Ácidos nucleicos:UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIAINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDEImunodiagnóstico - 2014.2

I

Imunodiagnóstico contraInfecções Virais

Discente: Guilherme da Rocha Peres

Introdução★ Vírus (do latim virus, "veneno" ou "toxina")

são pequenos agentes infecciosos (20-300 nm de diâmetro) que apresentam genoma constituído de uma ou várias moléculas de ácido nucleico (DNA ou RNA), as quais possuem a forma de fita simples ou dupla.

★ Parasita intra celular obrigatório.

Introdução

imagem: http://blogdebiologiainteracaoufpe.blogspot.com.br/2012/05/virus-caracteristicas-gerais-os-virus-n.html

Introdução

imagem: http://slideplayer.com.br/slide/294425/

Duas estratégias básicas★ Detecção do Agente

(vírus ou seus efeitos)

★ Detecção da resposta do corpo(especialmente anticorpos)

Duas estratégias básicas

Imagens: http://pt.wikipedia.org/

Em busca dos vírus► Sinais clínicos (visíveis, clínicos, sintomáticos)

► Detecção do vírus, antígenos ou genomas

● Isolamento (+ detecção imunológica)● Quantificação (contagem de placas, DICC50)● PCR● Hemaglutinação (HA)● ELISA● Deteção imunológica (IH ou IF)● Microscopia eletrônica

Cultivo e Identificação● Inoculação em animais● Inoculação em ovos embrionados● Cultivos celulares● Métodos imunoquímicos● Microscopia eletrônica

Imagem: http://www.scielo.oces.mctes.pt/scielo.php?pid=S0873-21592009000400007&script=sci_arttext

Cultivos Celulares

● cultivos primários (células diplóides)● linhas celulares (diplóide, 40 passagens )● células de linhagem (passagens indefinidas)

● Microscopia Eletrônica● Marcação com Imunofluoresência● Coração com Hematoxilina-eosina (HE)● Análise do ECP

Cultivos Celulares

ref: http://www.scielo.oces.mctes.pt/scielo.php?pid=S0873-21592009000400007&script=sci_arttext

Cultivos de vírus in vitro● Vidro● Plástico● Garrafas Fechadas (Ou Abertas (CO2))● Garrafas Estacionárias Ou Rolantes● Tubos de vidro ou plástico● Tubos com lamínulas (tubos de Leighton)● Placas de microtécnica 6, 12, 24, 96 orifícios

Efeito Citopático

É o dano que o vírus causa à célula !

● lise● arredondamento● vacuolização● formação de sincícios● inclusões● picnose● apoptose

Efeitos citopáticos virais

Efeitos citopáticos virais

ref: http://pt.slideshare.net/livreinatural/c-u-l-t-i-v-o-e-i-s-o-l-a-m-e-n-t-o

Efeitos virais

ref: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-09352002000600002&script=sci_arttext

Quantificação viral - pfu

ref: http://jvi.asm.org/content/85/21/11183/F8.expansion.html

Detecção com HA

ref: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm

Detecção com HA

ref: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm

Detecção com ELISA

ref: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/ELISA

ELISA: With antigen capture ELISA, the wells are coated with antibody to the virus. The sample containing virus (1) is addedand, after washing several times, enzyme conjugated to an antibody to the virus is added (2). Finally, after a further cycle ofwashing, the enzyme's substrate (3) is added. A colored product is formed if the viral antigen is present in the sample (4). FromHart and Shears, 1997.

Detecção com ELISA

ref: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/ELISA

Detecção Imunológica

Imunohistoquímica (IPX) Imunofluorescência

Antigenos de Herpes Virusem células endoteliais

Herpes Virus em cultivo celular

Imunoperoxidase (IPX)

● Material infectado (células ou tecidos)+ soro específico (ex: soro humano)+ conjugado anti-IgG (ex. anti-IgG humana conjugado à peroxidase)+ substrato apropriado (ex. carbazol) _______________________________________ = reação colorida

Imunoperoxidase (IPX)

Imagens: ref: CIELO

Imunofluorescência Direta

Anticorpo marcado sobre material infectado

● material infectado (suspeito)+ anticorpo específico marcado com FITC+ luz UV __________= reação colorida

Imunofluorescência Indireta

Material infectado (células ou tecidos)

+ soro específico (ex: soro humano)+ conjugado anti-IgG específico (ex. anti-IgG humana/FITC)+ luz UV ___________________________________ = reação colorida

Western Blot

Imagem: http://www.ufrgs.br/labvir/material

PCR

Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna

Principais origens de DNA/RNA para PCR

Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna

● Nódulos linfáticos: HIV● Swab cervical: HIV, HPV● Sangue total: HIV, CMV● Plasma, soro: HIV, HTLV, HCV, HBV● Liquido cefalorraquídeo: enterovirus● Esputo, saliva, aspirado naso-faríngeo:● VRS, Influenza● Materia fecal: Rota

PCR

Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna

Gel de PCR (influenza) Gel de RNA (Rotavírus) (corante?)

RFLP\Fragmentação de DNA

Imagem: http://forensicsciencenew.blogspot.com.br/2014/03/the-use-of-dna-typing-in-forensic.html

Detecção de Anticorpos (2)► Quando os sinais clínicos já passaram► Quando houve algum contato com o vírus► Detecção de anticorpos:► (usualmente soro ou LCR)

● Soro-neutralização● Imunodifusão● Inibição da hemaglutinação (IH)● Hemaglutinação passiva● Imunoperoxidase para anticorpos● Imunofluorescência indireta● ELISAs (diversos)● Western blot

Detecção de Anticorpos

Sorologia/Neutralização

► Diluir o soro seriadamente: ex:1/2 1/4 1/8 1/16……….1/512

● Adicionar volume igual de vírus (100 DICC50) ● Incubar a 37oC● Colocar mistura sobre células● Última diluição que evita multiplicação viral é o título

Imunodifusão

Western Blot para Ag

Imunofluorescência

Indireta para a detecção de anticorpos:Material infectado conhecido (células ou tecidos)

+ soro suspeito (ex: soro humano)+ conjugado anti-IgG específico

(ex. anti-IgG humana conjugado à fluoresceína)+ luz UV

____________________________________ = reação colorida

Imunofluorescência

Herpes Vírus

ELISA (direta/indireta/bloqueio)

1a Geração - Indireto (IgG)Falsos positivos (artrite reumatoide)2a Geração - Indireto (IgG)Melhora espec. | Detecta HIV 1 e 23a Geração - Sandwich - (IgG / IgM)Boa sensibilidade, baixa títulação4a Geração - Proteínas recombinantesAlta sensibilidade (HIV)

Imunocromatografia

*** - HIV

Limitações da Sorologia

►Detecta exposição, não quando ela ocorreu !!!►Para correlação com a doença:

● Soros pareados● IgM● Líquido céfalo raquidiano

Conclusões e Discussão● Os vírus constituem uma ameaça a saúde humana,

animal e vegetal há séculos, milênios.

● A erradicação de algumas doenças é fruto do desenvolvimento científico humano frente a determinados vírus. (e.g. Póliomielite)

● Pesquisas constantes trazem um avanço no entendimento, diagnóstico e tratamento de infecções virais. (e.g. vacinas de DNA viral / HPV)

Conclusões e Discussão● A mutação gênica é um desafio, tanto em infecções

ortólogas quanto parálogas. Confere resistência.

● A ligação de alguns vírus com o câncer, pode ajudar no controle de cânceres como garganta, útero, etc.

● A Medicina clínica prática é defasada frente ao desenvolvimento científico. Precisa de celeração.

FIM

Perguntas ?

:-)

FIM

Obrigado

:-)

ReferênciasLEHNINGER, A. L. Princípios de bioquímica. São Paulo: Savier, 2005.

ALBERTS, Bruce; Alexander Johnson, Julian Lewis, Kazuo, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walters. Molecular Biology of the Cell; Fourth Edition. Nova Iorque e Londres: Garland Science, 2002. ISBN 0-8153-3218-1.

Watson J, Crick F. (1953). "Molecular structure of nucleic acids; a structure for

deoxyribose nucleic acid" (PDF). Nature 171 (4356): 737–8. PMID 13054692.

Gregory S, et al.. (2006). "The DNA sequence and biological annotation of human chromosome 1".Nature 441 (7091): 315–21.

Referênciashttp://www.ufrgs.br/labvir/material/aulat8.pdf (acesso 08/12/2014)

http://pt.slideshare.net/livreinatural/c-u-l-t-i-v-o-e-i-s-o-l-a-m-e-n-t-o (acesso 06/12/2014)

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-09352002000600002&script=sci_arttext (acesso 05/12/2014)

http://jvi.asm.org/content/85/21/11183/F8.expansion.html (acesso 08/12/2014)

http://slideplayer.com.br/slide/294425/ (acesso 01/12/2014)

http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm (acesso 08/12/2014)

Referênciashttp://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna (acesso 08/12/2014)

http://www.aids.gov.br/pagina/testagem-para-hiv (acesso 08/12/2014)

http://laboratoriocace.com.br/informes,hepatites-virais-a-b-c-d-e-diagnstico-laboratorial,5.html (acesso 08/12/2014)

http://www.worldhepatitisalliance.org/pt/prevencao-diagnostico-e-tratamento.html (acesso 08/12/2014)