Histologická technika

Princip barvení, druhy barviv. Základní a speciální barvicí metody. Identifikace

barvicích metod na preparátech.

Ústav histologie a embryologieMUDr. Blanka Zajícová

Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241 8.10.2012

Barvení

Neobarvené řezy – nerozlišíme jednotlivé struktury, mají stejný index lomu (prohlížení jen s použitím speciálních optických zařízení – mikroskop s fázovým kontrastem)

Běžná světelná mikroskopie - založena na použití velké palety barvicích metod

Barviva jsou látky, které absorbují světlo určitých vlnových délek. To, co pak vnímáme jako barevný vjem, jsou neabsorbované vlnové délky.

Různé součásti buněk a tkání váží různá barviva – po obarvení se proto dají od sebe dobře odlišit

Barvení nefixovaných tkání:

Vitální: např. tuš, trypanová modř, lithiumkarmín, aplikace do krve či vaziva – vychytávání se sleduje na řezech. Fagocytární aktivita buněk.

Supravitální: např. Janusova zeleň – mitochondrie, methylenová modř – nervové bb.

Histologická barviva1. Zásaditá (bazická), také jádrová, barví bazofilní struktury (jaderný

chromatin, ribosomy), př.: hematoxylin, methylenová modř, toluidinová modř, thionin

2. Kyselá (acidická), také plasmatická, barví acidofilní struktury (cytoplasma, kolagenní vlákna), př.: eosin, světlá zeleň, anilinová modř, oranž G, ponceau, kyselý fuchsin

Bazofilie je vlastnost struktur barvit se bazickými barvivy.

Acidofilie (eosinofilie, oxyfilie) je vlastnost struktur barvit se kyselými barvivy.

Barviva podle původu:

Přírodní: hematoxylin, karmín, orcein, šafrán

Syntetická

Aby bylo dosaženo standardní kvality, jsou dnes i přírodní barviva většinou připravována uměle.

BarveníBarvení podle způsobu aplikace: Progresivní – tkáň se barví pod kontrolou zraku do určité intenzity zbarvení, pak se

proces přeruší Regresivní – tkáň se přebarví, přebytečné barvivo se z tkáně odstraní příslušným

roztokem pod kontrolou zraku (diferenciace) Sukcedánní – barvení řezu postupně v několika barvicích roztocích Simultánní – barvení řezu roztokem různých barviv současně In toto – barvení celého bloku tkáně

Barvení podle výsledků barvení:Ortochromatické – složky tkáně vykazují stejnou barvu jako užité barvivoMetachromatické – jednotlivé komponenty tkáně se obarví jedním barvivem v různě

barevných tónech (např. při průkazu hlenu v buňkách produkujících hlen barvíme toluidinovou modří – hlen je ale červenofialový), metachromatická barviva jsou např.: toluidinová modř, thionin, methylenová modř

Difúzní – barvicí roztok znázorní všechny složky tkáně ve stejném barevném tónu a ve stejné intenzitě

Elektivní – barvicí roztok obarví pouze jednu ze složek buněk či tkání nebo ji výrazně vyzvedá

Přehledné barvicí metodyObarví jádra a cytoplasmu rozdílným barevným tónem a zároveň

obarví i mezibuněčnou hmotu pojivové tkáně.Používá se jádrové a jedno nebo více kyselých barviv (použití více

kyselých barviv umožní barevné rozlišení vaziva a svaloviny).

1. Hematoxylin – eosinZákladní barvicí metoda barvení parafínových řezů

2. Massonovy trichromyPodle zbarvení vaziva:

a) žlutý b) zelený c) modrý

3. Weigert van Gieson4. AZAN

Příprava hematoxylinuHematoxylin je nažloutlý krystalický prášek – jeho roztok sám o sobě

nebarví.Nutná je oxidace v hematein (samovolně na vzduchu zraje měsíce,

urychluje se přidáním oxidačních činidel – jodičnan sodný).Hematein má slabou afinitu ke tkáním, musí se použít mořidlo (soli Al,

Fe)Barví barevný lak hemateinu Podle mořidla se rozeznávají různé druhy hematoxylinů:

Kamencové hematoxyliny (Harrisův, Mayerův): např. HE, žlutý trichrom, dobarvení jader u speciálních metod

Železité hematoxyliny Weigertův: zelený a modrý trichrom, Weigert van Gieson, Heidenhainův hematoxylin

Barvení hematoxylinem a eosinem, HE1. Odparafínování, deparafinaceXylen ve 2 lázních po 5´, alkohol v sestupné řadě (100%, 96%), voda

2. BarveníHematoxylin 3-10´, voda, regresivní barvení, diferencování v kyselém alkoholu (70% alkohol s HCl), vodaEosin 0,1-0,5% roztok 1-3´, voda, diferencování v 80% alkoholu

3. OdvodněníDvě lázně alkoholu 96%, fenolxylen 20-25%, 3´

4. Projasnění2 lázně xylenu po 5 min.

5. ZamontováníZamontování do montovacího média, sušení

Montovací média

Požadavky: bezbarvé, vysoký index lomu, nesmí odbarvovat, musí mít konzervační účinek

• rozpustná ve vodě: glycerin, glycerínová želatina

• nerozpustná ve vodě: kanadský balzám, epoxidová pryskyřice - Entelan

Pomocí montovacího média obarvený řez zamontujeme pod krycí sklo.

Hematoxylin-eosin (HE)

Hematoxylin barví bazofilní součásti buňky- jádro, ribosomy, GEREosin barví acidofilní struktury buňky – hlavně proteiny (cytoplasma, mitochondrie,

hladké ER)Výsledek barvení: jádra – modrá, modročerná, cytoplasma růžová, svalovina

červená, kolagenní vlákna růžová

jádra

vazivo

sval

HE, močový měchýř

svalovina

vazivo

epitel

vazivo

cévy

sval

Massonovy trichromyŽlutý Massonův trichrom (ŽT)Žlutý Massonův trichrom (ŽT): Barviva: Harrisův hematoxylin, eosin, šafrán

Výsledek barvení: jádra tmavě modrá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna žlutá, svalovina červená, erytrocyty červené

Modrý Massonův trichrom (MT)Modrý Massonův trichrom (MT): Barviva: hematoxylin (Weigertův), kyselý fuchsin-ponceau, anilínová modř

Výsledek barvení: jádra tmavě hnědá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna modrá, svalovina červená

Zelený Massonův trichrom (ZT)Zelený Massonův trichrom (ZT): Barviva: hematoxylin (Weigertův), ponceau–kyselý fuchsin–světlá zeleň, oranž G

Výsledek barvení: jádra tmavě hnědá, cytoplasma okrová, kolagenní vlákna zelená, svalovina červená, erytrocyty oranžové

Massonův žlutý trichrom, jícen

Mikrofotografie: prof. Martínek

epitel

kolag. vazivo

svalovina

žlázkyKolagenní vlákna se barví žlutě.

Massonův modrý trichrom, fundus žaludkusvalovina

kolag. vazivo

céva

epitel

Kolagenní vlákna se

barví modře.

Massonův zelený trichrom, larynx

epitel

Kolagenní vlákna se

barví zeleně.

žlázky

svalovina

kolag. vazivo

Hrot jazyka

Dřeň ledviny

Weigert van Gieson

Foto: doc. Z. Jirsová

Mikrofotografie: Kühnel, Pocket Atlas, 2003

Barviva: Weigertův železitý hematoxylin, pikrofuchsin

Výsledek bavení: jádra hnědočerně, fuchsin barví kolagenní vlákna červeně, kyselina pikrová cytoplasmu, svalovinu a erytrocyty žlutě

vazivosvalovina

AZAN, slinná žláza

Výsledek barvení:

Jádra karmínově červená, cytoplasma světle fialová, kolagenní vlákna blankytně modrá, svalovina červená, erytrocyty oranžovočervené

Barviva: azokarmín, anilínová modř, oranž G

jádravazivo

AZAN

svalovina

jádra

kolag. vazivo

Speciální barvicí metody - příklady• Cílené metody, které znázorní pouze určitý typ buněk nebo buněčný či

tkáňový detail• Cytologické metody: Heidenhainovo barvení• Barvení elastických vláken (elastinu): orcein, aldehyd-fuchsin,

resorcin-fuchsin• Průkaz retikulárních vláken: impregnace stříbrem, PAS reakce• Histochemické metody• Neurohistologické metody:

– Barevné: • průkaz Nisslovy substance (Nisslova metoda)• Průkaz myelinu: Weigertova metoda, luxolová modř

– Impregnační:• Znázornění neurofibril• Znázornění gliových buněk

Heidenhainův železitý hematoxylin, HHMitochondrie,

HHKosterní sval, HH

Barvení na elastiku, artérie

Membrana elastica interna

Elastická vlákna v medii

Membr. elastica externa

Retikulární vlákna, impregnace, játraTrámce hepatocytů

Retikulární vlákna

Portobiliární prostor