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Entwicklung von stammspezifischen PCR-Systemen
mittels subtraktiver Hybridisierung
für verschiedene Stämme innerhalb der Milchsäurebakterien
Diplomarbeit
Ausgeführt am
Institut für Allgemeine Mikrobiologie
der Christian-Albrechts Universität zu Kiel
unter der Leitung von PD Dr. W. Hausner
vorgelegt von Christian Stelter
Kiel, im Februar 2003
Angenehm sind die erledigten Arbeiten.
Marcus Tullius Cicero
Inhaltsverzeichnis 5
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung................................................................................................................................. 9
1. Einleitung ......................................................................................................................................... 11
1.1 Starterkulturen in der Biotechnologie .................................................................................... 11
1.2 Taxonomie und Eigenschaften von Milchsäurebakterien ..................................................... 11
1.2.1 Lactococcus ......................................................................................................................... 12
1.2.2 Lactobacillus ....................................................................................................................... 13
1.3 Diagnostische Systeme .............................................................................................................. 14
1.4 Genomische Unterschiede ........................................................................................................ 15
1.5 Technische Entwicklung der Subtraktiven Hybridisierung ................................................. 16
1.6 Ablauf der „Suppression Subtractive Hybridization“ (SSH) ............................................... 18
1.7 Anwendungen von Genomsubtraktionen ............................................................................... 21
2. Material und Methoden .................................................................................................................. 23
2.1 Verwendete Bakterienstämme ................................................................................................. 23
2.2 Kultivierung der Mikroorganismen ........................................................................................ 23
2.3 DNA-Präparation...................................................................................................................... 24
2.4 „Suppression Subtractive Hybridization“ .............................................................................. 25
2.4.1 Oligonukleotide ................................................................................................................... 25
2.4.2 Vorbereitung der Driver- und Tester-DNA ......................................................................... 26
2.4.3 Subtraktive Hybridisierung.................................................................................................. 27
2.4.4 Auswertende Suppression- und Nested-PCR ...................................................................... 27
2.4.5 Effizienzkontrolle mittels Lambda-Phagen/Escherichia coli Hybridisierung..................... 28
2.5 Standard-Methoden zur Auswertung innerhalb der „Subtractive Suppression
Hybridization“ (SSH) ..................................................................................................................... 28
2.5.1 Klonierung von PCR-Fragmenten durch TA-Cloning......................................................... 28
2.5.2 Kolonie-Screening zur Identifikation gewünschter Fragmentgrößen.................................. 29
2.5.3 Präparation von Plasmid-DNA (Minipräparation) durch alkalische Lyse........................... 29
2.5.4 Blot-Analysen zur Identifikation stammspezifischer Sonden.............................................. 30
2.5.4.1 Herstellen eines DIG-markierten PCR-Produktes als Sequenzsonde........................... 30
2.5.4.2 Herstellen eines Biotin-markierten PCR-Produktes als Sequenzsonde........................ 30
2.5.4.3 Überprüfung der Markierungseffizienz der Sonde....................................................... 31
2.5.4.4 Southern-Blot ............................................................................................................... 31
2.5.4.5 Hybridisierung.............................................................................................................. 32
6 Inhaltsverzeichnis
2.5.4.6 Detektion ...................................................................................................................... 32
2.5.4.7 Dot-Blots auf ungeladener Nylon-Membran................................................................ 32
2.5.5 DNA-Sequenzierung und Erstellen stammspezifischer PCR-Systeme ............................... 33
2.5.6 Sequenzierung von Fragmenten aus Agarosegelen ohne Klonierung ................................. 34
2.6 Subtraktive Hybridisierung durch Immobilisierung............................................................. 35
2.7 Allgemeine Arbeitsschritte ....................................................................................................... 36
2.7.1 DNA-Sequenzierung............................................................................................................ 36
2.7.2 Polymerase-Chain-Reaction ................................................................................................ 37
2.7.3 Herstellen kompetenter Zellen mit der Calciumchlorid-Methode ....................................... 37
2.7.4 Glycerinkulturen.................................................................................................................. 37
2.7.5 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................. 37
2.7.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mittels der Zentrifugier-Methode ..... 38
2.7.7 Reinigung von Nukleinsäuren durch Phenol/Chloroform-Extraktion ................................. 38
2.7.8 Ethanolfällung ..................................................................................................................... 38
2.7.9 Konzentrationsbestimmung der DNA mittels Absorptionsspektronomie ........................... 39
3. Ergebnisse ........................................................................................................................................ 41
3.1 Vorversuch zum Nachweis stammspezifischer Fragmente durch Modifizierung der
klassischen Subtraktionshybridisierung unter Verwendung von Restriktionskinetiken......... 41
3.2 Anreicherung von definierten Unterschieden zwischen Tester- und Driver-DNA ............. 42
3.3 Theoretische Restriktionsanalysen am Beispiel der Gattungen Lactococcus und
Lactobacillus .................................................................................................................................... 44
3.4 Identifizierung von genomischen Unterschieden innerhalb der Lactococcus-Stämme ...... 45
3.4.1 Anreicherung von potentiell stammspezifischen DNA-Fragmenten zur gegenseitigen
Differenzierung von Lactococcus St. 1526 und St. 1760 ............................................................. 45
3.4.2 Klonierung der angereicherten Fragmente .......................................................................... 46
3.4.3 Dot- und Southern-Blot-Analysen....................................................................................... 47
3.4.4 Sequenzierung und Analyse der für St.1526 und St.1760 spezifischen DNA-Fragmente .. 49
3.4.5 Erstellen von stammspezifischen PCR-Systemen ............................................................... 50
3.5 Identifizierung von genomischen Unterschieden innerhalb der Lactobacillus-Stämme..... 54
3.5.1 Anreicherung von stammspezifischen DNA-Fragmenten von Lactobacillus-Stämmen unter
Verwendung von 2 Driver-Stämmen............................................................................................ 54
3.5.2 Isolierung und Sequenzierung von Fragmenten aus Agarosegelen ohne Klonierung ......... 56
3.5.3 Auswertung der Fragmente über Klonierung und Dot-Blot Analysen ................................ 56
3.6 Versuche zur Parameteroptimierung innerhalb der Suppression Subtractive
Hybridization................................................................................................................................... 57
3.6.1 Optimierung des Waschpuffers ........................................................................................... 57
Inhaltsverzeichnis 7
3.6.2 Optimierung der Annealingtemperaturen in den auswertenden PCRs der SSH.................. 57
3.6.3 Versuch zur Effizienz des „Suppression Effects“................................................................ 58
3.6.4 Auswertung der SSH über eine Gradienten-PCR ................................................................ 59
3.6.5 PCR-Modifizierung zur Detektion geringster Template-Mengen ....................................... 61
3.6.6 Auswirkung der Tester-Konzentration auf die SSH ............................................................ 62
3.6.7 Versuch zum Ausschluss falsch-positiver Tester-Tester-Homohybride.............................. 64
4. Diskussion ........................................................................................................................................ 65
4.1 Eine kritische Analyse des Systems ......................................................................................... 65
4.1.1 Optimierung ausgewählter Parameter.................................................................................. 65
4.1.2 Modifikationen .................................................................................................................... 66
4.2 Bewertung der „Suppression Subtractive Hybridization“ als Grundlage zum Erstellen
stammspezifischer PCR-Systeme................................................................................................... 69
4.3 Diskussion der gefundenen genomischen Unterschiede ........................................................ 71
4.4 Ein Ausblick .............................................................................................................................. 72
4.4.1 Weiterentwicklung des Systems .......................................................................................... 72
4.4.2 Milchsäurebakterien in der Subtraktionshybridisierung...................................................... 73
4.5 Abschließende Betrachtung ..................................................................................................... 74
5. Literaturverzeichnis........................................................................................................................ 75
Anhang ................................................................................................................................................. 83
„Subtractive Hybridization“ mittels Immobilisierung der Subtractor-DNA............................ 83
Theoretische Restriktion ................................................................................................................ 84
Sequenzen ........................................................................................................................................ 86
Chemikalien..................................................................................................................................... 89
Verwendete Größenstandards ....................................................................................................... 90
Enzyme und andere Proteine ......................................................................................................... 90
Kulturmedien .................................................................................................................................. 91
Lösungen und Puffer ...................................................................................................................... 92
Abkürzungsverzeichnis....................................................................................................................... 93
Danksagung.......................................................................................................................................... 95
8 Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung 9
Zusammenfassung
Die Verwendung von Milchsäurebakterien in der milchverarbeitenden Industrie bedarf der
Notwendigkeit, die Reinheit und Zusammensetzung der verwendeten Kulturen innerhalb von
Fermentationsprozessen zu kontrollieren. Die mikrobielle Diagnostik bietet hierfür unterschiedliche
Techniken an. In dieser Arbeit wird das Verfahren der „Suppression Subtractive Hybridization“
dargestellt und als Basis dienen, um spezifisch einzelne Stämme von Milchsäurebakterien zu
identifizieren und näher zu charakterisieren.
Die Methodik beruht auf dem direkten Vergleich zweier Genome, eines zu untersuchenden und eines
nahe verwandten Stammes, mit Hilfe genomischer Subtraktion. Hierbei werden DNA-Fragmente
ermittelt, die in dem einen Stamm vorhanden und in dem anderen abwesend sind. Durch das
Schmelzen und Hybridisieren der DNA zweier Stämme können homologe Anteile ausgeschlossen und
stammspezifische Sequenzen isoliert werden. Mit dieser Technik kann auf die Sequenzierung
vollständiger Genome verzichtet werden, womit sich der zeitliche und finanzielle Aufwand für den
genotypischen Vergleich nahe verwandter Bakterien mit interessanten phänotypischen Unterschieden
reduziert. Auch wenn die Funktionen der unterschiedlichen Regionen unklar sind, können die
Nukleotidsequenzen als diagnostische Marker für auf DNA-basierende Detektion dienen. Hierin lag
das vorrangige Ziel dieser Arbeit.
Die Methode wurde anhand von zwei unterschiedlichen Stämmen aus der Gattung Lactococcus im
Labor etabliert und an weiteren Stämmen von Milchsäurebakterien erprobt. Die hierbei generierten
DNA-Fragmente wurden durch Blot-Analysen auf ihre Spezifität getestet, sequenziert sowie mit
Datenbank-Beständen verglichen. Neben dem Weg der Klonierung und einem Screening auf
Stammspezifität wurde die Möglichkeit erprobt, die erzeugten Fragmente direkt aus einem Agarosegel
heraus zu sequenzieren. Bei den verwendeten Milchsäurebakterien konnten stammspezifische DNA-
Fragmente ermittelt und zur Entwicklung von spezifischen PCR-Systemen verwendet werden.
Weiterhin wurde der Einsatz in einer Multiplex-PCR optimiert.
Das Verfahren hat sich als geeignet erwiesen, eine nähere Charakterisierung einzelner Stämme auf
genetischer Ebene durchzuführen. Die ermittelten Unterschiede konnten für diagnostische Zwecke
verwendet werden.
10 Zusammenfassung
1. Einleitung 11
1. Einleitung
1.1 Starterkulturen in der Biotechnologie
In beinahe allen menschlichen Kulturen dienen Mikroorganismen der Herstellung von
Nahrungsmitteln. Bereits vor ungefähr 8000 Jahren wurden im Zweistromland alkoholische Getränke
durch Gärungsprozesse hergestellt und Nomaden in Zentralasien betrieben zur gleichen Zeit
Milchwirtschaft mit Schafen und Ziegen. Sie stellten wahrscheinlich den ersten Käse her, ein aus
Sauermilch gewonnener Topfen.
Diese Prozesse dienten der Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln, doch die
wissenschaftliche Belegung dieser Vorgänge begann erst mit den Untersuchungen Louis Pasteurs in
der Mitte des 19. Jahrhunderts. Als eine klassische Organismengruppe der Biotechnologie sind die in
dieser Arbeit verwendeten Milchsäurebakterien zu betrachten. Milchsäurebakterien werden weltweit
empirisch oder zielbewußt als Starterbakterien in der Herstellung von Lebensmitteln eingesetzt. Die
Fermentation von Nahrungsmitteln umfasst Milchprodukte (Käse, Butter, Joghurt, Buttermilch),
fermentiertes Gemüse (Gurken, Oliven und Sauerkraut), Würste, Sauerteig und Silage (Daly et al.,
1996).
Das Interesse der Lebensmittelindustrie beruht auf der Fähigkeit der Milchsäurebakterien, vor allem
Laktose zu Milchsäure zu fermentieren. Die Vorteile liegen im säurebedingten Abfall des pH-Wertes
auf unter 4,6. Zum einen beeinflusst die Denaturierung des Milch-Caseins die Stabilität und
Konsistenz des Fermentationsproduktes positiv. Zum anderen wird das Wachstum potentiell
pathogener Bakterien inhibiert. Hinzu kommen aromatische Vorzüge durch das bei der Verwertung
des Milch-Citrats entstehende Diacetyl maßgeblich durch Vertreter der Leuconostoc-Gruppe.
Proteolytische Systeme zum Abbau des Milcheiweißes Casein tragen wesentlich zur Käsereifung bei,
wohingegen Exopolysaccharide (EPS) auf die Textur der Produkte Einfluss nehmen (Limsowtin et al.,
1996; Macura und Townsley, 1984).
1.2 Taxonomie und Eigenschaften von Milchsäurebakterien
Milchsäurebakterien werden in der Familie der Lactobacteriaceae zusammengefasst. Es sind
gram-positive, morphologisch uneinheitliche Bakteria (Stäbchen, Kokken, Streptokokken), die mit
wenigen Ausnahmen (Sporolactobacillus inulinus) weder die Fähigkeit zu Sporenbildung, noch zur
aktiven Fortbewegung besitzen. Phylogenetisch gehören sie zur Clostridium-Bacillus Gruppe und ihr
G+C-Gehalt liegt unterhalb von 50 mol% (Madigan et al, 2000, Stackebrandt et al., 1988).
Trotz variabler Morphologie sind sie physiologisch verhältnismäßig gut zu charakterisieren. Diese
chemoorganoheterotrophen Organismen sind grundsätzlich auf Kohlenhydrate angewiesen. Man
unterscheidet die homofermentativen Milchsäurebakterien, die zu mindestens 90% reines Laktat
12 1. Einleitung
bilden, von den heterofermentativen Milchsäurebakterien, die neben Laktat auch Acetat, Ethanol und
Kohlenstoffdioxid freisetzen (Teuber et al., 1991). Die Unterschiede werden durch das Vorhandensein
oder Fehlen des für die Glykolyse als Schlüsselenzyms dienenden Aldolase verursacht. Vertretern der
Familie Lactobacteriaceae fehlt die Fähigkeit der Porphyrinsynthese. Sie besitzen somit keine
Katalase, weshalb sie nicht zur Elektronentransportphosphorylierung befähigt und infolgedessen auf
Energiegewinnung durch Substratstufenphosphorylierung angewiesen sind. Alle Vertreter dieser
Gruppe sind aerotolerante Anaerobier. Bei Zugabe von Porphyrinen zu dem Nährboden können jedoch
Hämpigmente gebildet und möglicherweise sogar Atmungskettenphosphorylierung betrieben werden
(Schlegel, 1992).
Milchsäurebakterien sind mesophil bis thermophil und entsprechend ihrer Stoffwechselendprodukte
säuretolerant. Ihre natürlichen Standorte sind Milch, deren Erzeugungs- und Verarbeitungsstätten,
intakte und sich zersetzende Pflanzen sowie Darm und Schleimhäute von Mensch und Tier (Teuber et
al., 1991). Milchsäurebakterien besitzen einen hohen Bedarf an Supplinen in Form von Vitaminen,
Aminosäuren, Purinen und Pyrimidinen. Wahrscheinlich haben sie als Folge ihrer Spezialisierung auf
das Wachstum in Milch und anderen nährstoff- und supplinreichen Standorten eine begrenzte
Biosynthesefähigkeit zahlreicher Metabolite angenommen. Aufgrund dieser Auxotrophie erscheint das
Vorhandensein von proteolytischen Systemen und Transportsystemen für Peptide und Aminosäuren
verständlich. Hierdurch sind sie in der Lage hohe Wachstumsdichten zu erreichen, was eine
wesentliche Grundlage der industriellen Nutzung darstellt (Mayo, 1993). Im Gegensatz zu den meisten
anderen Mikroorganismen vermögen sie Laktose als Anpassung an den Säugetierdarm zu verwerten.
Die verschiedenen Gattungen der Milchsäurebakterien sind auf Grundlage ihrer Zellmorphologie,
DNA-Basenzusammensetzung und Art des Gärungsstoffwechsels definiert worden. Die
Milchsäurebakterien, die mit Nahrungsmitteln in Verbindung gebracht werden, beinhalten die
Gattungen Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus and Weissella (Stiles et al., 1997).
Innerhalb der Arbeit wurden Vertreter der Gattungen Lactococcus und Lactobacillus verwendet. Diese
sollen im folgenden näher betrachtet werden.
1.2.1 Lactococcus
Von Joseph Lister wurde 1873 die erste bakterielle Reinkultur angelegt. Er nannte den Organismus
Bacillus lactis. Es handelte sich um ein Milchsäurebakterium, welches später in Lactococcus lactis
ssp. lactis umbenannt wurde. In den darauffolgenden Jahren wuchsen mit neuen Isolaten die
Bemühungen zur systematischen Einordnung dieser Stämme nach morphologischen und anderen
Merkmalen (Orla-Jensen, 1919; Lancefield, 1933).
1. Einleitung 13
Die ehemalige Gattung Streptococcus umfasst zahlreiche homofermentative Arten mit
unterschiedlichen Habitaten mit z.T. beträchtlicher Bedeutung für den Menschen. Neben industriell
relevanten sind hier ebenfalls pathogene Organismen u.a. der Erreger der Karies einzuordnen.
Die Anwendung von molekulargenetischen Techniken, insbesondere die Analyse der 16S-rRNA,
resultierte ab 1985 in Veränderungen ihrer bisherigen taxonomischen Klassifikation. Die Gattung
Streptococcus wurde in die drei Gattungen Enterococcus, Lactococcus und Streptococcus aufgeteilt
(Stiles et al., 1997) Die Einteilung differenzierte außerdem pathogene und nicht pathogene
Streptococcen.
Im Gegensatz zur Enterococcus-Gattung, hauptsächlich fäkalen Ursprungs (Enterococcus faecalis),
und Streptococcus, die mit den Pyogenes (Streptococcus pyogenes) sowie Viridansuntergruppe
(Streptococcus mutans) medizinische Bedeutung aufweisen, stehen die Lactococcen mit ihrem
Einfluss auf die Milchwirtschaft. Die Gattung Lactococcus umfasst die Arten L. garvieae, L. lactis, L.
piscium, L. plantarum und L. raffinolactis.
1.2.2 Lactobacillus
Lactobacillen sind normalerweise stäbchenförmig und variieren zwischen langen, schlanken und
kurzen, gekrümmten Stäbchen. Zweidrittel der Arten sind homofermentativ. Die Gattung wurde in
drei große Untergruppen eingeteilt, mit mehr als 70 bekannten Arten. Die Aufteilung geschah primär
nach den Gesichtspunkten der Fermentationsleistung (homo-/heterofermentativ) sowie der
Wachstumstemperatur (15°C oder 45°C) und Form der Stäbchen. So zeigt Lactobacillus acidophilus
ein Wachstum bei 45°C nicht jedoch bei 15°C, weist morphologisch eine langgestreckte Stäbchenform
auf, besitzt Glycerinteichonsäuren, ist aufgrund des Vorhandenseins von Aldolase homofermentativ
und bildet kein Gas aus Glucose. Lactobacillen sind normale Bewohner des Gastrointestinaltraktes
von Mensch und Tier und werden weithin als Auslöser einiger positiver Einflüsse wie die Stimulation
des Immunsystems in Hinblick auf Pathogene und der Instandhaltung einer gesunden Mikroflora des
Darmes angesehen. Unter diesen erscheint Lactobacillus gasseri als die hauptsächlich vertretene
Lactobacillus-Art, die den menschlichen Gastrointestinaltrakt besiedelt (Mitsuoka, 1992; Kullen et al.,
2000). Die Gattung Lactobacillus enthält Vertreter mit sehr unterschiedlichen DNA-
Basenzusammensetzungen und bildet daher keine homogene Gruppe (G+C-Gehalt: 33 - 55 mol%).
Die Bedeutung der Lactobacillen in der milchverarbeitenden Industrie erklärt sich durch die hohe
Säuretoleranz (bis pH 4). Hierdurch lässt sich neben einer selektiven Anreicherung auch ein Einsatz
im Endstadium der Milchsäuregärung ableiten, wenn andere Milchsäurebakterien bereits nicht mehr in
der Lage sind zu wachsen. Arten der Gattung Lactobacillus sind nur selten pathogen (Harty et al.,
1994).
14 1. Einleitung
1.3 Diagnostische Systeme
Aus den ehemals unkontrollierten Fermentationsprozessen in kleinem Maßstab haben sich die
Ansprüche an die verwendeten Starterkulturen und Bedingungen bis zur heutigen Zeit hin stark
gewandelt. Um die genetische Identität und Sicherheit spezifischer bakterieller Isolate zu
gewährleisten, sind art- und stammspezifische molekulare Techniken für genetische Fingerabdrücke
notwendig. Die Stabilität der Komposition von Starterkulturen ist von großem Interesse für den
Hersteller. Eine routinemäßige Verifikation ist eine der wichtigsten Aufgaben, um die Produkt- und
Prozesssicherheit in Form von hygienischen Risiken und somit auch wirtschaftlicher Effizienz zu
optimieren. Es wird daher eine schnelle und reproduzierbare Methode für die Identifikation von
einzelnen Stämmen benötigt.
Während die traditionelle taxonomische Einordnung von Milchsäurebakterien auf phänotypischen
Analysen beruht (Schleifer et al., 1987), begann mit der Analyse der 16S-rRNA, als Betrachtung eines
hochkonservierten Merkmalsträgers, die Erstellung eines phylogenetischen Stammbaums der
Prokaryoten in den Vordergrund zu treten. Hierbei musste festgestellt werden, dass die Verwendung
von auf 16S-rRNA basierenden Sonden bei Lactococcus lactis ssp. cremoris (Klijn et al., 1991,
Salama et al., 1991) eine Diskrepanz zwischen der phänotypischen und genotypischen Identifikation
einiger Stämme aufzeigte (Godon et al., 1992, Klijn et al., 1995).
Die Entwicklung der Polymerasenkettenreaktion in der Mitte der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts
(Mullis et al, 1986) brachte sehr schnell eine Reihe von Technologien hervor, die Möglichkeiten zur
schnellen auf DNA basierender Diagnostik boten. Ein Längenpolymorphismus des PCR-Fragmentes
(Beimfohr et al., 1997) aufbauend auf Primer komplementär zur Mosaikstruktur des Histidin-
Biosynthese-Operons (Delorme et al., 1994) erlaubte zum ersten Mal eine zuverlässige Identifikation
der Art. Stammspezifische Identifikationssysteme konnten jedoch nicht auf der Basis solcher Gene
entwickelt werden.
Die genetische Identifikation von einzelnen Bakterienstämmen erfolgte über Fingerprinting-Techniken
wie die Random Amplified Polymorphic DNA (Welsh et al., 1991; Power et al., 1996), die auch für
Lactococcen in Starterkulturen (Erlandson et al., 1997) oder zur Identifikation von potentiell
probiotischen Stämmen eingesetzt wurde (Roy et al., 2000, Kullen et al., 2000). Weiterhin fand die
Methode der Amplified Fragment Length Polymorphism Anwendung (Vos et al., 1995). Darüber
hinaus hat es die DNA-Sequenzierung ermöglicht, die Phylogenie in vielen schwierigen
taxonomischen Gruppen aufzuklären.
Ergänzt werden diese Techniken durch Detektionsverfahren spezieller Eigenschaften wie die Nisin-
Produktion durch DNA-Sonden (Meghrous et al., 1999). Vergleichend hierzu stehen die in der Regel
aufwendigeren und zudem weniger sensitiven Untersuchungen wie die Analyse von Proteinprofilen
über SDS-PAGE (Pot et al., 1994), die Zusammensetzung der Fettsäuren der Zellmembranen (Welch
et al., 1991) oder Agglutinationstests (Annuk et al., 2001).
1. Einleitung 15
1.4 Genomische Unterschiede
Innerhalb der mikrobiellen Diagnostik ist es von entscheidender Bedeutung nicht nur Gattungen und
Arten, sondern ebenfalls Stämme voneinander unterscheiden zu können. Es muss jedoch angemerkt
werden, dass es keine einheitliche Konvention gibt, die bestimmt, wie viel genomischer Homologie
notwendig ist, um zwei Mikroorganismen dem gleichen Taxon zuzuordnen. Jedoch gelten
Homologiewerte über 70% als Hinweis, dass zwei verschiedene Stämme zur gleichen Art gehören.
Werte von über 20 bis 30 Prozent gelten als Argument dafür, dass zwei Mikroorganismen
wahrscheinlich der gleichen Gattung angehören (Madigan et al., 2000). Vergleichende bakterielle
Genomanalysen haben gezeigt, dass sogar Isolate desselben Bakterienstammes signifikante
Unterschiede in ihrem Geninhalt und Stämme einer Art Unterschiede in ihrer Genkonstellation von bis
zu 20% aufweisen können (Boucher et al., 2001).
Um jedoch alle Übereinstimmungen zwischen zwei Stämmen eindeutig identifizieren zu können, muss
auf die Sequenzierung des gesamten Genoms des verwandten Stammes zurückgegriffen werden. Diese
Vorgehensweise hat sich in einigen Fällen als fruchtbar erwiesen, aber solche Projekte benötigen
substantielle Unterstützung. Zudem gibt es vorher nur ein geringes Wissen über die Natur oder die
Menge an Unterschieden, die letztendlich gefunden werden würden. Zum Beispiel belegte eine
Sequenzierung und der Vergleich der Genome von Escherichia coli K12, einem nicht-pathogenen
Stamm, und E. coli O157:H7 EDL-933, einem enterohemorrhagischen Stamm, die genetische
Grundlage für die unterschiedlichen Lebensweisen der beiden Stämme (Blattner et al., 1997, Perna et
al., 2001 und Hayashi et al., 2001).
Es wurden weiterhin zwei Stämme von Helicobacter pylori sequenziert, wobei wesentliche
Unterschiede festgestellt werden konnten (Alm et al., 1999 und Tomb et al., 1997). Diese Studien
zeigen die Bedeutung von Sequenzinformationen von mehr als nur einem Isolat nahe verwandter
Stämme. Unter Berücksichtigung der großen Anstrengungen für komplette Genomsequenzierungen,
stellt sich eine Methode zur gezielten Identifikation von Unterschieden als besonders vorteilhaft dar.
Üblicherweise besteht die dominante Quelle der genomischen Variation aus Insertionen oder
Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen (Perna et al., 2001, Lawrence et al., 1997). Solche
Unterschiede lassen sich identifizieren, wenn die kompletten Genome durch Hybridisierung
miteinander verglichen werden. Im Verfahren der Genomsubtraktion wird die DNA eines
Bakterienstammes von der eines zweiten abgezogen, um stammspezifische Sequenzen zu
identifizieren. Hierbei werden die Genome zweier Bakterienstämme miteinander vermischt. Nach dem
einleitenden Aufschmelzen der DNA bilden homologe Bereiche der beiden Genome Hybride aus,
während stammspezifische Sequenzen als Einzelstränge erhalten bleiben und isoliert werden können.
Die Methode der Genomsubtraktion wurde in der Mitte der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts eingeführt
und kontinuierlich weiterentwickelt. Heute wird sie üblicherweise unter der Bezeichnung „Subtraktive
Hybridisierung“ dargestellt. Aufgrund der Komplexität der Technik soll im folgenden die Entwicklung
bis zum heutigen Tag dargestellt werden.
16 1. Einleitung
1.5 Technische Entwicklung der Subtraktiven Hybridisierung
Die Subtraktive Hybridisierung bezeichnet als Methodik des „Differentiellen Screenings“ ursprünglich
die Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen unter regulatorischen Prozessen wie
Zelldifferenzierung, Embryonalentwicklung oder Krebsentstehung. Es handelt es sich bei der
Subtraktionshybridisierung um eine Methode für die schnelle Isolierung verschieden distribuierter
Nukleinsäuren (differentiell exprimiert, differentiell präsent oder differentiell geordnet in zwei oder
mehr Quellen: verschiedene Zellen, Zellpopulationen oder Zelltypen, unterschiedliche Gewebe,
Erkrankungen oder Entwicklungsstadien). Neben der Analyse differentiell exprimierter Gene stellt die
vergleichende Genomanalyse einen wichtigen Anwendungsbereich dar: Den Vergleich von
verschiedenen Bakterienstämmen, die Analyse von Deletionsmutanten oder den Vergleich komplexer
Genome.
Es wurden zahlreiche Variationen der Subtraktiven Hybridisierung entwickelt. Die Grundlage sind in
allen Fällen Nukleinsäuren einer ersten Quelle (Tester), die spezifische Sequenzen enthalten (Target),
die durch den Vergleich mit Nukleinsäuren der zweiten Quelle (Driver) extrahiert werden sollen. Alle
Formen der Subtraktionshybridisierung beruhen auf dem Schmelzen und Hybridisieren von einer
Mischung aus Tester- und Driver-DNA-Fragmenten mit anschließender Amplifikation von Tester-
spezifischen (Target-) Sequenzen. Je nach verwendetem System können so bis zu 96% der
genomischen Unterschiede detektiert werden (Townsend et al., 1998 und Sawada et al., 1999).
Ursprünglich wurde die Subtraktive Hybridisierung (SH) zur Analyse gewebespezifischer
Genexpression entwickelt (Davis et al., 1984 und Hendrick et al., 1984). Die sich anschließende
methodische Weiterentwicklung betraf überwiegend die Entfernung der unerwünschten Hybride aus
den Hybridisierungsansätzen. DNA/RNA-Hybride wurden durch Hydroxyl-Apatit-Chromatographie
entfernt (Hendrick et al., 1984, Davis et al., 1984), wobei ein 1000facher Überschuss von Subtraktor-
DNA1 verwendet wurde. Durch die Unfähigkeit der Methode zwischen einzelsträngiger Proben und
Subtraktor-DNA diskriminieren zu können, wurden Markierungen in der Subtraktor-DNA, häufig
durch Biotinilierung, eingesetzt. Nach Reaktion mit Streptavidin konnte sie durch Cupric-
Iminodiaceticacid-Chromatographie (Welcher et al., 1986) oder durch Phenol/Chloroform-Extraktion
entfernt werden (Sive und St. John, 1988, Bjourson et al., 1992). Eine weitere Modifikation stellt hier
die Separation von markierten Subtraktor-Hybriden durch mit Streptavidin beschichtete
Magnetpartikel dar (Townsend et al., 1996, Wassill et al., 1998).
Neben Verfahren bei denen die Hybridisierung in Lösung ablief, wurden bereits früh Möglichkeiten
getestet die Subtraktor-DNA zu immobilisieren, wie an einer epoxy-aktivierten Cellulose-Matrix
(Bjourson und Cooper, 1988). Hier waren noch bis zu 5 Hybridisierungszyklen mit mehr als 100 1 In den Anfängen der „klassischen“ Subtraktiven Hybridisierung besitzen die eingesetzten Nukleinsäuren der beiden Quellen
eine andere Nomenklatur als in später entwickelten Systemen. Der Begriff Subtraktor wird als Synonym für Driver, Probe für
Tester verwendet. Für ein besseres Verständnis wird neben dieser Begriffstrennung auf weitere innerhalb der
Entwicklungsgeschichte eingeführte Bezeichnungen verzichtet.
1. Einleitung 17
Waschschritte notwendig, um spezifische Fragmente zu erhalten. Der Vorteil ist darin zu sehen, dass
auf eine Markierungsreaktion der Subtraktor-DNA verzichtet werden kann. Eine Weiterentwicklung
mit Immobilisierung in Mikroplatten (Zwirglmaier et al., 2001) reduzierte den Aufwand auf eine
einzige Hybridisierung.
Um eine Anreicherung der gewünschten Fragmente zu ermöglichen, wurde eine Ligation von
Adaptoren an die Fragmentpopulation eingeführt (Straus et al., 1990). Hierdurch konnte das
Ausgangsmaterial, bei Vorliegen nur geringer DNA-Mengen, vervielfacht werden. Weiterhin konnten
die nur in sehr geringen Mengen vorhandenen stammspezifischen Fragmente vor der Auswertung
amplifiziert werden. Nachteilig bei den bis zu diesem Zeitpunkt vorliegenden Entwicklungen war
jedoch die Notwendigkeit mehrfacher Hybridisierungsschritte, um Hintergrundsignale zu minimieren,
sowie die physikalische Entfernung von Driver-DNA-Hybriden (s. Anhang: Abbildung 1).
Die Entwicklung der Representational Difference Analysis benötigte diese Abtrennung nicht mehr
(Lisitsyn et al., 1993). Innerhalb der RDA wird Tester-DNA an ihrem 5’-Ende mit einem Adapter
versehen und mit einem Überschuss an Driver-DNA gemischt. Nach Hybridisierung werden die
einzelsträngigen Adaptoren über eine PCR-Reaktion aufgefüllt und amplifiziert. Hierbei besitzen
Hybride aus Tester- und Driver-DNA nur an einem Ende einen Adapter, wodurch sie ausschließlich
linear amplifiziert werden. Fragmente mit Adaptoren an beiden Enden werden exponentiel
amplifiziert. Dieses sind entweder Fragmente, die kein Homolog im Driver-Stamm besitzen, also
stammspezifisch sind, oder um Fragmente, die durch Rehybridisierung innerhalb des Tester-Stammes
entstanden sind. Um solche falsch-positiven Fragmente zu entfernen, werden die nun doppelsträngigen
Adaptoren durch Restriktion entfernt und durch neue einzelsträngige Adatoren ersetzt. Es erfolgt eine
neue Hybridisierungsrunde.
Die RDA löste jedoch nicht das Problem von großen Unterschieden in den Anteilen übermäßig
vorhandener mRNA-Spezies. Daher waren immer noch multiple Hybridisierungsrunden notwendig
(Hubank et al., 1994). Zu diesem Zeitpunkt waren das mRNA-Differential-Display (Liang et al., 1992)
und RNA-Fingerprinting durch Arbitrary-Primed-PCR (Welsh, Chada et al., 1992) schnellere
Methoden, um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Beide dieser Methoden hatten jedoch
einen hohen Anteil an falsch-positiven Klonen (Bauer et al., 1994, Sompayrac et al., 1995), der durch
die Anfälligkeit auf hohe Kopienzahlen einiger mRNAs verursacht wurde (Bertioli et al., 1995).
Weiterhin waren sie ungeeignet für Versuche in denen nur wenige Unterschiede zu erwarten waren
(Sompayrac et al., 1995). Während bei der „klassischen“ Subtraktiven Hybridisierung nach einem
fünfstufigen Verfahren eine Anreicherung von 103 erreicht wird, bietet die RDA bereits nach 2 Stufen
eine Anreicherung um den Faktor 105 (Lisitsyn et al., 1993 und 1995).
Weitere Vereinfachungen wurden von Gurskaya (1996) und Diatchenko (1996) eingeführt, wobei die
Suppression PCR (US Patent # 5.565.340) unter Verwendung von „Inverted Terminal Repeats“
Verwendung fand (Siebert et al., 1995, Chenchik et al., 1996). Neben dem Verzicht auf die
physikalische Trennung der homologen DNA-Fragmente und mehrmalige Hybridisierungszyklen wird
18 1. Einleitung
durch das Einfügen eines weiteren Hybridisierungsschrittes der Überfluss einzelner Sequenzen
normalisiert.
Seit der Einführung vor einigen Jahren hat sich die SSH (Suppression Subtractive Hybridization) als
nützliches Werkzeug für differentielle Genexpression erwiesen (Diatchenko et al., 1996). Der Vorteil
der SSH besteht darin, dass sie keinen großen Umfang an speziellem Material benötigt, da die
Methode ausschließlich auf Hybridisierung mit anschließender PCR basiert. Zusätzlich zur Analyse
von differentiell exprimierten Genen wurde die SSH zur Studie von Unterschieden in bakteriellen
Genomen optimiert (Akopyants et al., 1998). Bei den meisten dieser Entwicklungen werden die Tester
und Driver-Fragmente durch Restriktionsendonukleasen erzeugt (Akopyants et al., 1998) im Vergleich
zur mechanischen Scherung durch z.B. Ultraschall (Ferreira et al., 1999).
Auf diesen Entwicklungen aufbauend wurde von der Firma Clontech ein Kit für cDNAs als auch für
genomische Subtraktion entwickelt (Clontech, 2001). Trotz der Vorzüge der SSH haben die SH
(Winstanley, 2002) als auch die RDA (Perrin et al., 1999) ihre Aktualität behalten.
Begleitet wurde die Entwicklung der aktuellen Systeme durch theoretische Analysen über die
Hybridisierungskinetiken (Sverdlov, 1993, Sverdlov et al., 1994, Milner et al., 1995, Ermolaeva et al.,
1996 und Cho et al., 1998) und kritische Analysen (Sverdlov et al., 1993, und Ermolaeva et al., 1996)
bis hin zu theoretischen und praktischen Limitationen innerhalb der SSH (Ji et al., 2002)
Neben computergestützten Simulationen über molekulare Prozesse bei Veränderung von Parametern
innerhalb von Hybridisierungsvorgängen („SUBTRACT“, Ermolaeva et al., 1995) wurde ebenfalls
Software entwickelt, die bei Vorhandensein genomischer Sequenzen eine theoretische Hybridisierung
mit Ausgabe genomischer Unterschiede erlaubt („FindTarget“, Chetouani et al., 2001).
1.6 Ablauf der „Suppression Subtractive Hybridization“ (SSH)
Die genomische DNA vom zu untersuchenden Stamm und einem Referenzstamm wird mit einer
Restriktionsendonuklease in eine Fragmentpopulation mit einer durchschnittlichen Größe von
ungefähr 0,5 kb hydrolysiert. Zwei verschiedene PCR-Adaptoren, die ausschließlich an dem 5’-Ende
der Ziel-DNA binden können (weil ihr eigenes 5’-Ende keine Phosphatgruppe aufweist), werden in
zwei verschiedenen Ansätzen jeweils an die Tester-DNA ligiert („pseudo-double-stranded“
Adaptoren). Die ligierte DNA wird mit einem Überschuss an Driver-DNA (ohne Adaptoren) gemischt
und denaturiert (Abbildung 1).
Während der folgenden Reannealing-Phase bilden Tester-Moleküle, die ebenfalls im Driver-Genom
vorhanden sind, Tester-Driver-Heterohybride, wodurch sie der Fraktion einzelsträngiger Moleküle
entzogen werden (C). In Hinblick auf die Hybridisierungskinetik zweiter Ordnung ist die Effektivität
der im Überschuss vorliegenden Moleküle sehr groß, was zu einer angenäherten Gleichstellung der
Konzentrationen der verschiedenen Typen von Molekülen führt (Driver-Pressing). Zielmoleküle
werden vom „Driver-Pressing“ nicht beeinflusst und verbleibende ss-Tester-Fragmente angereichert
1. Einleitung 19
(A). Da Zielmoleküle Homohybride durch Reassoziation bilden (B) und da Reassoziationprozesse
schneller für Zielmoleküle in hoher Kopienzahl als für seltene Sequenzen stattfinden, werden die
Konzentrationen der Zielmoleküle als ss-Tester angeglichen.
Nach der ersten Phase der Hybridisierung werden die beiden Ansätze miteinander vermischt, um
weitere Reassoziation stattfinden zu lassen. Es wird weitere Driver-DNA zugegeben (D), um
sämtliche Sequenzen der Tester-DNA zu binden, die sich ebenfalls im Driver-Genom befinden.
Verbleibende komplementäre Einzelstränge der Tester-DNA hybridisieren (E). Dieser Vorgang führt
zu der Ausbildung eines neuen Typus von Molekülen, die sich durch die asymmetrische Flankierung
von Adapter 1 an dem einen und Adapter 2 an dem anderen Ende definieren lassen. Die (pseudo-
double-stranded) Adaptersequenzen an ihren 3’-Enden werden aufgefüllt (double-stranded). Mittels
PCR wird Tester-DNA mit unterschiedlichen Adaptoren (E) exponentiell amplifiziert, während die
Amplifikation von Fragmenten mit identischen Adaptoren (B) durch PCR-Suppression (PS-Effekt)
unterdrückt wird. Die Bindung der PCR-Primer wird durch Ausbildung von Haarnadelschleifen (pan-
like structure) inhibiert (Abbildung 1, rechter Abschnitt). Bei der Bildung von DNA-Primer-Hybriden
wird bei Verwendung von Primern, die am äußeren Bereich der Inverted Terminal Repeats (ITR)
binden, durch die DNA-Synthese der Taq-Polymerase die Originalstruktur hergestellt. Auf diese
Weise wird die Überdauerung des Unterdrückungseffektes während der folgenden PCR-Zyklen
gewährleistet. In komplexen Mischungen erlaubt der PS-Effekt die präzise Amplifikation derjenigen
Moleküle, die von verschiedenen Adaptoren flankiert werden (E, asymmetrisch flankierte Moleküle).
Symmetrisch flankierte DNA-Fragmente (B) werden durch die Unterdrückung des Primerannealings
(Lukyanov et al., 1994, Gurskaya et al., 1996 und Diatchenko et al., 1996) im Verhältnis reduziert.
Tester-DNA mit einem Adaptor an nur einer Seite des Fragmentes (C) untersteht einer linearen jedoch
keiner exponentiellen Amplifikation. Auf diese Weise werden bevorzugt Sequenzen von Interesse
angereichert.
20 1. Einleitung
Ligation vonAdaptor 2
Tester DNA mit Adaptor 2Driver DNA (im Überschuss)
Erste Hybridisierungmit Denaturierung
Zweite Hybridisierung ohne Denaturierung
Tester-Tester Homohybride
Tester-Tester Heterohybride
Tester-Driver Heterohybride
ds-Driver
ss-Driver
ss-Tester
Auffüllen der Enden
Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation
Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation
Nested PCR
Tester DNA mit Adaptor 1
Ligation vonAdaptor 1
A A
C C
B B
D D
E
E
Tester DNADriver DNA
EnzymatischerVerdau
A
C
B
DAufschmelzen
“Haarnadel”-Schleife
Elongation
Primer-Annealing
Self-Annealing
erne
uter
PC
R-Z
yklu
s
Abk
ühlu
ng
erne
uter
PC
R-Z
yklu
s
Tester-TesterHomohybride
ITRITR
1. Einleitung 21
Abbildung 1: Generelles Prinzip der Suppression Subtractive Hybridization (modifiziert nach Akopyants et al., 1998): Die SSH beinhaltet als Wesentliches die folgenden Schritte: (1) Aufteilung der Tester DNA in zwei Ansätze und Ligation mit zwei
verschiedenen Adaptoren, (2) Hybridisierung mit einem Überschuss an Driver-DNA, (3) Amplifikation der Fragmente, die über
zwei verschiedene Adaptoren verfügen. Die SSH basiert auf der Unterdrückung der PCR durch lange „inverted terminal
repeats“, die an den Enden der Fragmente lokalisiert sind. Suppression Effekt durch Inverted Terminal Repeats: Nach der Initiation der PCR durch die Denaturierungsphase bilden die einzelsträngigen (ss) DNA-Fragmente flankiert von „Inverted
Terminal Repeats“ (ITR) durch self-annealing Haarnadelschleifen (pan-like structure) aus, wobei die Bindung der Primer an ihre
komplementären Bindungsstellen ausbleibt und die PCR unterdrückt wird.
1.7 Anwendungen von Genomsubtraktionen
Besonders häufig wurden vergleichende Genomanalysen bisher im medizinischen Bereich eingesetzt.
Beispiele zeigen die Identifikation von Virulenzgenen (DeShazer et al., 2001 und Tinsley et al., 1996),
serovarspezifischen Genen (Emmerth et al., 1999) oder neuartigen Restriktions-
Modifikationssystemen (Lin et al., 2001). Neben Antibiotikaresistenzen oder Oberflächenstrukturen
sind die PAIs „pathogenicity islands“ von besonderem Interesse. Mit diesen multigenen Segmenten,
spezifisch für virulente Stämme, kann die Natur von Erkrankungen näher bestimmt werden.
Doch auch wenn die Funktion der unterschiedlichen Regionen unklar ist, kann die Nukleotidsequenz
als diagnostischer Marker für auf DNA basierender Detektion dienen (Agron et al., 2001 und
Radnedge et al., 2001).
Starterkulturen, wie sie in der milchverarbeitenden Industrie eingesetzt werden, sind Mischungen
sorgfältig ausgesuchter Milchsäurebakterien. Sie werden der Milch zugesetzt, um die gewünschte
Fermentation auszuführen. Auf undefinierte Kulturen wird in der Produktion von Milchprodukten
weitestgehend verzichtet, um Variationen in Geschmack und Konsistenz zu vermeiden (Daly et al.,
1996). Die industrielle Bedeutung der Milchsäurebakterien bewirkt somit ein großes Interesse an der
Identifizierung von Stämmen, um eine gleichbleibende Produktstabilität zu gewährleisten und eine
großtechnische Anwendung zu ermöglichen. Innerhalb dieser Arbeit wurde die vorgestellte Methode
der „Suppression Subtractive Hybridization“ anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien
erprobt, um stammspezfische Sequenzabschnitte zu isolieren. Neben der näheren Charakterisierung
der Stämme stand die Entwicklung von stammspezifischen PCR-Systemen im Vordergrund.
22 1. Einleitung
2. Material und Methoden 23
2. Material und Methoden
2.1 Verwendete Bakterienstämme
Die in dieser Arbeit verwendeten Stämme von Lactococcus und von Lactobacillus acidophilus
(Tabelle 1) wurden von der Firma Danisco Cultor Niebüll GmbH2 zur Verfügung gestellt. Die
Lactococcus-Stämme lagen als Milchpulverkultur vor, während die übrigen Stämme in Flüssigmedien
bereitgestellt wurden. E. coli K12 wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen bezogen.
Im Hinblick auf weitergehende Informationen wurde von der Danisco Cultor Niebüll GmbH
mitgeteilt, dass es sich beim Lactococcus Stamm 1760 um eine Nisin-bildende Kultur handelt. Alle
übrigen Kulturen der Gattung Lactococcus werden als Fermentationskulturen für die Herstellung von
Käse verwendet. Weiterhin sind die drei Stämme von Lactobacillus acidophilus eindeutig über AFLP
zu identifizieren.
Tabelle 1: Übersicht über die Herkunft und Eigenschaften der verwendeten Bakterienstämme
Bezeichnung Status/Eigenschaft Herkunft
Stamm 1760 Nisinbildung Danisco
Stamm 1526 Käseherstellung DaniscoStamm 1478 Käseherstellung Danisco
Stamm 1224 Käseherstellung DaniscoStamm 563 Käseherstellung Danisco
Stamm 676 unbekannt DaniscoStamm 770 unbekannt DaniscoStamm 771 unbekannt Danisco
E. coli K12 Laborstamm DSMZ
Lactococcus
Lactobacillus acidophilus
2.2 Kultivierung der Mikroorganismen
Die Wahl der Medien erfolgte nach Angaben der DSMZ3 (s. Anhang: Kulturmedien). Die Anzucht der
Lactococcen-Stämme erfolgte primär im Medium 92 (TRYPTICASE SOY YEAST EXTRACT
MEDIUM). Alternativ wurde das Medium 449 (M17 MEDIUM FOR LACTIC STREPTOCOCCI)
verwendet. Die Wachstumstemperatur betrug 30°C. Zur Anzucht der Lactobacillus acidophilus
Stämme wurde das Medium 11 (MRS MEDIUM) bei 37°C verwendet. E. coli K12 wurde in LB 2 Danisco Cultor Niebüll GmbH, Busch-Johannsen-Straße 1, D-25899 Niebüll, Tel. +49 4661 602-0, Fax + 49 4661 602-107, Wisby, Starter Cultures and Media 3 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany, www.DSMZ.de
http://www.dsmz.de/
24 2. Material und Methoden
(Luria-Bertoni) Medium bei einer Temperatur von 37°C herangezogen. Reinigungsausstriche erfolgten
bei allen Mikroorganismen auf Agarplatten desselben Mediums mit einem Agaranteil von 1,5%. Das
Medium und die herangezogenen Zellen wurden mikroskopisch auf Kontaminationen überprüft.
2.3 DNA-Präparation
Zur Entfernung von Fremd-DNA aus den Kulturmedien (Soja/Hefe) wurden die Zellen vor der DNA-
Isolierung gewaschen. Für diesen Vorgang wurde der Waschpuffer auf die verwendeten
Bakterienstämme kalibriert, um eine Zelllyse und somit den Verlust von DNA zu reduzieren.
(1 – Kalibrierung des Waschpuffers) Aliquots von 1 ml einer hochgewachsenen Kultur wurden auf
1,5 ml Caps verteilt. Durch Zentrifugieren mit 2.000 rpm für 5 min in einer Tischzentrifuge
(Eppendorf centrifuge 5415D) wurden die Zellen pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen und
verworfen. Das Pellet wurde mit Waschpuffer unterschiedlicher Konzentrationen überschichtet und
resuspendiert (ROTAMIX RM1, ELMI). Nach erneutem Zentrifugieren wurde eine Probe des
Waschpuffers genommen und direkt zur Nukleinsäurebestimmung eingesetzt. Hierbei wurde das
Photometer jeweils mit Waschpuffer der verwendeten Konzentration kalibriert. Es folgte eine
mikroskopische Untersuchung der Zellen auf Unversehrtheit.
(2 – Waschen der Zellen) Die Zellen einer herangewachsenen Kultur wurden zweimal in 1 Vol.
eiskaltem TE+NaCl [10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0] (Agron et al., 2002)
gewaschen. Alternativ wurden andere Puffer mit 150 mM NaCl wie 1x TBS [100 mM Tris-HCl / 0,9%
(w/v) (150 mM) NaCl / pH 7,5] verwendet. Die gewaschenen Zellen wurden in Mengen zu 0,1 g
Feuchtgewicht portioniert und bei –20°C gelagert.
(3 – Präparation genomischer DNA) Die Präparation der genomischen DNA erfolgte mit
Modifikationen nach der Anleitung „Miniprep of bacterial genomic DNA“ (current protocolls in
molecular biology, chapter 2.4.1) von Flamm et al. (1984) unter Anpassung an die Verwendung von
gram-positiven Bakterien. Je 100 ml der gesättigten Übernacht-Kultur wurden für 10 min bei 2.000
rpm bei 4°C zentrifugiert bis ein kompaktes Pellet erzielt wurde (Sorvall® RC-5B Refrigerated
Superspeed Centrifuge, Du Pont Instruments, Sorvall® GSA Rotor, Du Pont Instruments). Der
Überstand wurde verworfen und das Pellet zweimal gewaschen. Die Zellen wurden in TE-Puffer
resuspendiert, so dass 0,1 g Feuchtgewicht in einem Gesamtvolumen von 486 µl vorlagen. Die
Lagerung erfolgte bei –20°C (alle Zellen wurden vor der DNA-Präparation einem einmaligen
Gefrierzyklus ausgesetzt). Die DNA-Präparation erfolgte in 2 ml Eppendorf-Caps. Es wurden 69 µl
Lysozym/TE-Lösung (20 mg/ml; 118.200 E/mg) zu einer endgültigen Konzentration von 2,5 mg/ml
zugegeben und nach Durchmischung bei 37°C für 45 min inkubiert.
Das Zellmaterial wurde gevortext bis die Suspension zähflüssig war und nach mikroskopischer
Kontrolle des Zellaufschlusses 30 µl SDS (10%) und 15 µl Proteinase K (20 mg/ml) zur
2. Material und Methoden 25
Endkonzentration von 500 µg/ml Proteinase K und 0,5% SDS zugegeben. Der Ansatz wurde gemischt
und für 15 min bei 60 °C in einem Wasserbad inkubiert.
Nach Zugabe von 100 µl 5 M NaCl (auf eine Endkonzentration von 713 mM NaCl sowie einem
Volumen von 700 µl) und gründlichem Mischen wurden 80 µl CTAB/NaCl [10% (w/v) CTAB / 0,7 M
NaCl] hinzugefügt. Nach erneutem Mischen wurde der Ansatz für 10 min bei 65 °C inkubiert.
Es wurde ein Volumen (700 – 800 µl) Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben und durch
kräftiges Vortexen gemischt. Der Ansatz wurde bei maximaler Drehzahl für 5 min in einer
Tischzentrifuge (Eppendorf Zentrifuge 5415D) abzentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde ohne
Interphase in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Zur weiteren Reinigung der genomischen DNA
erfolgte eine Phenol-Extraktion. Die obere, wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt, der
Ansatz mit 0,6 Volumen kaltem Isopropanol versetzt, durch mehrmaliges Umkehren des
Reaktionsgefäßes gemischt und kurz zentrifugiert (1 min), um die präzipitierten Nukleinsäuren zu
pelletieren. Der Überstand wurde quantitativ entfernt und das Präzipitat wurde mit 1000 µl Ethanol
(70%, RT) versetzt, gemischt und für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das
Pellet luftgetrocknet (alternativ 3min vakuumgetrocknet). Das Pellet wurde in 200 µl TE-Puffer 10:0,1
gelöst.
Zur Hydrolyse der verbliebenden RNA wurde RNase A zu einer Endkonzentration von 0,4 mg/ml
zugegeben und für 45min bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Phenol/Chloroform-
Extraktion und eine photometrische Konzentrationsbestimmung. Die Qualität der isolierten DNA
wurde durch elektrophoretische Auftrennung auf einem 1%igen Agarosegel überprüft.
2.4 „Suppression Subtractive Hybridization“
Die „Suppression Subtractive Hybridization“ wurde mit Modifizierungen nach N. S. Akopyants et
al. (1998) durchgeführt.
2.4.1 Oligonukleotide
Die folgenden (HPSF gereinigt, MALDI dokumentierten) Oligonukleotide wurden für die
Subtraktionshybridisierung verwendet: Adaptor 1, 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC
GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3´ (44 nt); Adaptor 2, 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA
GGG CAG CGT GGT CGC GGC CGA GGT-3´ (42 nt); P1x, 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA
GGG C-3´ (22 nt) (Dieser P1x PCR-Primer bindet an die 5’-Bereiche von Adaptor 1 und 2); NP1, 5´-
TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGG T-3´ (22 nt); NP2, 5´-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT-
3´ (20 nt) (Die NP1 und NP2 nested PCR-Primer binden an die inneren 3’-Bereiche der Adaptoren 1
und 2). Die verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma Sigma-ARK (Darmstadt) sowie von
MWG-Biotech (Ebersberg) bezogen.
26 2. Material und Methoden
2.4.2 Vorbereitung der Driver- und Tester-DNA
(1 – Theoretische Analyse zur Restriktion)
Innerhalb der SSH werden Fragmentgrößen von durchschnittlich 500 bp benötigt (Akopyants et al.,
1998). Die Hydrolyse des Genoms sollte daher Fragmente in der Größe zwischen 100 bp und 2000 bp
produzieren (Clontech, 2001).
Zur Analyse der Genome in Hinblick auf potentiell verwendbare Restriktionsendonukleasen wurde
das Computerprogramm pDRAW324 1.0 revision 1.1.45 von Kjeld Olesen verwendet. Folgende
sequenzierte Genome wurden für die theoretischen Analysen eingesetzt: Die Genomsequenzen von
Lactococcus lactis subsp. lactis, Escherichia coli K12 und dem Bakteriophagen Lambda wurden von
NCBI5 bezogen. Die unvollständige Sequenz von Lactobacillus gasseri ATCC33323 stammte von
JGI6 (Tabelle 2).
(2 – Restriktionshydrolyse des Genoms) Zwanzig Mikrogramm der Tester- und Driver-DNA
wurden jeweils vollkommen mit 20 Units von RsaI (New England Biolabs) für 16 h in einem 125 µl
Reaktionsvolumen unter zeitgleichem Einsatz von RNase A (EK: 80 µg/ml) hydrolysiert. Der parallele
Einsatz von RNase dient der vollständigen Hydrolyse verbliebener Spuren von RNA, die die SSH
ansonsten beeinflussen könnte. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms (20 min bei 65°C),
Phenol/Chloroform Aufreinigung und Ethanolfällung wurde die DNA in TE resuspendiert. Die
angestrebte Konzentration betrug 600 ng/µl.
(3 – Adapterligation) In zwei getrennten Reaktionsansätzen (jeder in einem Gesamtvolumen von 10
µl) wurden der Tester-DNA (jeweils 120 ng) 2 µl der Adaptoren 1 oder 2 (2 µM Endkonzentration)
bei 16°C über Nacht anligiert. Hierfür wurde 1 µl T4 DNA Ligase (MBI Fermentas, 5U/µl) im Puffer
des Herstellers (mit 10% (v/v) 50% PEG 4000) verwendet. Nach der Ligation wurde 1 µl einer 0,2 M
EDTA-Lösung (pH 8.0) zugegeben und die Ligase für 15 min bei 65°C hitzeinaktiviert. Die Proben
wurden bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.
Tabelle 2: Übersicht zur Herkunft genomischer Sequenzen.
Bezeichnung RefSeq GenBank Bezug
Lactococcus lactis subsp. lactis NC_002662 AE005176 NCBIEscherichia coli K12 NC_000913 U00096 NCBI
Bacteriophage Lambda NC_001416 NCBILactobacillus gasseri ATCC33323 JGIunvollständig/unveröffentlicht
4 pDRAW32 1.0 revision 1.1.45; Kjeld Olesen / AcaClone Software; E-mail: acaclone@hotmail.com; Updated executables may be downloaded from: http://www.geocities.com/acaclone, http://home.get2net.dk/acaclone, http://mibi1.uni-
muenster.de/acaclone, http://medlem.tripodnet.nu/acaclone. 5 National Center for Biotechnology Information, http://www2.ncbi.nlm.nih.gov 6 These sequence data were produced by the US Department of Energy Joint Genome Institute http://www.jgi.doe.gov/, Mikrobielle Genomsequenzen: ftp://ftp.jgi-psf.org/pub/JGI_data/Microbial/
mailto:acaclone@hotmail.comhttp://www.geocities.com/acaclonehttp://home.get2net.dk/acaclonehttp://mibi1.uni-muenster.de/acaclonehttp://mibi1.uni-muenster.de/acaclonehttp://medlem.tripodnet.nu/acaclonehttp://www2.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.jgi.doe.gov/ftp://ftp.jgi-psf.org/pub/JGI_data/Microbial/
2. Material und Methoden 27
2.4.3 Subtraktive Hybridisierung
Ein Mikroliter der Driver-DNA (600 ng) wurde zu 1 µl (12 ng) jeder der Adapter-ligierten Tester-
DNA (Verhältnis 50:1) gegeben. Ein Mikroliter des 5x Hybridisierungspuffers [2,5 M NaCl / 25 mM
Hepes / 1 mM EDTA / pH 8.3] wurde zu jedem Ansatz gegeben, das Volumen mit Wasser auf 5µl
aufgefüllt, mit 10 µl Mineralöl überschichtet und die DNA denaturiert (1,5 min, 98°C). Die
Hybridisierung erfolgte für 1,5 h bei 65°C. Nach dieser ersten Hybridisierung wurden die beiden
Proben (die erste mit Adaptor 1, die zweite mit Adaptor 2) kombiniert, bei Bedarf7 300 ng zusätzlicher
hitzedenaturierter Driver-DNA in 1x Hybridisierungspuffer im Volumen von 3 µl zugegeben, und die
Probe für weitere 14 h bei 65°C inkubiert. Es erfolgte keine zusätzliche Denaturierung. Der 10 – 13 µl
Ansatz wurde mit vorgewärmten (65°C) Dilutionspuffer [50 mM NaCl / 5 mM Hepes / 0,2 mM EDTA
/ pH 8.3] im Verhältnis von 1/10 bis 1/20 verdünnt und für weitere 20 min auf 65°C erhitzt. Nach
Abkühlung auf Eis erfolgte der sofortige Einsatz in die PCR (2.4.4 Auswertende Suppression- und
Nested-PCR). Die weitere Lagerung erfolgte bei –20°C.
2.4.4 Auswertende Suppression- und Nested-PCR
(1 – Suppression-PCR) Es wurden zwei sequenzielle PCRs durchgeführt. In der ersten PCR wurde 1
µl der verdünnten, genomischen DNA aus dem Hybridisierungsansatz als Template eingesetzt (0,2 U
Taq-Pol, 0,8 µM P1x, 100 µM dNTP, 1xPCRPuffer (1,5 mM Mg2+), 15 µl RV). Der mit Mineralöl
überschichtete Ansatz wurde auf 72°C erhitzt, die Polymerase als Hot-Start zugegeben, und für 5 min
bei 72°C inkubiert. Anschließend wurde das folgende PCR-Programm durchgeführt: (1) 72°C – 5 min,
(2) 94°C – 2 min, (3) 10x: 94°C – 30 sec, 56°C – 30 sec, 72°C – 1 min, (4) 15x: 94°C – 30 sec, 56°C –
30 sec, 72°C – 1 min + 10 sec je Zyklus, (5) 72°C – 7 min, (6) 4°C - ∞.
Nach Ablauf der PCR wurde das Reaktionsvolumen mit 15 µl eines PCR-Mastermixes (identische
Verhältnisse) auf 30 µl aufgefüllt und das PCR-Programm erneut, jedoch ohne beginnende Inkubation
bei 72°C, durchgeführt.
(2 – Nested-PCR) Die amplifizierten Produkte wurden auf Eis abgekühlt, zwanzigfach in TE-Puffer
(nach Abnahme von 8 µl zur späteren Analyse) verdünnt und jeweils 1 µl der verdünnten Probe in der
zweiten PCR eingesetzt. Als Primer wurden die Oligonukleotide NP1 und NP2 eingesetzt (identische
Bedingungen: 0,4 µM NP1, 0,4 µM NP2, 15 µl RV) und das folgende PCR-Programm durchgeführt:
(1) 94°C – 2 min, (2) 11x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1min 10 sec, (3) 72°C – 7 min, (4)
4°C - ∞.
Von den Produkten der ersten und zweiten PCR wurden jeweils ca. 7 µl auf einem 1,5%igen
Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die zweite PCR wurde bei einem verwendbaren
7 Die Zugabe der zusätzlichen 300 ng Driver-DNA ist nicht dringend erforderlich. Bei einer zu hohen Anzahl falscher Signale
kann der Versuch mit zusätzlicher Driver-DNA wiederholt werden.
28 2. Material und Methoden
Hybridisierungsmuster im größeren Volumen wiederholt, um ausreichende DNA-Mengen für weitere
Versuche vorliegen zu haben. Hierfür wurde 1 µl des PCR-Produktes (Verdünnung 1/20) der Nested-
PCR als Template eingesetzt.
2.4.5 Effizienzkontrolle mittels Lambda-Phagen/Escherichia coli Hybridisierung
Es wurde RsaI hydrolysierte genomische DNA von E. coli K12 und Lambda in einem Verhältnis
gemischt, so dass die Lambda-DNA einen Anteil (gemäß ihrer Größe von 48502 bp) 1% des E. coli
Genoms (4.634.815 bp) ausmachte. Hierfür wurden 118,7 ng E. coli K12 (RsaI hydrolysiert) mit 1,3
ng Lambda DNA (RsaI hydrolysiert) versetzt und die Ligation der Linker durchgeführt. Es wurden die
Hybridisierungsansätze „(E. coli + Lambda) – E. coli“ sowie „(E. coli + Lambda) – (E. coli +
Lambda)“ nach beschriebenem Schema durchgeführt.
2.5 Standard-Methoden zur Auswertung innerhalb der „Subtractive Suppression
Hybridization“ (SSH)
2.5.1 Klonierung von PCR-Fragmenten durch TA-Cloning
(1 – Präparation des Vektors) Die Klonierungseffizienz wurde durch die Generierung für TA-
Cloning geeigneter Enden an dem EcoRV hydrolysierten Vektor (blunt-end) gesteigert.
Innerhalb der auswertenden PCRs und der abschließenden Inkubation bei 72°C für 7 min der Nested-
PCR wurde an das 3’-Ende der Fragmente ein zusätzliches templateunabhängiges A durch die Taq-
Polymerase angefügt. Durch das Anfügen eines einzelnen T an die Blunt-Ends des Vektors wurden
komplementäre Basenüberhänge geschaffen.
Es wurden 5 µg des Vektors pIC19H mit 30 U des RE EcoRV (MBI Fermentas) in einer 70 µl
Reaktion hydrolysiert. Einhundert ng der Restriktion wurden elektrophoretisch auf seine
Vollständigkeit überprüft. Nach Phenol/Chloroformextraktion und Ethanolfällung wurde die DNA in
25 µl TE-Puffer aufgenommen. Die T-Additions-Reaktion lief über 2 h bei 75°C (5 µg blunt-ended
Vektor-DNA, 1 mM dTTP, 5U Taq-Polymerase, 1x PCR-Reaktionspuffer, 3,5 mM Mg2+, 100 µl RV).
(2 – Ligation in den Vektor pIC19H8) Es wurden 160 ng Vektor pIC19H (EcoRV hydrolysiert; T
Addition) mit der dreifach molaren Menge an Insert (ungefähr 88 ng Fragmente der Nested-PCR mit
einer durchschnittlichen Länge von ~500 bp) in einem Reaktionsvolumen von 10 µl unter
Verwendung von 1 µl T4 DNA Ligase (MBI Fermentas, 5U/µl) im Puffer des Herstellers (mit 10%
(v/v) 50% PEG 4000) für 16 h bei RT ligiert.
8 pIC 19H: 2701 bp großer Klonierungsvektor mit der Multiple Cloning Site in dem lac Z-Gen unter Kontrolle des lac-Promotors, AmpR
2. Material und Methoden 29
(3 – Transformation in E. coli JM1099) Es wurden 100 µl kompetenter Zellen von E. coli JM109
mit der zu transformierenden DNA (10 µl Ligationsansatz bzw. 160 ng Plasmid-DNA) gemischt und
für 30 min auf Eis gestellt. Danach wurden die Bakterien für 2 min auf 42°C (Hitzeschock) gestellt, 1
ml LB-Medium dazugegeben und für 60 min bei 37°C inkubiert. Das Bakterienpellet wurde nach
Zentrifugieren bei 2.000 rpm für 2 min und Abnahme von 1 ml Überstand in den verbleibenden 100 µl
resuspendiert und auf einem selektiven Medium zum Blau/Weiß-Screening [0,1 mg/ml / 1 mM IPTG /
0,05 mg/ml X-Gal] ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
2.5.2 Kolonie-Screening zur Identifikation gewünschter Fragmentgrößen
In die PCR-Reaktionsgefäße wurden jeweils 15 µl eines PCR-Mastermix [0,2 U Taq-Pol, 0,4 µM
NP1, 0,4 µM NP2, 100 µM dNTP, 1x PCRPuffer (1,5 mM Mg2+), 15 µl RV] vorgelegt. Mit einer
sterilen Kristall-Pipettenspitze wurden Zellen aus einer Kolonie auf einen definierten Punkt einer
Agarplatte (Replikat) und anschließend weiter in ein PCR-Reaktionsgefäß mit PCR-Mastermix
übertragen [(1) 94°C – 2 min, (2) 25x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min 10 sec, (3) 72°C –
5 min, (4) 4°C – ∞]. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch
aufgetrennt. Das Replikat wurde bei 37°C inkubiert. Die übertragenen Kolonien wurden innerhalb der
folgenden 6 bis 8 Stunden sichtbar und konnten am selben Tag weiter verwendet werden, um weitere
Reinigungsausstriche anzufertigen. Hiervon wurden Kulturen für Plasmid-Präparationen angelegt.
2.5.3 Präparation von Plasmid-DNA (Minipräparation) durch alkalische Lyse
Präparation von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse wurde nach Birnboim und Doly (1979)
durchgeführt. Das Pellet von 1,5 ml Bakterienkultur wurde in 150 µl Lösung I [50mM Glucose / 25
mM Tris / 10 mM EDTA] (alternativ TE oder H2O) resuspendiert, 150 µl Lösung II [0,2 N NaOH /
1% (w/v) SDS] (haltbar bis max. 4 Wochen) zugegeben, gut gemischt und für 30 sec. inkubiert, bis die
Bakterien lysiert waren – erkennbar an der schleimigen Konsistenz der Lösung. Anschließend wurde
150 µl Lösung III [3M Kaliumacetat pH 5,2] [60 ml 5 M Kaliumacetat / 11,5 ml Essigsäure p.a. und
28,5 ml H2O] (alternativ 3 M Natriumacetat pH 4,8) zugegeben und nochmals gründlich gemischt.
Nachdem die Lösung wieder klar war, wurden zwei Tropfen Chloroform zugegeben, wodurch die
Kalium-SDS-Flocken besser pelletieren können, gemischt und für 2 bis 5 min bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Der klare Überstand (ca. 400 µl) wurde in ein neues Gefäß überführt, 1 ml Ethanol
zugegeben, gemischt und für 10 bis 15 min bei 4°C bei 15000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde
getrocknet (SpeedVac concentrator, Savant / RVC 2-18, Christ) und in 50 bis 100 µl TE + 1 bis 2 µl 9 JM 109 e14-(mcrA-) recA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (rk- mk+) supE44 relA1 Δ(lac-proAB) (F´traD36 proAB lacIqZΔM15) (YANISCH-PERON et al., 1985)
30 2. Material und Methoden
RNase A (10 mg/ml) gelöst. Es folgte eine Inkubation für 30 min bei 37°C und eine anschließende
Phenol/Chloroform-Reinigung mit Alkoholfällung. Bei Verwendung in Sequenzierungsreaktionen
wurde die DNA abschließend in Wasser anstelle von TE aufgenommen. Alternativ wurde das High
Pure Plasmid Isolation Kit von Roche verwendet.
2.5.4 Blot-Analysen zur Identifikation stammspezifischer Sonden
2.5.4.1 Herstellen eines DIG-markierten PCR-Produktes als Sequenzsonde
Die Arbeiten mit DIG-11-dUTP wurden nach den Richtlinien des DIG Application Manuals von
Roche durchgeführt. Bei der Markierung mittels PCR wurde das DIG-dUTP im molaren Verhältnis
von 1:4 zum dTTP eingesetzt [10 pg Plasmid-DNA, 0,25 µM NP1, 0,25 µM NP2, 40 µM dNTP, 10
µM DIG-dUTP, 1x PCR-Puffer (1,5 mM Mg2+), 0,2 U Taq-Pol, 25 µl RV], [(1) 94°C – 2 min, (2) 10x:
94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min, (3) 15x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min + 10
sec je Zyklus, (4) 72°C – 7 min, (6) 4°C - ∞]. Zusätzlich wurde eine Kontroll-PCR ohne DIG-dUTP
durchgeführt. Beide Produkte wurden elektrophoretisch verglichen, um den Einbau des modifizierten
Nukleotids über das langsamere Laufverhalten bestätigen zu können. Die Aufreinigung des DIG-
markierten PCR-Produktes zum Entfernen nicht inkorporierter Nukleotide erfolgte durch Ethanol-
Fällung oder durch Aufreinigung mittels eines PCR-Purification-Kits (High Pure PCR Product
Purification Kit, Roche). Die Sonde wurde bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
2.5.4.2 Herstellen eines Biotin-markierten PCR-Produktes als Sequenzsonde
Zur Erstellung von Biotin-markierten Sonden wurden folgende biotinilierte M13-Primer verwendet:
M13 F-Biotin* 5`- ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG –3´, M13 Rev-Biotin * 5`- CAC
ACA GGA AAC AGC TAT GAC –3´ unter den Reaktionsbedingungen [1 ng Plasmid-DNA, 0,2 U
Taq-Pol, 0,4 µM M13F-Biotin, 0,4 µM M13Rev-Biotin, 100 µM dNTP, 1x PCRPuffer (1,5 mM
Mg2+), 25 µl RV] und dem PCR-Programm [(1) 94°C – 2 min, (2) 10x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec,
72°C – 1 min, (3) 15x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min + 10 sec je Zyklus, (4) 72°C – 7
min, (6) 4°C - ∞]. Die Markierung mit biotinilierten Nested-Primern (NP1, NP2) verlief unter
identischen Bedingungen. Die Aufreingung erfolgte über ein PCR-Purification-Kit (High Pure PCR
Product Purification Kit, Roche). Die Sonde wurde bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
2. Material und Methoden 31
2.5.4.3 Überprüfung der Markierungseffizienz der Sonde
Von dem DIG-markierten PCR-Produkt wurden Verdünnungen von 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000,
1:5000 auf die Nylonmembran aufgetragen, getrocknet und UV-fixiert. Von einem markierten
Standard (Roche) wurde eine vergleichbare Verdünnungsreihe aufgetragen. Die erstellte Membran
wurde einem verkürzten Detektionsverfahren unterzogen: 2 min Blockierungslösung (20 ml) [1%
(w/v) blocking reagent in Puffer 1], 3 min Blockierungslösung mit Antikörpern gegen DIG (0,375 U
in 10 ml Blockierunglösung), 1 min Blockierungslösung (10 ml), 1 min Waschen in 10 ml Puffer 1
[100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5], 1 min Äquilibrieren in 10 ml Puffer 3 [100 mM
Tris/HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5], Zugabe von 2 ml Färbe-/Substratlösung
(BCIP/NBT). Der Ansatz wurde für 30 min dunkel inkubiert.
2.5.4.4 Southern-Blot
Southern-Blots wurden nach Angaben der Current Protocols in Molecular Biology durchgeführt
(Section IV, Unit 2.9A, Southern Blotting onto a nylon or nitrocellulose membrane with high-salt
buffer, basic protocol). Es wurden jeweils 5 µg der genomischen DNA von den zu kontrollierenden
Stämme in einem Volumen von 20 µl mit demjenigen Restriktionsenzym geschnitten, mit dem auch
die Fragmente für die Subtraktionshybridisierung erstellt wurden. Restriktionsenzyme wurden nach
den Instruktionen des Herstellers verwendet (10 U je 5 µg DNA). Die Hydrolyse erfolgte über Nacht.
Die Fragmente wurden mit 6fach AP versetzt und auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisch
aufgetrennt. Nach der Videodokumentation folgte die Denaturierung der Nukleinsäuren. Das
Agarosegel wurde für 15 min in 100 ml 0,25 M HCl, für 30 min in 100 ml Denaturierungslösung [0,5
N NaOH / 1,5 M NaCl], und für 60 min in 100 ml Neutralisationslösung [0,5 M Tris/HCl / 3 M NaCl /
pH 7.5] geschwenkt, wobei nach 30 min der Puffer getauscht wurde. Die Nukleinsäuren im Gel
wurden durch Kapillar-Blot mit Hochsalzpuffer (20x SSC) auf eine Nitrocellulose-Membran
(OPTITRAN BA-S85, reinforced NC, Schleicher & Schuell) übertragen: Die Nitrocellulosemembran
wurde mit destilliertem Wasser angefeuchtet und für 10 min in 20x SSC belassen bevor sie auf die
Oberfläche des Agarosegels gelegt wurde. Der Transfer verlief über Nacht. Die DNA auf der
Membran wurde nach kurzem Spülen mit 2x SSC durch UV-Crosslinking fixiert. Hierfür wurde die
leicht feuchte Membran für 3 min mit UV-Licht (312 nm) bestrahlt (Typ W-IL-200-M, Bachhofer
GmbH, Reutlingen). Die Membran wurde anschließend direkt in der Hybridisierung eingesetzt oder
luftdicht bei 4°C aufbewahrt.
32 2. Material und Methoden
2.5.4.5 Hybridisierung
Sondenhybridisierungen wurden mit leichten Modifikationen nach Angaben des DIG Application
Manual for Filter Hybridization durchgeführt (Roche Molecular Biochemicals, 2000). Für die
Prähybridisierung wurde die Membran zusammen mit der Hybridisierungslösung (20 ml pro 100cm2
Membran) [1% (w/v) Blocking-Reagent in Puffer 1] in einem Plastikbeutel eingeschweißt. Die
Inkubation erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln zum Abdecken
unspezifischer Bindungsstellen. Die gereinigte Sonde (2 µl des PCR-Produktes / 1 ml
Hybridisierungslösung) wurde mit Wasser auf ein Volumen von 50 µl aufgefüllt und durch
10minütiges Aufkochen und anschließendem Abkühlen auf Eis denaturiert. Nach dem Entfernen der
Prähybridisierungslösung wurden 5 ml Hybridisierungslösung zusammen mit der denaturierten Sonde
im Plastikbeutel luftblasenfrei verschweißt und über Nacht bei 65°C inkubiert.
2.5.4.6 Detektion
Nach der Hybridisierung wurde die nicht gebundene DIG-markierte Sonde durch mehrmaliges
Waschen entfernt. Die Membran wurde zweimal mit je 200 ml 2x SSC mit 0,1% SDS für jeweils 5
min bei RT unter leichtem Schütteln gewaschen. Der Waschschritt wurde zweimal mit 0,5x SSC mit
0,1% SDS für jeweils 15 min bei 65°C wiederholt. Die Membran wurde für 1 min in 15 ml Puffer 1
[100mM Maleinsäure, 150 mM NaCl pH 7,5] mit 0,3% (v/v) Tween 20 äquilibriert. Unspezifische
Antikörperbindungen wurden durch Inkubation für 30 min in 15 ml 1xBlockierungslösung [1% (w/v)
Blocking-Reagent in Puffer 1] verhindert. 20 ml Blockierungslösung wurden mit 1 µl Antikörper (0,75
U) versetzt und für 30 min bei RT inkubiert. Die Membran wurde für 2 x 15 min in 100 ml Puffer 1
mit 0,3 % (v/v) Tween 20 bei RT gewaschen und für 5 min in 20 ml Puffer 3 [100 mM Tris/HCl, 100
mM NaCl, pH 9,5] inkubiert. Nach dem Abgießen des Puffers wurden 2 ml der Färbe-/Substratlösung
(BCIP/NBT) direkt auf die Membran pipettiert und anschließend die Petrischale dunkel gehalten und
nicht bewegt. Nach ungefähr 1 h war die Färbereaktion abgeschlossen.
2.5.4.7 Dot-Blots auf ungeladener Nylon-Membran
Die Dot-Blots wurden nach Maßgabe des Current Protocol in Molecular Biology erstellt (2.9.18.
Preparation and Analysis of DNA, Alternate Protocol, Manual Preparation of a DNA Dot Blot). Ein
Streifen einer ungeladenen Nylonmembran (QIABRANE, Nylon membrane, uncharged, QIAGEN)
wurde auf die gewünschte Größe zugeschnitten (ca. 1cm x 2,5cm). Mit einer umgekehrten
Kristallspitze (10µl) wurde durch festes Aufdrücken eine Markierung auf der Membran aufgebracht.
Die Membran wurde in Wasser angefeuchtet und für 10 min in 6x SSC untergetaucht.
2. Material und Methoden 33
Zu jeder DNA-Probe wurde ½ Volumen 20x SSC auf eine Endkonzentration von 6x SSC zugefügt.
Die DNA wurde bei 98°C für 10 min denaturiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Die Membran
wurde bei Raumtemperatur angetrocknet, bis sie nur noch leicht angefeuchtet war. Jede Probe wurde
in einer Tischzentrifuge für 5 sec abzentrifugiert, die Probe in Aliquots von 1-1,5 µl auf die Membran
aufgebracht und durch eine beheizbare Unterlage getrocknet (ca. 50°C) (MR 2002, Heidolph). Durch
mehrmaliges Auftragen nach Trocknung der einzelnen Aliquots wurde die gewünschte DNA-Menge
(2 µg, RsaI hydrolysiert ) auf der Membran fixiert. Hierbei wurden insgesamt nicht mehr als 10 µl
aufgetragen. Die abschließende Trocknung der Membran geschah bei Raumtemperatur. Es folgte die
Denaturierung, Neutralisation und Immobilisierung der DNA. Die Membran wurde für 10 min auf
einem Stück Whatman 3MM Papier, das mit Denaturierungslösung [1,5 M NaCl / 0,5 M NaOH]
getränkt war, platziert und anschließend für 5 min auf ein Stück Whatman 3MM-Papier, getränkt mit
Neutralisationslösung [1M NaCl / 0,5 M Tris-HCl / pH 7.0], übertragen. Die Membran wurde auf ein
Stück trockenes Whatman 3MM-Papier gelegt und über mehrere Stunden getrocknet. Es folgte die
UV-Fixierung der trockenen Membran bei 256 nm für 23 sec. (160 Joule/m2) (UV-Lampe VL-6.MC,
VILBER LOURMAT). Bis zum Gebrauch wurde die Membran zwischen zwei Lagen Whatman 3MM
Papier bei RT gelagert. Die Sondenhybridisierung erfolgte wie für den Southern-Blot beschrieben. Die
Hybridisierung wurde für jede Sonde in einem 1,5 ml Cap durchgeführt, in dem die Nylon-Membran
platziert wurde.
2.5.5 DNA-Sequenzierung und Erstellen stammspezifischer PCR-Systeme
(1 – DNA-Sequenzierung von klonierten Fragmenten) Der Einsatz der DNA in die
Sequenzierreaktion erfolgte direkt aus der beschriebenen Plasmid-Präparation ohne weitere
Aufreinigung. Die Sequenzierung der Inserts wurde mit dem BigDye Terminators v1.1 Cycle
Sequencing Kit von Applied Biosystems System nach Angaben des Herstellers durchgeführt (s.
Abschnitt DNA-Sequenzierung). Als Sequenzierprimer wurden M13 F 5`- GCC AGG GTT TTC
CCA GTC ACG A –3´und M13 Rev 5`- GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG –3´ genutzt.
(2 – Sequenzanalyse und Erstellen von fragmentabhängigen Primerpaaren) Das Alignment der
Forward und Reverse-Sequenzen wurde unter Verwendung des Programms BioEdit10 5.0.9, © 1997-
2001, von Tom Hall (1999) durchgeführt. Da methodenbedingt keine Aussage über den Plus/Minus-
Strang der Sequenz gemacht werden kann, wurden die Sequenzen der Forward-Sequenzierung als
Plus-Strang angegeben. Die ermittelten Sequenzen wurde über NCBI BLASTN11 2.2.3 (Altschul et al.
1997) mit den vorgegebenen Standardeinstellungen mit den Datenbankbeständen abgeglichen.
10 BioEdit 5.0.9, © 1997-2001, von Tom Hall, http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html 11 NCBI BLASTN , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
34 2. Material und Methoden
Stammspezifische Primerpaare wurden über den Oligo Explorer12 1.1.0 (© 2001-2002) von Teemu
Kuulasmaa erstellt.
(3 - stammspezifische PCR-Systeme) Die ermittelten Primer wurden in Konzentrationen von 0,4 µM
je Primer eingesetzt (0,2 U Taq-Pol, 0,4 µM P1, 0,4 µM P2, 100 µM dNTP, 1x PCR-Puffer (1,5 mM
Mg2+, ad 20 µl RV). Die Annealingtemperatur wurde für den Einsatz in einer Multiplex-PCR über
einen Gradienten getestet. In den stammspezifischen PCR-Systemen für die Lactococcus-Stämme
1526 und 1760 fanden die folgenden Primerpaare mit der Annealingtemperatur von 56°C
Verwendung:
Spezifisch für Stamm 1760: A2-17-15F: 5´- CCG GCT TGT TCT AAC TTT CC -3´ (20 nt), A2-17-
15R: 5´- CAA CCC CTG TTA TCT ATT GGA C -3´ (22 nt), (322 bp) und A5-17-15F: 5´- TGA GGT
ATT GTG GCA ACT GTT C -3´ (22 nt), A5-17-15R: 5´- GCC AAT GAA AGA CGG AAA AC -3´
(20 nt), (89 bp) sowie spezifisch für Stamm 1526: A22-15-17F: 5´- GGG TGC TTG ACC TTA CCA
G -3´ (19 nt), A22-15-17R: 5´- GGG AGC AAA AGA CGA TTA CC -3´ (20), (166 bp) und A23-15-
17F: 5´- CGC TTG AGC TCA TTA GTT CTT G -3´ (22 nt), A23-15-17R: 5´- GGG ACG GTG ATA
TTG ATT GG -3´ (20 nt), (271 bp).
In Multiplex-PCRs wurden die Primer entsprechend der Länge ihres PCR-Produktes im Verhältnis 2
zu 1 (kurz zu lang) mit einer maximalen Konzentration von 0,4 µM je Primer eingesetzt.
2.5.6 Sequenzierung von Fragmenten aus Agarosegelen ohne Klonierung
(1 – Isolierung, Amplifikation und Aufreinigung des Fragmentes aus einem Agarosegel) Die
Auftrennung des Hybridisierungsmusters der Nested-PCR erfolgte auf einem 1,5%igen Agarosegel.
Die Elektrophoreseanlage war durch mehrmaliges Spülen mit MilliQ-Wasser von Nukleinsäuren
weitestgehend befreit worden. Nach Ethidiumbromidfärbung und Visualisierung unter UV-Licht
wurde mit einer Kristallspitze eine Probe aus der zu analysierenden Bande entnommen und diente als
Template in einer folgenden Amplifikation. Als Primer wurden die Oligonukleotide NP1 und NP2
eingesetzt (2,5 U Taq-Pol, 0,4 µM NP1, 0,4 µM NP2, 100 µM dNTP, 1x PCR-Puffer (1,5 mM Mg2+),
200 µl RV, aufgeteilt auf 4 getrennte Reaktionsvolumina) und das folgende PCR-Programm
durchgeführt: (1) 94°C – 2 min, (2) 30X: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min 30 sec, (3) 72°C
– 5 min, (4) 4°C – ∞. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt und die
Banden aus dem Gel eluiert (DNA Extraction Kit, Fermentas).
(2 – Sequenzierung des PCR-Produktes) Zur Sequenzierung des PCR-Produktes wurde das BigDye
Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kit von Applied Biosystems unter Verwendung der Primer NP1
(forward) und NP2 (reverse) der Nested-PCR genutzt (s. Abschnitt DNA-Sequenzierung). In die
Sequenzierung wurden 5 ng des isolierten Fragmentes als Template eingesetzt. 12 Oligo Analyzer 1.0.2 / Oligo Explorer 1.1.0, © 2000-2002; Teemu Kuulasmaa, M.Sc., University of Kuopio, P.O. Box 1627, 70211 Kuopio, FINLAND, Teemu.Kuulasmaa@uku.fi, http://www.uku.fi/~kuulasma/OligoSoftware
mailto:Teemu.Kuulasmaa@uku.fihttp://www.uku.fi/~kuulasma/OligoSoftware
2. Material und Methoden 35
2.6 Subtraktive Hybridisierung durch Immobilisierung
Die Subtraktionshybridisierung mit Immobilisierung der Subtraktor-DNA wurde mit Modifikationen
nach Wassill et al. (1998) durchgeführt.
(1 – Verwendete Oligonukleotide für die Subtraktionshybridisierung) Die Oligonukleotide, die
zur Präparation der Linker benötigt wurden, wurden von Sigma-ARK bezogen: P1, 5´-AGG GGA
TAA CCA ATT CAC ACA CCA-3´ (24 nt), P2, 5´-P-TAT GGT GTG TGA ATT GGT TAT CCC
CT-3´ (26 nt), S1, 5´-CGC CAG GGA ACA CCC AGT CAC GAC-3´ (24 nt), S2 5´-P-TAG TCG
TGA CTG GGT GTT CCC TGG CG-3´ (26 nt).
(2 – Theoretische Analyse zur Restriktion) Die Analyse der Genome in Hinblick auf potentiell
verwendbare Restriktionsendonukleasen mit einem möglichst großen Erfassungsbereich wurde mit
dem Computerprogramm pDRAW32 1.0 revision 1.1.45 von Kjeld Olesen (s. o.) durchgeführt.
(3 – Restriktionskinetik) Es wurden 50 µg DNA mit 20 U (2µl) MseI (New England Biolabs) nach
Angaben des Herstellers in 125 µl Ansätzen unter zeitgleichem Einsatz von RNase A hydrolysiert
(EK: 80 µg/ml). Zu den Zeitpunkten 5, 10, 15, 30, 60 Minuten sowie über Nacht, wurde ein Aliquot
von 20 µl abgenommen, die Restriktion mit 2 µl 0,5 M EDTA gestoppt, und bis zur weiteren
Verwendung eingefroren. Die Aliquots wurden elektrophoretisch auf einem 1%igen Agarosegel
aufgetrennt, die Fragmente im Größenbereich zwischen 100 und 1000 bp ausgeschnitten und
elektrophoretisch aus dem Gel isoliert (S&S BIOTRAP, Schleicher & Schuell).
(4 – Hybridisierung der Linker für Subtraktor- und Probenstamm) Sechs µg der Oligonukleotide
P1/P2 und S1/S2 (2 µl 200 µM Oligo = ~3 µg) wurden in 40 µl [10 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH
8,0] gemischt, bei 98°C für 2 min denaturiert und von 70 °C auf 20°C abgekühlt, um doppelsträngige
Linker P und S zu bilden. Beide Linker tragen 5’-MseI kompatible Überhänge. Die Hybridisierung der
Oligonukleotide zur Linkerstruktur erfolgte in einem kontinuierlichen Temperaturgradienten durch die
natürliche Abkühlungskurve eines Wasserbades. Alternativ wurde die Hybridisierung in einem
Thermocycler durchgeführt. Hier wurde die Ausgangstemperatur von 70°C für 3 min beibehalten und
alle 5 min um 1°C bis auf 20°C abgesenkt.
(5 – Ligation der Linker an die Genomfragmente) Der Linker P (600 ng) wurde an die MseI
hydrolysierten Fragmente des Proben-Stammes (200 ng) sowie der Linker S an die MseI hydrolysierte
DNA des Subtraktor-Stammes ligiert. Der Ansatz wurde auf 37°C erhitzt und innerhalb von 15 min
auf 16°C abgekühlt, bevor Ligase zugegeben wurde. Die Ligation erfolgte mit 2 U T4 DNA Ligase
(MBI Fermentas) unter Zusatz von 20% (v/v) 50% PEG 4000 im Volumen von 30 µl bei 16°C über
Nacht. Die Inaktivierung der Ligase erfolgte bei 65°C für 15 min. Überschüssige Linker wurden
entfernt (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche).
(6 – Amplifikation der Fragmente) Fünf ng der modifizierten Proben-DNA wurden als Template zur
PCR-Amplifikation mittels des Primer P1 eingesetzt (200 µM dNTP, 2 µM Primer (P1), 5 U Taq-
Polymerase, 1x PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2) 50 µl RV). [(1) 94°C – 2 min, (2) 10x: 94°C – 30 sec,
36