Post on 15-Jan-2020
11
DNR DNR sekoskaita sekoskaita
(sekvenavimas)(sekvenavimas)
J.J.WatsonWatson ir F. ir F. Crick Crick –– DNR struktūros modelisDNR struktūros modelis
1953 m. 1953 m.
�� DNR sekos ir jos funkcijų nustatymas DNR sekos ir jos funkcijų nustatymas ––
vienas svarbiausių molekulin÷s biologijos tikslųvienas svarbiausių molekulin÷s biologijos tikslų
22
Chemin÷s degradacijos (Chemin÷s degradacijos (MaxamMaxam –– GilbertGilbert)) metodasmetodas
DimetylDimetyl sulfate sulfate PiperidinePiperidine formate formate Hydrazine Hydrazine + Hydrazine Hydrazine + NaClNaCl
Chemin÷s degradacijos (Chemin÷s degradacijos (MaxamMaxam –– GilbertGilbert) metodas) metodas
+ + Piperidine Piperidine (90(90 °C°C))
33
Chemin÷s degradacijos (Chemin÷s degradacijos (MaxamMaxam –– GilbertGilbert) metodas) metodas
Chemin÷s degradacijos (Chemin÷s degradacijos (MaxamMaxam –– GilbertGilbert)) metodasmetodas
Metodo trūkumaiMetodo trūkumai
�� Nuskaitoma trumpa sekaNuskaitoma trumpa seka
�� Reakcijos l÷tos ir mažiau Reakcijos l÷tos ir mažiau
patikimospatikimos
�� Naudojamos pavojingos Naudojamos pavojingos
chemin÷s medžiagos chemin÷s medžiagos
Grandin÷s terminacijos (Sanger Grandin÷s terminacijos (Sanger DideoxyDideoxy) metodas ) metodas
-- dNTPdNTP irir ddNTPddNTP
44
Grandin÷s terminacijos (Sanger Grandin÷s terminacijos (Sanger DideoxyDideoxy) metodas) metodas
Sekvenavimo reakcijos komponentaiSekvenavimo reakcijos komponentai ::
�� DNRDNR
�� PradmuoPradmuo**
�� DNR DNR polimepolimerrazaz÷÷
�� dNTPdNTP ir ir ddNTPddNTP**
�� buferisbuferis
DNR DNR ciklinis sekvenavimas ciklinis sekvenavimas -- linijinlinijin÷ amplifikacija÷ amplifikacija
55
DNR DNR elektroforez÷s sistemaelektroforez÷s sistema
66
SkSkeenavimonavimo irir detekcijosdetekcijos sistemasistema
SkSkeenavimonavimo irir detekcijosdetekcijos sistemasistema
MomentinisMomentinis DNR fragmentDNR fragmentų detekcijos vaizdasų detekcijos vaizdas
77
DNR sekvenavimo rezultatas DNR sekvenavimo rezultatas -- elektroferogramaelektroferograma
PvzPvz. X . X –– genogeno sekvenavimassekvenavimas
SC sekvenatorius ABI Prism 377SC sekvenatorius ABI Prism 377
�� iki 96 m÷ginių vienu metuiki 96 m÷ginių vienu metu
�� 7070 tūkst. tūkst. bpbp per dienąper dieną
DNR
Elektroforez÷
Detekcija
Analiz÷
88
Kapiliariniai DNR analizatoriaiKapiliariniai DNR analizatoriai
�� 9696––384 m÷ginių analiz÷ vienu metu384 m÷ginių analiz÷ vienu metu
�� iki 2,8 mln bazių porų (iki 2,8 mln bazių porų (bpbp) per dieną) per dieną((19731973--1974 m. 1974 m. nustatytinustatyti 2020 bpbp sekseką reik÷jo 2 metų)ą reik÷jo 2 metų)
Sekvenavimas Sekvenavimas –– rankinis rankinis vsvs. automatinis. automatinis
DNR DNR mikrogardel÷smikrogardel÷s ( DNA ( DNA microarraysmicroarrays / DNA / DNA chipschips ))
�� 2x2 cm stiklelyje 102x2 cm stiklelyje 10--15 15
tūkst. 0,1 mm lašų su tūkst. 0,1 mm lašų su
žinomos sekos DNR žinomos sekos DNR
molekul÷mis (pvz. genais)molekul÷mis (pvz. genais)
�� ant jų dedama tiriamosios ant jų dedama tiriamosios
viengrand÷sviengrand÷s žym÷tos DNRžym÷tos DNR
�� Vyksta Vyksta komplementariųkomplementarių
sekų hibridizacijasekų hibridizacija
�� Kuo sekos labiau atitinka, Kuo sekos labiau atitinka,
tuo stipresnis hibridas ir tuo stipresnis hibridas ir
ryškesn÷ d÷mel÷ryškesn÷ d÷mel÷
�� Emisijos kiekybinis Emisijos kiekybinis
įvertinimas ir rezultatų įvertinimas ir rezultatų
analiz÷ atliekama PC su analiz÷ atliekama PC su
spec. programine įrangaspec. programine įranga
�� Genų raiškos (Genų raiškos (expressionexpression), ),
genomų giminingumų genomų giminingumų
tyrimas ir t.t.tyrimas ir t.t.
99
1010
PGR PGR -- eksponentineksponentin÷ amplifikacija÷ amplifikacija
PPGGR R produktproduktų patikrinimasų patikrinimas
GenGenų inžinerijos pvz.ų inžinerijos pvz.
�� Plazmid÷ (žiedin÷ DNR) izoliuojama iš Plazmid÷ (žiedin÷ DNR) izoliuojama iš bakterijosbakterijos
�� Fermentas (Fermentas (restriktaz÷restriktaz÷) kerpa DNR ) kerpa DNR specifin÷se vietosespecifin÷se vietose
�� Baltymą koduojantis genas iš kitos Baltymą koduojantis genas iš kitos ląstel÷s kerpamas tuo pačiu fermentuląstel÷s kerpamas tuo pačiu fermentu
�� Genas įstatomas į plazmidę, kur šis Genas įstatomas į plazmidę, kur šis tiksliai tinka tiksliai tinka –– tai tai rekombinantin÷rekombinantin÷ DNRDNR
�� Rekombinantin÷Rekombinantin÷ plazmid÷ įterpiama į plazmid÷ įterpiama į bakterijąbakteriją
�� Bakterija dalijasi ir replikuoja Bakterija dalijasi ir replikuoja ––kopijuoja save ir kopijuoja save ir rekombinantinęrekombinantinę DNRDNR
�� Naujasis genas nurodo bakterijai Naujasis genas nurodo bakterijai gaminti naują baltymą (pvz. gaminti naują baltymą (pvz. interferoną)interferoną)