a doença:
● Soros pareados● IgM● Líquido céfalo raquidiano
Conclusões e Discussão● Os vírus constituem uma ameaça a saúde humana,
animal e vegetal há séculos, milênios.
● A erradicação de algumas doenças é fruto do desenvolvimento científico humano frente a determinados vírus. (e.g. Póliomielite)
● Pesquisas constantes trazem um avanço no entendimento, diagnóstico e tratamento de infecções virais. (e.g. vacinas de DNA viral / HPV)
Conclusões e Discussão● A mutação gênica é um desafio, tanto em infecções
ortólogas quanto parálogas. Confere resistência.
● A ligação de alguns vírus com o câncer, pode ajudar no controle de cânceres como garganta, útero, etc.
● A Medicina clínica prática é defasada frente ao desenvolvimento científico. Precisa de celeração.
FIM
Perguntas ?
:-)
FIM
Obrigado
:-)
ReferênciasLEHNINGER, A. L. Princípios de bioquímica. São Paulo: Savier, 2005.
ALBERTS, Bruce; Alexander Johnson, Julian Lewis, Kazuo, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walters. Molecular Biology of the Cell; Fourth Edition. Nova Iorque e Londres: Garland Science, 2002. ISBN 0-8153-3218-1.
Watson J, Crick F. (1953). "Molecular structure of nucleic acids; a structure for
deoxyribose nucleic acid" (PDF). Nature 171 (4356): 737–8. PMID 13054692.
Gregory S, et al.. (2006). "The DNA sequence and biological annotation of human chromosome 1".Nature 441 (7091): 315–21.
Referênciashttp://www.ufrgs.br/labvir/material/aulat8.pdf (acesso 08/12/2014)
http://pt.slideshare.net/livreinatural/c-u-l-t-i-v-o-e-i-s-o-l-a-m-e-n-t-o (acesso 06/12/2014)
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-09352002000600002&script=sci_arttext (acesso 05/12/2014)
http://jvi.asm.org/content/85/21/11183/F8.expansion.html (acesso 08/12/2014)
http://slideplayer.com.br/slide/294425/ (acesso 01/12/2014)
http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm (acesso 08/12/2014)
Referênciashttp://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna (acesso 08/12/2014)
http://www.aids.gov.br/pagina/testagem-para-hiv (acesso 08/12/2014)
http://laboratoriocace.com.br/informes,hepatites-virais-a-b-c-d-e-diagnstico-laboratorial,5.html (acesso 08/12/2014)
http://www.worldhepatitisalliance.org/pt/prevencao-diagnostico-e-tratamento.html (acesso 08/12/2014)