Post on 01-Nov-2018
Klinik mikrobiyoloji uzmanınınsorumluluğunda
kan hizmet birimleri
İMMÜNOHEMATOLOJİKTESTLER
İMMÜNOHEMATOLOJİKTESTLER
Dr.A.Esra KARAKOÇS.B.Ankara EAH
TKMTD, TKVKLİMUD-EGE Sürekli Tıp Eğitimi, Sürekli Mesleki Gelişim Etkinliği, 27.3.2012
İmmünohematolojik Testler
Kan gruplama
Çapraz Karşılaştırma
Antikor tarama
Antikor tanımlama
Kan gruplama
Çapraz Karşılaştırma
Antikor tarama
Antikor tanımlama
ISBT Kan Gruplama SistemleriAdı KısaltmaABO ABOMNS MNSP PRh RHLutheran LUKell KELLewis LEDuffy FYKiddJ KDiego DICartwright YTXG XGScianna SCDombrock DOColton COLandsteiner-Wiener LWChido/Rodgers CH/RGHh HKx XKGerbich GECromer CROMKnops KNIndian INOk OKRaph RAPHJMH JMH
Adı KısaltmaABO ABOMNS MNSP PRh RHLutheran LUKell KELLewis LEDuffy FYKiddJ KDiego DICartwright YTXG XGScianna SCDombrock DOColton COLandsteiner-Wiener LWChido/Rodgers CH/RGHh HKx XKGerbich GECromer CROMKnops KNIndian INOk OKRaph RAPHJMH JMH
ABO Kan Grup Sistemi
ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklı
• Serumda aglutinin varlığı
• ABH ag’leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur
• Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt
gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemi
ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklı
• Serumda aglutinin varlığı
• ABH ag’leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur
• Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt
gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemi
Eritrosit Transfüzyonu
Plazma Transfüzyonu
KAN GRUPLARININKAN GRUPLARININBELİRLENMESİBELİRLENMESİ
7
KAN GRUPLARININKAN GRUPLARININBELİRLENMESİBELİRLENMESİ
KAN GRUPLARIFORWARD
8
FORWARD
REVERSE
Kan Gruplarının Saptanması
1. Hemaglütinasyon• Lam (Slide) yöntemi• Tüp yöntemi• Jel Santrifügasyon yöntemi• Mikroplak yöntemi
2. RİA3. EİA4. PCR
9
1. Hemaglütinasyon• Lam (Slide) yöntemi• Tüp yöntemi• Jel Santrifügasyon yöntemi• Mikroplak yöntemi
2. RİA3. EİA4. PCR
Hemaglütinasyon SonuçlarınıEtkileyen Faktörler
1. Fiziksel Koşullar İnkübasyon ısısı IgM tipi antikorlar……4-27ºC (oda ısısı) IgG tipi antikorlar……30-37ºC (inkübatör)
İnkübasyon süresi Santrifüj hız ve süresi Ortam: pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller
2. Eritrositler Yüzey antijenlerinin tipi, sayısı, lokalizasyonu ve immünojenitesi Homozigot veya heterozigot olmaları
3. Serum: Protein içeriği ve antikorların yapı ve türleri
10
1. Fiziksel Koşullar İnkübasyon ısısı IgM tipi antikorlar……4-27ºC (oda ısısı) IgG tipi antikorlar……30-37ºC (inkübatör)
İnkübasyon süresi Santrifüj hız ve süresi Ortam: pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller
2. Eritrositler Yüzey antijenlerinin tipi, sayısı, lokalizasyonu ve immünojenitesi Homozigot veya heterozigot olmaları
3. Serum: Protein içeriği ve antikorların yapı ve türleri
Hasta Örneği
11
TÜP YÖNTEMİ
12
13
14
Aglütinasyonun Değerlendirilmesi
Aglütinasyon Değerlendirme++++ Bir tek büyük küme, serbest hücre yok
+++ Birkaç büyük küme, serbest hücre yok
++ Çok sayıda büyük ve küçük küme, serbest hücre yok
15
+ Çok sayıda küçük küme, zeminde serbest hücre var
Mikroaglütinasyon Makroskobik negatif, mikroskobik bazı alanlar 6-8 hücreli kümeli
Şüpheli Makroskobik negatif, çok nadir mikroskobik 6-8 hücreli küme
Rulo Oluşumu Mikroskobik olarak kümeler para dizisi şeklinde
Negatif Makroskobik ve mikroskobik küme yok
Mixed Field Çok sayıda büyük ve küçük küme, zeminde serbest eritrosit var
Forward Gruplama
16
Forward Gruplama
Temiz ve etiketli test tüplerine birer damlaanti-A, anti-B, anti-AB, anti-D ve hasta
serumu damlatılır
17
Her bir tüpe bir damla test edilecek eritrositlerin enaz 3 kez yıkanmış % 2-5’lik süspansiyonundan
(SF, serum veya plazma ile hazırlanmış) damlatılır
18
Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık900-1000 x g’de 15-30 sn santrifüj edilir
(Alternatif olarak tüpler santrifüj edilmeden 1 saatoda ısısında bırakılır)
19
Tüplerin dibindeki eritrosit birikintileri tekraryavaşça süspanse edilir ve makroskobik olarakaglütinasyon açısından incelenir. Test sonuçları
okunur, yorumlanır ve kaydedilir
20
agglütinasyonhemoliz
21
Reverse Gruplama
22
Reverse Gruplama
Reverse gruplama
Hasta serumu
Test eritrositleri
23
agglütinasyonhemoliz
24
Forward Reverse
SONUÇLANDIRMA
25
A Ag pozitifD Ag negatif
A grubu Rh negatif
Anti-B Ab pozitif
A grubu
JEL YÖNTEMİ
26
27
28
29
AglütinasyonunDeğerlendirilmesi
30
+4 +3 +2 +1 0
31
MİKROPLAK YÖNTEMİ
32
Mikroplak ABD Gruplama
33
ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMAÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA(Cross-Match)
36
ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMAÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA(Cross-Match)
Transfüzyon sırasında veya sonrasındaoluşabilecek Ag-Ab reaksiyonunun laboratuvar
ortamında yapılan ön denemesidir.
Alıcı serumuyla verici eritrositleri karşılaştırılır
• Alıcı ve verici ABO uyumunun son kez doğrulanması• Panel dışı Ab varlığı durumunda bu Ab’ların belirlenmesi
Majör CRM; alıcı serumu → verici eritrositleri
Minör CRM; verici serumu → alıcı eritrositleri
37
Transfüzyon sırasında veya sonrasındaoluşabilecek Ag-Ab reaksiyonunun laboratuvar
ortamında yapılan ön denemesidir.
Alıcı serumuyla verici eritrositleri karşılaştırılır
• Alıcı ve verici ABO uyumunun son kez doğrulanması• Panel dışı Ab varlığı durumunda bu Ab’ların belirlenmesi
Majör CRM; alıcı serumu → verici eritrositleri
Minör CRM; verici serumu → alıcı eritrositleri
Çapraz Karşılaştırma
• ABO ve Rh sistemleri
dışında bulunan kan
grupları nedeniyle önemli
• Kan transfüzyonu öncesi
yapılması gerekir
• Lewis; Lea - Le - Leb• MN; M - N - S - s -
U• P; P1 - P2 - p• Luteren; Lua - Lub• Kell; K - k• Duffy; Fya - Fyb• İi; İ - i
• ABO ve Rh sistemleri
dışında bulunan kan
grupları nedeniyle önemli
• Kan transfüzyonu öncesi
yapılması gerekir
• Lewis; Lea - Le - Leb• MN; M - N - S - s -
U• P; P1 - P2 - p• Luteren; Lua - Lub• Kell; K - k• Duffy; Fya - Fyb• İi; İ - i
Çapraz Karşılaştırma
• ABO – Rh uygun kan % 98 uyum
• Antikor tarama -tanımlama
• Çapraz karşılaştırma
• % 2 ek uygunluk
• ABO – Rh uygun kan % 98 uyum
• Antikor tarama -tanımlama
• Çapraz karşılaştırma
• % 2 ek uygunluk
Çapraz Karşılaştırma
Aglutinasyon yok ~ uyumlu
Verici Eritrositi Hasta Serumu
Aglutinasyon yok ~ uyumlu
Aglutinasyon ~ uyumsuz
42
Çapraz Karşılaştırma
Acil Cross-Match (Immediate Spin)
Klinisyene göre, normal CRM prosedürünün uygulanmasıiçin geçecek süre hayati bir zaman kaybına neden
olacaksa → IS CRMIS CRM
Acil durumlar dışında kullanılmamalıdır
Acil bir durumda IS CRM yapılarak kan kliniğegönderildiğinde, mutlaka standart CRM işlemi de
yapılıp sonuç klinisyene bildirilmelidir!..
44
Klinisyene göre, normal CRM prosedürünün uygulanmasıiçin geçecek süre hayati bir zaman kaybına neden
olacaksa → IS CRMIS CRM
Acil durumlar dışında kullanılmamalıdır
Acil bir durumda IS CRM yapılarak kan kliniğegönderildiğinde, mutlaka standart CRM işlemi de
yapılıp sonuç klinisyene bildirilmelidir!..
AglütinasyonunKolaylaştırılması
1. Eritrositler arası uzaklığı kısaltma Proteolitik enzimler (papain, bromelin, ficin, neuroaminidase,
trypsin vs) Albümin: Muhtemelen eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize
etmekte Polikatyonlar (polybrene, protamine): Ortamın katyon yoğunluğunu
artırarak eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize ederler LISS (Low Ionic Strength Solution): Ortamdaki iyon sayısını azaltır Santrifüj: Santrifüj gücü ile eritrositler birbirine yaklaşır
2. İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs serumu45
1. Eritrositler arası uzaklığı kısaltma Proteolitik enzimler (papain, bromelin, ficin, neuroaminidase,
trypsin vs) Albümin: Muhtemelen eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize
etmekte Polikatyonlar (polybrene, protamine): Ortamın katyon yoğunluğunu
artırarak eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize ederler LISS (Low Ionic Strength Solution): Ortamdaki iyon sayısını azaltır Santrifüj: Santrifüj gücü ile eritrositler birbirine yaklaşır
2. İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs serumu
ANTİGLOBULİN TESTLERANTİGLOBULİN TESTLER
46
ANTİGLOBULİN TESTLERANTİGLOBULİN TESTLER
Doğal ve İmmün EritrositAntikorlarının Özellikleri
Doğal Antikorlar İmmün Antikorlar
Eritrositlerin karbonhidratantijenlerine yönelik
Eritrositlerin protein antijenlerineyönelik
Komplet İnkomplet
Soğuk Sıcak
Genellikle IgM Genellikle IgG
Plasentadan geçmez Plasentadan geçer
47
Doğal Antikorlar İmmün Antikorlar
Eritrositlerin karbonhidratantijenlerine yönelik
Eritrositlerin protein antijenlerineyönelik
Komplet İnkomplet
Soğuk Sıcak
Genellikle IgM Genellikle IgG
Plasentadan geçmez Plasentadan geçer
Komplet ve İnkomplet Antikorlarİzotonik tuzlu su ortamında eritrositleri kümeleştirebilen antikorlara
“komplet”, kümeleştiremeyenlere “inkomplet” adı verilir.
48
Antiglobulin Testler• Direkt Antiglobulin Test (DAT, Direkt Coombs
Testi): Otoimmun hemolitik anemi, ilaca bağlı hemoliz,yenidoğanın hemolitik hastalığı ve yakın zamandayapılmış kan transfüzyonuna bağlı alloimmünizasyonaraştırılır
• İndirekt Antiglobulin Test (İAT, İndirekt CoombsTesti): Antikor tarama ve tanımlama, kan gruplama veuygunluk testlerinde kullanılır
49
• Direkt Antiglobulin Test (DAT, Direkt CoombsTesti): Otoimmun hemolitik anemi, ilaca bağlı hemoliz,yenidoğanın hemolitik hastalığı ve yakın zamandayapılmış kan transfüzyonuna bağlı alloimmünizasyonaraştırılır
• İndirekt Antiglobulin Test (İAT, İndirekt CoombsTesti): Antikor tarama ve tanımlama, kan gruplama veuygunluk testlerinde kullanılır
DAT POZİTİFLİK• Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların
komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini
kaplaması
• Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit
yüzeyini kaplaması
• Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin
yüzeyini kaplaması
• Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların
komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini
kaplaması
• Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit
yüzeyini kaplaması
• Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin
yüzeyini kaplaması
DAT
51
DAT
52
DAT•Hasta eritrositlerinden SF içerisinde %2-5’lik eritrosit süspansiyonu hazırlanır.•Bu süspansiyondan bir damla test tüpüne konur.•SF ile eritrositler 4 kez yıkanır.•Üstteki süpernatan tamamen döküldükten sonra 1-2 damla polispesifik AHG reageni ilave edilir
53
DAT•1000 x g’de 1 dak. santrifüj edilir.•Santrifüj sonrası aglütinasyon değerlendirilir ve sonuçlar kaydedilir
54
DAT
55
İAT
56
İAT
57
• Bir tüpe 2-3 damla hastaserumu konur.
• Üzerine bir damla %2-5’lik testeritrosit süspansiyonu ilaveedilir.
• Ortalama 30-60 dk. Benmarideinkübe edilir
• İnkübasyon sonrası 1000 xg’de 1 dak. santrifüj edilir
• Santrifüj sonrası tüpler hemolizyönünden kontrol edilir. Dahasonra dibe çöken eritrositlerresüspanse edilir, aglütinasyonolup olmadığı değerlendirilir
58
• Bir tüpe 2-3 damla hastaserumu konur.
• Üzerine bir damla %2-5’lik testeritrosit süspansiyonu ilaveedilir.
• Ortalama 30-60 dk. Benmarideinkübe edilir
• İnkübasyon sonrası 1000 xg’de 1 dak. santrifüj edilir
• Santrifüj sonrası tüpler hemolizyönünden kontrol edilir. Dahasonra dibe çöken eritrositlerresüspanse edilir, aglütinasyonolup olmadığı değerlendirilir
• Aglütinasyon yoksa eritrositler%0.9 SF ile en az 4 kezyıkanır. Böylece eritrositlerebağlanmamış antikorlar veserumda bulunan diğerproteinler uzaklaştırılmış olur.
• Yıkanmış eritrositlerin üzerine2 damla AHG reageni eklenir
59
• Aglütinasyon yoksa eritrositler%0.9 SF ile en az 4 kezyıkanır. Böylece eritrositlerebağlanmamış antikorlar veserumda bulunan diğerproteinler uzaklaştırılmış olur.
• Yıkanmış eritrositlerin üzerine2 damla AHG reageni eklenir
• 1000 x g’de 1 dak. santrifüj edilirve aglütinasyon değerlendirilir.
• Negatif AHG testini konfirmeetmek için IgG kaplı kontroleritrositlerinden 1 damla tüplereilave edilir. 1000 x g’de 1 dak.santrifüj edilir. Santrifüj sonrasıaglütinasyon değerlendirilir, en az2+ aglütinasyon görülmelidir
60
• 1000 x g’de 1 dak. santrifüj edilirve aglütinasyon değerlendirilir.
• Negatif AHG testini konfirmeetmek için IgG kaplı kontroleritrositlerinden 1 damla tüplereilave edilir. 1000 x g’de 1 dak.santrifüj edilir. Santrifüj sonrasıaglütinasyon değerlendirilir, en az2+ aglütinasyon görülmelidir
Jel Yöntemi ile İAT
61
Jel Yöntemi ile İAT
62
Enzim
63
Enzim
64
Antikor Tarama - Tanımlama
• Antikor Tarama Testi
Eritrosit antijenlerine karşı antikorolup olmadığını saptamak için yapılır
• Antikor Tanımlama Testi
Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkiliolduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğinisaptamak için yapılır
• Antikor Tarama Testi
Eritrosit antijenlerine karşı antikorolup olmadığını saptamak için yapılır
• Antikor Tanımlama Testi
Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkiliolduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğinisaptamak için yapılır
Antikor Tarama• Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı
• Klinik önem
– Antikorun 37oC’de reaktif olması
– Hemoliz yapması
– Eritrosit yaşam süresini azaltması
• Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı
• Klinik önem
– Antikorun 37oC’de reaktif olması
– Hemoliz yapması
– Eritrosit yaşam süresini azaltması
Hücreler
Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3
farklı donörden alınmış test hücreleri tarama,
daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama
testlerinde kullanılmalı
Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3
farklı donörden alınmış test hücreleri tarama,
daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama
testlerinde kullanılmalı
IAT
1 2 3
1 damla hücre
+
2 damla hasta serumu
ANTİKOR TARAMA (IAT-ET)
++++ +++ ++ + - -
I II III I II III
Santrifüj10 Dakika
DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.
Hücre vetablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma
++++ +++ ++ + - -
Test HücrelerininHazırlanması
( IP, IIP, IIIP )Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
İnkübasyon37 °C’de 15 Dakika
I II III I II III
Test HücrelerininHazırlanması( I, II, III )
Hücreler resüspanse edilerekoda ısısına getirilir
++++ +++ ++ + - -
I II III I II III
ANTİKOR TARAMA - CA
Santrifüj10 Dakika
DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.
Hücre vetablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma
++++ +++ ++ + - -
İnkübasyon4 °C’de 15 Dakika
I II III I II III
Test HücrelerininHazırlanması( I, II, III )
Hücreler resüspanse edilerekoda ısısına getirilir
* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin KartıKullanılır
* *
Test Hücreleri
Tüpte Antikor Tanımlama
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 damla hücre
+
2 damla hasta serumu
ANTİKOR TANIMLAMA - IAT
++++ +++ ++ + - -
1 2 3 4 5 6
++++ +++ ++ + -
7 8 9 10 11
Santrifüj10 Dakika
DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.
Hücre vetablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma
Test HücrelerininHazırlanması
( 11’li Normal Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
++++ +++ ++ + - -
1 2 3 4 5 6
İnkübasyon37 °C’de 15 Dakika
++++ +++ ++ + -
7 8 9 10 11
Adı SoyadıTarih
++++ +++ ++ + - -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
++++ +++ ++ + -
ANTİKOR TANIMLAMA – ET
Santrifüj10 Dakika
DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.
Hücre vetablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma
++++ +++ ++ + - -
İnkübasyon37 °C’de 15 Dakika
++++ +++ ++ + -
Test HücrelerininHazırlanması
( 11’li Enzimli Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
1 2 3 4 5
67 8 9 10 11
Adı SoyadıTarih
++++ +++ ++ + - -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
++++ +++ ++ + -
ANTİKOR TANIMLAMA – CA
Santrifüj10 Dakika
DeğerlendirmeTest hücreleri ekindeki tablodeğerlendirmede kullanılır.
Hücre vetablonun Lot numarası aynı
olmalıdır.
Dağıtım50 µL etiketine uyan test hücresi25 µL hasta serumu veya plazma
++++ +++ ++ + - -
İnkübasyon4 °C’de 15 Dakika
++++ +++ ++ + -
Test HücrelerininHazırlanması
( 11’li Normal Panel Hücresi )Hücreler resüspanse edilerek
oda ısısına getirilir
1 2 3 4 5
6
7 8 9 10 11
* Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin KartıKullanılır
**
Değerlendirme
Antikor Tanımlama
Anti-E